一种新型、更稳定的金属结合肽（MESD衍生肽）的计算机辅助设计，旨在靶向LRP6的第二个功能域

《Journal of Molecular Liquids》：In silico design of a novel more stable metal binding MESD-derived peptide for targeting the second functional domains of LRP6

　　纳杰梅·德赫甘巴纳达基（Najme Dehghanbanadaki）| 马吉德·塔格迪尔（Majid Taghdir）| 哈尼耶·萨巴吉安（Hanieh Sabaghian）| 赫赛因·纳德里·马内什（Hossein Naderi Manesh）
生物物理学系，生物科学学院，塔比亚特莫达雷斯大学（Tarbiat Modares University），邮政信箱：14115-154，德黑兰，伊朗

**摘要**
Wnt/β-连环蛋白信号通路是进化上高度保守的生物途径之一，在胚胎发育、组织稳态和癌症发生中发挥着关键作用。LRP6是一种含有两个大型功能域（E1E2和E3E4）的共受体，它与Frizzled受体共同识别Wnt配体，这使得LRP6成为癌症治疗的有希望的目标。LRP6还依赖于一种名为MESD的伴侣蛋白，该蛋白已被证实能够竞争性地抑制Wnt分子，其抑制活性主要来源于其羧基端的伴侣结构域。这个羧基端结构由两个通过短环连接的螺旋组成，类似于钙调蛋白（calmodulin）的EF-hand结构域，但与全长MESD相比，其抑制效果较弱。基于MESD羧基端结构域与EF-hand结构域的相似性以及其螺旋-loop-螺旋（HLH）结构稳定性，我们通过分子建模、分子对接和全原子分子动力学模拟设计了一种融合肽。这种融合肽不仅更稳定，具有更多的分子内氢键和螺旋结构，同时还表现出与全长MESD相似的Wnt抑制能力。MM/PBSA分析、自由能地形图以及主成分分析（PCA）和相关性分析结果表明，这种融合肽在抑制与E3E4-LRP6功能域结合的Wnt蛋白方面具有更强的潜力。本研究为设计具有稳定结构的新型含金属肽奠定了基础，这些肽针对Wnt/β-连环蛋白等关键信号通路，具有理想的抑制效果和稳定性。

**引言**
Wnt/β-连环蛋白信号通路在脊椎动物中至关重要，参与胚胎发育、器官形成及成体组织稳态的多项生理过程[1]。该通路与机械信号协同作用，调控干细胞更新、增殖和分化[2]。由于这种关键作用，该通路受到严格调控；异常激活或抑制该通路会导致从胚胎缺陷到成人非癌性和恶性肿瘤等多种疾病[3]。该通路包含四个层次的结构成分：细胞外信号、膜组分、细胞质组分和核组分[4]。Wnt分子是一种脂质修饰的蛋白质，具有独特的“手状”结构及保守的二硫键网络，是细胞外信号的主要传递者。Frizzled（FZ）和LRP5/6（低密度脂蛋白受体相关蛋白5/6）分别是Wnt的受体和共受体，在通路中起核心作用，它们通过与Wnt形成三元复合体来启动和激活信号传导[5]；阻断这一复合体的形成可作为治疗策略[6][7][8]。一旦Wnt-FZ-LRP6三元复合体形成，受体的细胞质尾部发生构象变化，同时细胞质中的β-连环蛋白（β-catenin）、DVL、糖原合酶激酶-3β（GSK-3β）、AXIN和酪蛋白激酶I（CK1）等因子参与其中，促使β-连环蛋白稳定并转运至细胞核，从而增强c-MYC和cyclin D1等基因的表达，这些基因与细胞增殖和分化相关[5]。Wnt/β-连环蛋白信号通路的失调已在结肠癌、胃癌、前列腺癌和乳腺癌中得到广泛研究[9]。例如，在大约80%的结直肠腺瘤中可发现负调控因子APC的失活突变，这是结肠癌进展的早期突变之一[6]；而在肝细胞癌中，CTNNB1的激活突变占Wnt/β-连环蛋白通路相关基因变化的28%-40%[10]。除了激活和失活突变外，该通路关键膜受体的过度表达也是常见现象。例如，在一种恶性程度高、预后较差且缺乏雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）表达的三阴性乳腺癌亚型中，LRP6这种关键共受体会过度表达，这为该亚型的治疗提供了新靶点[11][12]。

LRP6是一种含有1600个氨基酸的跨膜蛋白，具有两个大型细胞外功能域E1E2和E3E4[13]，每个功能域均由多个YWTD（Tyr-Trp-Thr-Asp）类型的β螺旋重复序列（BP）和类似表皮生长因子（EGF）的结构域组成[14]。这些功能域能与Wnt蛋白及其天然抑制剂结合[14][15]，如SOST（针对Wnt1、Wnt2、Wnt2b和Wnt9b），或DKK1（针对Wnt3和Wnt3a）。LRP6的β螺旋重复序列（BP）正确折叠需要MESD这种内质网（ER）伴侣蛋白的帮助；有趣的是，重组MESD蛋白能结合细胞表面的成熟LRP5和LRP6，作为多种Wnt蛋白的通用抑制剂，从而抑制Wnt/β-连环蛋白信号通路[9][17][18][19]。研究显示，MESD的C端区域负责与LRP6结合，若该区域被切割，则失去抑制作用[20][21]。林等人基于此设计了一种源自MESD C端的肽，能够模拟全长MESD的功能[23]，尽管在Hs578T三阴性乳腺癌细胞系和PC3前列腺癌细胞系中表现出一定抑制效果，但效果低于全长MESD[24]，可能是因为其稳定性较低[21]。此外，由于LRP6对不同Wnt家族成员的配体结合特性存在差异[25][26]，目前尚未研究完整MESD及其衍生肽对E1E2和E3E4功能域的抑制能力和结合亲和力。同时，关于这种衍生肽与LRP6的相互作用及其引发的结构动力学变化（与全长MESD相比效果更好）的详细信息也尚未深入探讨。

**研究方法**
受MESD C端结构与钙调蛋白EF-hand结构域相似性的启发，并考虑到含有金属离子的蛋白质具有更高稳定性的生物学事实，我们设计了新型MESD肽。除了验证该肽的稳定性外，还研究了其与全长MESD及衍生肽的结合模式、相互作用及结构动力学变化，发现该肽在E3E4功能域上的抑制潜力更强。

**实验结果**
我们从蛋白质数据 Bank（PDB）中提取了E1E2和E3E4的结晶结构（PDB id：3s94和3s2k）[27]，并使用PROCKHECK进行了立体化学验证（结果详见补充表格1）。由于PDB文件中部分数据缺失，我们对氨基酸序列进行了补充处理。

**肽的设计、建模与验证**
螺旋-loop-螺旋（HLH）结构是一种常见于转录因子和钙结合蛋白的结构单元[48][49]。MESD蛋白作为LRP6的必需伴侣蛋白，包含两个大螺旋束结构域和一个小型的HLH结构域，后者对LRP6在细胞内的准确定位至关重要。

**结论**
受钙调蛋白EF-hand结构域的启发，本研究旨在设计一种新的钙结合型MESD衍生肽，该肽能通过结合LRP6的E1E2和E3E4功能域来抑制Wnt信号通路。我们通过原子级能量和结构动力学比较，评估了该肽的效果，并参考了先前实验验证的结果。

**作者贡献声明**
纳杰梅·德赫甘巴纳达基（Najme Dehghanbanadaki）：撰写初稿、项目管理、实验设计、数据分析、概念构建；
马吉德·塔格迪尔（Majid Taghdir）：指导工作、修订与编辑；
哈尼耶·萨巴吉安（Hanieh Sabaghian）：撰写与可视化；
赫赛因·纳德里·马内什（Hossein Naderi Manesh）：验证与资源协调。

**伦理声明**
本研究未涉及人类参与者或组织样本，所有数据均来自公开数据库（包括蛋白质数据银行PDB）。因此，无需参与者同意或伦理委员会批准。

**作者声明**
所有作者均符合《Journal of Molecular Liquids》的作者资格要求，并对研究的构思、分析和解释做出了实质性贡献。在修订阶段，伊朗德黑兰塔比亚特莫达雷斯大学生物科学学院生物物理学系的赫赛因·纳德里·马内什教授被列为共同作者，以表彰其在分子动力学模拟解释方面的贡献。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。

**致谢**
感谢伊朗德黑兰基础科学研究所（IPM）提供的计算资源，以及塔比亚特莫达雷斯大学研究委员会对这项研究的资助。