LAG-3 D1结构域的配体结合能力评估促成了小分子抑制剂的发现

《Journal of Molecular Graphics and Modelling》：Ligandability Assessment of the LAG-3 D1 Domain Enables Discovery of a Small-Molecule Inhibitor

　　

Nelson García-Vázquez | Moustafa T. Gabr

放射学系，分子成像创新研究所（MI3），威尔康奈尔医学院，纽约州纽约市10065，美国

摘要

LAG-3是一种新兴的免疫检查点蛋白，其细胞外的D1结构域通过一个广泛的蛋白质-蛋白质相互作用界面与MHC II类结合，这一相互作用传统上被认为难以通过小分子进行调控。为了评估该区域的配体结合能力，我们结合了三次100纳秒分子动力学（MD）模拟、基于结构的虚拟筛选以及生物物理和生化检测方法。对分离出的D1结构域进行MD采样后发现，该结构域靠近MHC II结合表面有一个反复出现的、短暂存在的凹陷。我们使用了一个代表性的口袋开放构象来筛选大约10,240种化合物库，最终获得了一种经过验证的候选配体N05。N05以微摩尔的亲和力与D1结构域结合（微尺度热泳法测得Kd = 59.2 μM，TRIC/MST通道；光谱位移检测法测得Kd = 56.1 μM），并且部分抑制了LAG-3与MHC II的相互作用（EC₅₀ = 42.9 μM；最大抑制率为约76%）。对LAG-3-N05复合物进行的三次30纳秒MD模拟显示，配体稳定地结合在MD识别出的凹陷中，并与形成口袋的残基存在稳定的相互作用。这些结果表明，LAG-3的D1结构域具有一个可访问的、动态形成的结合位点，能够容纳小分子，为未来探索LAG-3的配体结合能力提供了结构和生物物理基础。

引言

免疫检查点的阻断已经改变了多种癌症的治疗方法，主要是通过针对PD-1、PD-L1和CTLA-4的单克隆抗体（mAbs）实现的。然而，仍有相当部分患者对治疗没有反应或产生了耐药性，而且抗体治疗伴随着较高的成本、需要静脉给药以及与免疫相关的不良事件。这些限制促使人们努力扩展靶向途径的范围，并探索包括小分子、肽和降解剂在内的替代治疗方式，这些方法通过不同于传统抗体阻断的机制来调节免疫检查点。1, 2, 3, 4

淋巴细胞活化基因-3（LAG-3，CD223）是一种在活化的CD4⁺和CD8⁺ T细胞、调节性T细胞以及其他淋巴细胞亚群上表达的抑制性受体，在癌症和自身免疫中起着关键的作用，调控T细胞的耗竭和耐受性。1, 2, 5, 6, 7 LAG-3的细胞外区域包含四个Ig样结构域（D1-D4）；其中D1结构域的特殊之处在于它包含一个富含脯氨酸的环状结构，该结构能够高亲和力地与MHC II类结合。1, 5 最近的结构和功能研究阐明了LAG-3如何与MHC II以及其他配体（如纤维蛋白原样蛋白-1（FGL1）结合：LAG-3通过与CD4竞争MHC II的结合位点来抑制T细胞的活化，改变免疫突触的几何结构，并通过其细胞质尾部传递抑制信号。5, 6, 7, 8, 9 临床研究表明，针对LAG-3的mAbs和双特异性抗体与PD-1阻断联合使用在多种肿瘤类型中显示出令人鼓舞的效果，强调了这一途径的治疗相关性。2, 3

现在已经获得了人LAG-3外域、LAG-3与MHC II复合物以及LAG-3与治疗性抗体结合的高分辨率结构信息。5, 6, 7 这些研究表明，D1结构域直接与MHC II的一个保守的、靠近膜表面的区域接触，该区域跨越α2和β2亚域；LAG-3的二聚化限制了MHC II在细胞表面的间距。5, 7 与D1中的柔性环状结构域结合的拮抗抗体可以同时阻断MHC II和FGL1的结合，从而有效缓解LAG-3介导的抑制作用。5, 9 总而言之，这些数据强烈表明D1区域，特别是与MHC II结合的表面，是一个具有治疗干预功能的理想位点。

尽管取得了这些进展，但小分子对LAG-3的配体结合能力仍知之甚少。大多数临床上先进的LAG-3抑制剂都是抗体或基于蛋白质的制剂，2, 3 而小分子类免疫检查点抑制剂的研究主要集中在PD-1/PD-L1上，通过基于结构的设计、DNA编码的化合物库和药效团方法可以破坏受体-配体相互作用并恢复T细胞的活性。4, 12, 13, 14 即使在这些系统中，早期发现的候选配体也往往表现出微摩尔的亲和力，但这为药物的可行性和优化提供了关键证据。12, 13, 14 对于LAG-3来说，现有的晶体和冷冻电镜结构显示D1与MHC II之间的相互作用界面较为扩展且暴露于溶剂中，静态视图下几乎没有明显的结合口袋，5, 6, 7 这导致了人们认为该表面对于传统的小分子结合具有挑战性的看法。

在过去十年中，分子动力学（MD）模拟已成为揭示“隐蔽”或短暂结合位点的强大方法，这些位点在静态结构中并不明显，但在蛋白质探索其构象变化时才会显现出来。15, 16, 17, 18 MD和增强采样技术（有时结合混合溶剂或片段探针）在多种先前被认为不可药用的大靶标中发现了可药物的隐蔽位点，其中一些位点已经通过片段筛选和晶体学得到了验证。15, 17, 18 最近的人工智能驱动工具（如PocketMiner）进一步表明，隐蔽位点可能在整个人类蛋白质组中普遍存在，大大扩展了潜在的可配体蛋白质的范围。16 这些概念上的进展表明，LAG-3的D1结构域可能会暂时形成与MHC II结合表面相邻或重叠的口袋，这些口袋可以通过适当设计的小分子来利用。

在这里，我们利用综合的计算-生物物理工作流程来探究LAG-3的D1结构域是否含有可以被小分子作用的配体结合位点。在LAG-3 D1区域的MD模拟指导下，我们在MHC II结合表面附近识别出一个短暂存在的口袋，并对该位点进行了基于结构的虚拟筛选，筛选了一个包含约10,000种化合物的库。排名靠前的候选化合物在生化/生物物理检测中进行了评估，最终发现了一种具有微摩尔亲和力的配体，该配体能够在体外部分抑制LAG-3的功能。随后的MD模拟用于探究配体-口袋相互作用的稳定性，并随时间绘制关键残基的接触情况。这项工作的目的并非开发一个完全优化的抑制剂，而是（i）评估LAG-3 D1的小分子配体结合能力，（ii）展示如何将MD预测的口袋与虚拟筛选结合用于处理具有挑战性的免疫检查点靶标，（iii）为未来的药物化学和机制研究提供一个初步的结构框架和可行的候选化合物系列。

部分摘要

用于MD的蛋白质制备

分子动力学模拟的结构模型来源于PDB 7TZG，其中包含了人LAG-3的D1-D2外域与单链抗体变体片段复合物。5 仅保留了LAG-3多肽，并将构建体截断为仅包含D1结构域，因为该区域负责高亲和力的MHC II结合，也是识别隐蔽口袋的主要关注区域。在无序环中缺失的残基（残基73–119）是通过……

MD分析揭示了LAG-3 D1结构域中的短暂隐蔽口袋

为了评估LAG-3的D1结构域是否具有支持小分子结合的隐蔽结构特征，我们使用独立的速度种子进行了三次100纳秒的全原子MD模拟（完整的实验方案详见方法部分）。

图1A-C展示了D1结构域及其MD识别出的凹陷的视觉概览。

在apo状态下进行模拟的过程中，我们观察到D1表面有一个浅而清晰定义的凹陷会反复打开……

讨论

小分子对免疫检查点受体的调控仍然是一个研究不足但战略上重要的目标。与PD-1或CTLA-4不同，尽管已经有大量研究发现了可作用的口袋并开发出了早期的小分子拮抗剂，但LAG-3的相关研究几乎完全集中在单克隆抗体和蛋白质工程方法上。2, 3, 4 这一研究重点的结构基础是显而易见的：D1结构域通过一个扩展的、相对平坦的表面与MHC II类结合

CRediT作者贡献声明

Moustafa T. Gabr：概念构思、资金获取、监督、写作——审阅与编辑。Nelson García-Vázquez：概念构思、形式分析、实验设计、方法论、写作——原始草稿、可视化

利益冲突声明

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。