针对膀胱癌AQP1受体的中药天然产物抑制剂的虚拟筛选

《Cancer Reports》：Virtual Screening of Traditional Chinese Medicine Natural Product Inhibitors Targeting AQP1 for Bladder Cancer

　　**摘要**

**背景**

膀胱癌（BCa）是最常见且最具代表性的成人泌尿系统尿路上皮癌类型，其发病率和死亡率都很高。这种疾病已成为威胁公共健康的主要疾病，因此迫切需要开发包括传统中药、免疫疗法和基因诊断在内的综合治疗策略。水通道蛋白——水通道蛋白1（AQP1）负责细胞膜间的水分转运。最近的研究表明，水通道蛋白参与了恶性肿瘤的发展和进展。特别是，AQP1在膀胱癌的发病机制中起着重要作用，可能成为新型药物开发的潜在靶点。天然产物由于其结构多样性，成为药物发现中有价值的先导化合物库。

**方法与结果**

在本研究中，我们采用了分子对接和分子动力学模拟方法，对包含2000种传统中药天然产物的库进行了筛选，以检测它们对目标蛋白AQP1的潜在活性。最终分析结果显示，有17种化合物对AQP1的活性位点具有高结合亲和力，表明它们可能是潜在的抑制剂。其中，化合物8（Clematignoside）、10（Ginsenoside Rb2）和15（单宁酸）在分子动力学模拟中表现出特别强的结合亲和力和复合物稳定性。

**结论**

这些发现为合理设计针对AQP1的药效团奠定了宝贵基础，并为未来开发治疗膀胱癌的临床药物提供了有前景的候选化合物。排名靠前的化合物，尤其是化合物10和15，需要进一步进行实验研究。

**1 引言**

膀胱癌（BCa）是泌尿外科手术中最常见的恶性肿瘤，预后较差[1]。BCa通常分为肌层浸润性和非肌层浸润性两类[2]。根据相关报道，非肌层浸润性膀胱癌的五年生存率约为50%，而肌层浸润性膀胱癌的五年生存率更低，高风险患者的五年生存率仅为25%–35%[3]。尽管近年来在早期筛查和检测方面取得了显著进展，但由于肿瘤快速转移到其他器官，预后仍然不佳。BCa的初始治疗通常包括术后化疗，标准方案为吉西他滨（GEM）联合顺铂。然而，患者往往会随着时间推移产生对这种化疗方案的耐药性[4]。由于接受化疗患者的平均生存时间仅为14个月[5]，因此迫切需要更有效的治疗药物来改善BCa的治疗效果。水通道蛋白（AQPs）是一类负责水分渗透性的跨膜转运蛋白，具有高选择性和效率。这些蛋白质的分子量约为30 kDa，包含13种已知的亚型，从AQP0到AQP12。AQPs在渗透压调节和维持全身水分平衡中起着关键作用[6]。它们还参与各种生物过程，包括上皮液体转运、细胞迁移和脑水肿[7]。近年来，越来越多的证据表明AQPs可能成为潜在的治疗靶点。AQPs促进的快速跨膜水分转运对肿瘤细胞的转移至关重要[8]。体内水分平衡受到严格调控，水分平衡的紊乱会对肿瘤的发生和发展产生深远影响[9]。水通道蛋白1（AQP1）是一种位于细胞膜上的糖蛋白，主要表达在膀胱黏膜下微血管和动脉的内皮细胞中[10]。它通过促进细胞膜间的水分转运来调节上皮和内皮屏障的通透性[11]。AQP1在所有正常组织的毛细血管内皮中都有表达，在微血管结构中的表达相对较高。这表明AQP1的过表达可能是血管生成的结果，并可能在肿瘤相关水肿的形成和清除中起关键作用[12]。从机制上看，AQP1主要参与调控肿瘤血管通透性、促进血管生成和细胞增殖，并促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。AQP1的异常表达与膀胱癌的发生和复发密切相关[13]，并且在浅表膀胱癌的进展中起重要作用[14]。最近的研究表明，Polyporus umbellatus可以通过调节膀胱组织中的AQP1表达来抑制膀胱癌的发展[15]，而Ganoderma lucidum多糖可以通过调节AQP1和AQP3的表达来抑制T24膀胱癌小鼠的肿瘤生长[16]。因此，AQP1是治疗膀胱尿路上皮癌的有希望的治疗靶点。目前，尚无针对AQP1的药物获得临床批准，这突显了开发新治疗剂和策略的必要性。在大数据时代，药物发现过程中产生的数据并通过公共数据库共享具有重大价值[17]。分子对接是计算机辅助药物设计中的关键工具，用于分析配体与受体的结合模式，并预测与特定靶点的结合亲和力以筛选潜在的先导化合物[18]。近年来，针对癌症治疗计算的和基于结构的药物设计研究有所增加[19]。虽然AQP1之前已被研究作为潜在靶点，但大多数报道的抑制剂都是合成化合物或重新利用的药物。相比之下，天然产物具有独特的结构骨架和多靶点潜力，可能实现新的结合模式和治疗策略[20]。虽然对天然产物库进行分子对接是一种成熟的方法，但其在膀胱癌治疗中针对AQP1的应用仍相对较少，为发现新的药物提供了独特的途径。在这项研究中，我们针对AQP1的活性位点进行分析，并筛选了2000种天然产物库以识别高亲和力化合物。然后通过分子动力学模拟评估了这些潜在的先导化合物的复合物稳定性。与现有的AQP1抑制剂研究相比，本研究专注于基于传统中药的天然产物库，后者提供了更大的结构多样性和潜在的多靶点特性。此外，分子对接、分子动力学模拟和计算机模拟ADMET预测的整合为识别新型AQP1抑制剂提供了全面的计算框架。本研究旨在识别一种新型的、基于天然产物的化合物库，其结构特征不同于现有的合成抑制剂，从而为开发针对膀胱癌的新治疗剂提供了宝贵的基础。

**2 方法**

2.1 受体 Preparation

AQP1目标蛋白的3D结构从PDB数据库（http://www.rcsb.org/）下载。分辨率最高的晶体结构的PDB ID为4NEF（图1A）。该结构代表了目前可用的最高分辨率（2.0 ?）的野生型人类AQP1晶体结构，且不含突变。所选结构不包含影响本研究中使用的活性位点区域的突变；因此，无需进行额外的同源建模。在MOE（Molecular Operating Environment，版本2019.01）中依次进行了水分子的去除、质子化、氢化以及能量最小化处理。预处理后的目标蛋白以PDB格式保存，准备进行分子对接。

2.2 配体 Preparation

我们根据已发表的文献和可用的化学数据库，选择了一个包含2000种化合物的天然产物库。这个库目前无法公开访问。该库被导入MOE中，每一种化合物都经过处理以纠正错误、进行质子化和3D结构生成。最后，处理后的小分子以MDB格式保存，准备进行分子对接。

2.3 活性位点预测

AQP1由四个相同的亚单位组成，选择了第一个亚单位作为研究对象。目标蛋白的晶体结构中没有共结晶的化合物；因此，我们使用预测方法选择了结合位点。使用MOE软件的“Site Finder”选项来预测活性位点。点击“site finder”找到结合位点，然后点击“dummies”建立虚拟原子。选择最大的预测口袋作为对接的活性位点。

2.4 分子对接

分子对接分为两个阶段进行。首先，在MOE中使用“DOCK”模块进行了半柔性对接。选择了处理后的受体和配体文件。对接参数设置如下：力场设置为MMFF94x，放置方法为Triangle Matcher，评分函数为London dG。保留了最高得分的构象。S-score
2.5 相互作用结果分析

根据最低的S-score，我们选择了排名靠前的化合物（包括化合物8和15）在AQP1口袋内的结合模式。通过选择MOE窗口中的“Ligand interaction”获得了配体-蛋白质相互作用。在MOE中使用3D和2D图分析了化合物8和15的相互作用。

2.6 分子动力学模拟

使用DS软件对对接后的复合物进行了分子动力学（MD）模拟。应用了CHARMM力场到每个蛋白质-配体复合体上。选择CHARMM力场是因为它是用于蛋白质-配体模拟的最广泛使用和验证最充分的力场之一，特别是在Discovery Studio环境中。该力场能够平衡蛋白质和小分子之间的相互作用，特别是对于像AQP1这样的膜相关蛋白质。系统在一个明确的TIP3P水模型中溶解，在立方周期性边界盒中，蛋白质与盒子边缘的最小距离为10 ?。添加了对离子以中和系统。在进行分子动力学模拟之前，进行了能量最小化以消除不利的接触并优化系统几何结构。MD模拟协议包括三个步骤：系统在50 ps内加热到310 K，系统平衡100 ps，以及在NPT条件下的100 ns生产阶段。使用标准动力学级联设置作为默认参数，分析了模拟后的RMSD和RMSF值，以评估复合物稳定性和残基灵活性，并使用图形化图表可视化结果。

2.7 计算机模拟ADMET和药物相似性预测

为了评估筛选化合物的潜在药物相似性和药代动力学特性，进行了计算机模拟的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）预测。从传统中药系统药理学数据库和分析平台（TCMSP，https://tcmsp-e.com/）中检索了排名靠前的候选化合物的关键药代动力学参数，包括口服生物利用度（OB）、Caco-2渗透性、血脑屏障（BBB）穿透性、药物相似性（DL）、细胞色素P450 2D6（CYP2D6）抑制和肝毒性。TCMSP是一个广泛认可的数据库，为天然产物提供系统预测的ADMET特性，有助于早期评估其治疗潜力。OB≥30%的化合物被认为具有高口服生物利用度，而OB在10%到30%之间的化合物被认为具有中等生物利用度。应用Lipinski的五条规则（分子量≤500、alogP≤5、氢键供体数量≤5、氢键受体数量≤10）来评估口服给药的药物相似性，使用TCMSP提供的分子特性。

**3 结果**

3.1 活性位点预测

在准备好蛋白质结构后，使用MOE软件预测了活性位点。选择最大的预测口袋作为对接的活性位点。目标蛋白的预测活性位点由以下氨基酸组成：GLU3 ALA8 PHE9 ALA12 VAL56 GLN57 LEU59 GLY60 HIS61 ILE62 SER63 GLY64 ALA65 HIS66 VAL71 CYS75 VAL77 GLY78 CYS79 HIS80 VAL81 SER82 ARG85 TYR89 ILE145 PHE146 ALA147 SER148 TH R149 ASP150 GLU151 ARG152 ARG153 GLY154 GLU155 ASN156 PRO157 GLY158 THR159 PRO160 ALA161 ILE164 TYR219 ASN220 TYR221 PHE224 PRO225 PRO226 LYS228（图1B）。

3.2 分子对接结果

使用MOE软件将制备好的配体库与预测的AQP1活性位点进行了对接。在对接结果中，S值较低表示配体与受体的结合更为牢固，可以作为一种潜在的活性物质。筛选标准是S评分低于-8，最终共有17种化合物被选中，这些化合物列在表1和图2中。接着，使用LibDock工具通过“高质量”对接设置了构象的数量。对接结果通过“LibDockScore”来衡量不同构象与蛋白质受体的结合程度。同样，DS软件的对接结果也展示在表1中。我们将LibDOCK评分高于100的化合物列为具有强亲和力的配体。除了化合物7外，所有化合物都显示出优异的亲和力。

表1. 17种对AQP1具有高亲和力的天然化合物的分子对接评分和分子动力学模拟结果。

3.3 蛋白质-配体相互作用
为了理解结合机制，我们分析了排名靠前的化合物与AQP1活性位点的相互作用。通过分析配体在活性口袋中的非键合相互作用，对不同构象进行了分子对接。MOE软件用于分析蛋白质和化合物的结合模式，并模拟它们结合时的具体空间位置和相互作用关系。这里，我们使用MOE软件分析了化合物8（Clematignoside）和化合物15（Tannic Acid）与活性位点残基的相互作用。化合物8是一种来自中国 McConnellia manshurica根部的三萜皂苷，在亚洲是一种常用的草药，具有抗炎和抗氧化作用[21, 22]。最近的研究表明，化合物15在非小细胞肺癌（NSCLC）中显示出显著的抗血管生成活性[23]。化合物8和化合物15的MOE对接评分分别为-9.9 kcal/mol和-9.2 kcal/mol。从对接结果来看，这两种化合物与口袋中的多个氨基酸残基发生了相互作用，其中化合物8与更多残基发生相互作用（见图3A,B）。

3.4 分子动力学模拟结果
在分子对接领域，没有一种单一的对接策略具有绝对优势。分子对接去除了溶剂分子，因此不能模拟配体-受体相互作用的真实环境。为了评估配体-受体复合物在溶剂化、动态环境中的稳定性，我们进行了100 ns的分子动力学（MD）模拟。计算了蛋白质主链和配体相对于初始对接姿态的均方根偏差（RMSD），作为系统稳定性的指标。较低的RMSD值表明复合物更稳定。MD研究越来越多地被用于研究蛋白质-配体相互作用[24]。所有配体-受体复合物的平均RMSD值也在表1中展示。结果显示，化合物10（Ginsenoside Rb2）和化合物15的复合物非常稳定。相比之下，虽然化合物1和8在对接中显示出显著的亲和力，但它们的复合物显示出较高的RMSD波动，表明稳定性较低。为了进一步评估AQP1-配体复合物中残基的灵活性，计算了受体蛋白中每个氨基酸的均方根波动（RMSF），并对代表性化合物（化合物8、10和15）进行了RMSF分析。RMSF值表示分子动力学模拟过程中氨基酸运动的自由度。如图S1所示，大多数残基的波动值相对较低（通常低于1.0 ?），表明复合物在模拟过程中的整体结构稳定性。波动较大的主要发生在环状区域，这与它们的内在灵活性一致。重要的是，预测结合口袋内的残基在所有三个复合物中都相对稳定，这支持了对接结果的可靠性。每个复合物中每个氨基酸残基的RMSF值在表S1中展示。

3.5 体内ADMET和药物相似性预测
使用传统中药系统药理学（TCMSP）数据库对排名靠前的化合物进行了体内ADMET分析（表2）。分析显示，这些化合物之间的特征各不相同。亲和力最高的化合物8和10的预测口服生物利用度（OB）分别为7.57%和6.02%。它们分别违反了Lipinski五法则中的三项和两项，主要是由于它们的高分子量、高计算脂溶性（ALogP）以及过多的氢键供体/受体。相比之下，化合物2（Tristearin）和化合物5（β-Sitosteryl stearate）显示出有利的预测口服生物利用度，但也都因为类似的物理化学挑战而违反了Lipinski五法则中的两项。化合物15的预测OB相对较低，同样违反了两项规则。因此，虽然这些分子目前不适合作为直接的药物候选物，但它们可以作为未来结构优化的有价值药效团模型。这一关键发现强调了我们研究的一个关键意义：这些被识别的化合物主要作为高亲和力的分子探针和药效团模板，用于指导未来的理性药物设计，而不是作为可以直接开发的候选物。

4. 讨论
一种新药物从研发到上市需要大量的努力和资金。计算机辅助药物设计（CADD）是一种重要的方法，可以减少药物开发的成本和时间，特别是对于小分子和蛋白质药物[25-27]。分子对接常用于预测小分子与其靶标的结合姿势及其亲和力[28]。本研究采用了一种综合计算方法，结合了分子对接、分子动力学模拟和体内ADMET预测，以鉴定用于膀胱癌治疗的AQP1天然产物抑制剂。我们成功筛选了一个包含2000种天然化合物的库，并识别出17种对AQP1具有高结合亲和力的化合物。其中，化合物8（Clematignoside）、10（Ginsenoside Rb2）和15（Tannic Acid）基于其稳健的对接评分和稳定性特征而成为特别有前景的候选物。AQPs是一类高度选择性的跨膜蛋白质，主要负责促进水分子在细胞膜中的运输[29]。越来越多的证据表明，AQPs在癌症的转移和进展中起着关键作用。在包括膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、肝癌、宫颈癌、卵巢癌、皮肤癌和结直肠癌在内的多种肿瘤类型中，都观察到了AQPs的上调[30]。临床上，AQPs作为生物标志物和治疗靶点具有重大潜力。特别是AQP1通过促进水分子在细胞膜中的移动，调节上皮和内皮屏障的通透性，在癌症生物学中的作用日益受到重视[12, 31]。在膀胱癌中，AQP1的过表达与肿瘤阶段、血管生成和转移有关[13, 32, 33]。我们的研究进一步证实了AQP1抑制的治疗潜力。AQP1在膀胱癌中的机制作用涉及增强血管通透性和促进肿瘤细胞迁移[12, 31]。一项研究报告指出，AQP1在膀胱癌、胰腺癌和乳腺癌中促进间质液压力和血管高通透性[12]。此外，AQP1还参与形成肿瘤相关的渗出物或水肿，从而刺激血管生成[12]。Pan的研究表明，AQP1的上调会加剧膀胱癌的发展和进展。通过抑制AQP1，可以破坏这些促肿瘤过程。例如，研究表明沉默AQP1可以抑制肿瘤生长和血管生成[33]，并且将AQP1抑制与化疗（如丝裂霉素C）结合使用可以克服耐药性[34]。Liu的研究发现，AQP1的表达反映了膀胱癌的肿瘤级别和进展，表明其作为特定诊断和治疗干预目标的潜力[35]。直接或间接靶向AQP1可能为膀胱癌的治疗提供一种有效的策略。我们的发现与此策略一致，提供了实现AQP1抑制的具体天然产物候选物。详细的相互作用分析表明，这些化合物（化合物8、10和15）与AQP1通道中的关键残基结合，可能阻碍其水转运功能。RMSF分析进一步确认了结合口袋内的残基相对稳定，支持了预测结合模式的稳健性。尽管分子对接成功识别出几种对AQP1具有高预测亲和力的天然产物，但随后的体内ADMET分析提供了必要的现实检验。包括Clematignoside和Ginsenoside Rb2在内的顶级化合物是三萜皂苷类，这类化合物因具有强大的靶标结合能力而受到重视，但由于高分子量和脂溶性过高，常常导致药代动力学不佳，从而违反药物相似性规则。这是基于天然产物的药物发现中的一个常见挑战。因此，我们的工作提供了一个明确的路线图：应提取这些皂苷与AQP1的保守核心结构和相互作用模式（见图3），以设计和合成简化、类药的类似物，同时减少分子量和脂溶性。像Tannic Acid这样的化合物虽然也违反了规则，但可能具有有利的支架特性，可以作为体外验证AQP1抑制的工具化合物。我们工作的创新之处在于系统地对抗AQP1的天然产物库进行了虚拟筛选，而AQP1目前尚无临床批准的抑制剂。与已知的合成AQP1抑制剂相比，我们鉴定的天然产物具有独特的结构复杂性和多靶点效应潜力，这对于管理复杂疾病（如癌症）可能具有优势。此外，尽管分子对接和MD模拟提供了强有力的理论支持，但我们承认缺乏体外或体内的实验验证是本研究的局限。此外，由于计算资源限制，MD模拟仅为每个复合物进行了单次100 ns的运行。在未来的研究中进行重复模拟将进一步提高结果的稳健性和可重复性。我们发现的转化相关性取决于未来的生物学实验来确认AQP1的抑制作用和抗癌效果。然而，包括MD稳定性评估和初步药物相似性评估在内的综合计算工作流程，增强了我们结果的可靠性，并为后续的实验工作提供了合理的优先级。通过采用组合计算方法，我们发现了17种对AQP1具有高结合亲和力的天然化合物，其中化合物10（人参皂苷Rb2）和化合物15（单宁酸）在分子动力学模拟中表现出特别稳定的相互作用。这些化合物为开发针对膀胱癌的新AQP1靶向疗法提供了有希望的起点。尽管本研究奠定了坚实的计算基础，但进一步的实验验证仍然是必不可少的。未来的研究将重点对这些候选化合物进行实验验证，包括体外和体内实验，并根据确定的药效团特征进行结构优化，以提高药物的相似性和治疗潜力。此外，基于这些化合物骨架的结构-活性关系（SAR）研究，特别是化合物8（Clematignoside）和化合物15（单宁酸）的研究，将有助于优化药物的类似性质和药代动力学特性。将AQP1抑制与现有的化疗方案相结合也值得研究，作为一种潜在策略来克服药物耐药性。这些发现为未来的药物筛选、药效团建模和实验研究提供了宝贵的基础，最终有助于扩大针对这种棘手疾病的潜在治疗手段。

作者贡献：
刘迪：参与研究、撰写初稿、数据整理、资金筹集。
张青玉：参与研究、撰写、审稿和编辑。所有作者都已阅读并批准了本稿的最终版本。

致谢：
本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82271835）和黔东南州人民医院的机构研究项目（项目编号：202301）的支持。

资金支持：
本工作得到了中国国家自然科学基金（项目编号：82271835）和黔东南州人民医院的机构研究项目（项目编号：202301）的支持。

利益冲突声明：
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明：
支持本研究结果的数据可在合理请求下向通讯作者获取。