差异蛋白表达揭示养血醒脑颗粒对慢性脑低灌注大鼠模型多靶点效应的分子机制

《Journal of Neurorestoratology》：Differential Protein Expression Reveals the Molecular Mechanisms of Multi-Target Effects of Yangxue Qingnao Granules on Chronic Cerebral Hypoperfusion in Rats

　　

摘要 背景：慢性脑低灌注（Chronic Cerebral Hypoperfusion, CCH）会导致认知功能障碍。养血醒脑颗粒（Yangxue Qingnao Granules, YXQNG）具有养血功效。研究人员探讨了其在大鼠CCH模型中对认知障碍的影响及机制。 方法：采用双侧颈总动脉闭塞（Bilateral Common Carotid Artery Occlusion, BCCAO）建立大鼠CCH模型。YXQNG通过灌胃每日给药，持续42天。采用激光散斑成像评估脑血流量（Cerebral Blood Flow, CBF）变化。采用莫里斯水迷宫（Morris Water Maze Test, MWMT）和旷场实验（Open Field Test, OFT）评估认知功能及运动和探索能力。采用苏木精-伊红（Hematoxylin and Eosin, HE）染色评估神经元损伤。通过对大脑皮层和海马进行蛋白质组学分析，研究差异表达蛋白（Differentially Expressed Proteins, DEPs）。 结果：在YXQNG中鉴定出五种化合物：芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、洋川芎内酯I和迷迭香酸。YXQNG可增加CBF，改善空间记忆和运动/探索能力，并减轻皮层和海马神经元损伤。蛋白质组学分析发现，在CCH模型中，有100个皮层和162个海马DEPs受到YXQNG调节。GO（Gene Ontology）和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析表明，YXQNG可能改善突触可塑性并调节脂质代谢。蛋白质-蛋白质相互作用（Protein-Protein Interaction, PPI）分析发现海马中Mrps16、Dmgdh、Xylb和Rgn之间存在紧密连接，表明YXQNG可能减轻神经元损伤并增强突触可塑性。 结论：YXQNG治疗可减轻CCH后大鼠皮层和海马的神经元损伤，并改善认知障碍。这些效应是通过改善突触可塑性和调节脂质代谢介导的。

研究背景与目的

慢性脑低灌注是一种脑部长期供血不足的状态，常见于老年人及高血压、糖尿病、动脉粥样硬化等慢性病患者。CCH是血管性认知障碍（Vascular Cognitive Impairment, VCI）发生和发展的重要病理生理基础，可进展为血管性痴呆（Vascular Dementia, VaD）。随着全球老龄化加剧，CCH已成为重要的公共卫生问题。目前尚缺乏针对该病症的特效治疗方法。CCH状态下，脑血流量持续降低导致大脑皮层和海马等重要脑区缺血缺氧性损伤，是引起认知障碍的关键病理基础。然而，CCH后皮层和海马损伤的蛋白质调控机制尚不明确。养血醒脑颗粒是一种具有活血化瘀、养血平肝、通络等功效的中成药，临床用于治疗头晕、头痛等症状，但其对CCH相关认知功能障碍的作用及机制尚不清晰。因此，本研究旨在利用大鼠CCH模型，探讨YXQNG对认知功能障碍的影响及其潜在机制，以期为CCH治疗提供新策略。本研究论文发表于《Journal of Neurorestoratology》。

主要关键技术方法

研究人员采用9月龄雄性SD（Sprague Dawley）大鼠，通过BCCAO手术建立CCH模型。给药组每日灌胃给予YXQNG，持续42天。研究采用的核心技术方法包括：

1. 1.
   成分分析：采用液相色谱法对YXQNG进行定性成分分析。
2. 2.
   脑血流评估：采用激光散斑对比成像在基线和多个时间点监测CBF变化。
3. 3.
   行为学评估：采用MWMT评估空间学习记忆能力，采用OFT评估运动与探索行为。
4. 4.
   组织病理学分析：通过HE染色观察皮层和海马神经元形态学损伤。
5. 5.
   蛋白质组学与生物信息学分析：取大鼠皮层和海马组织进行蛋白质组学分析。采用液质联用技术进行质谱检测，通过数据库搜索鉴定蛋白质。对获得的DEPs（筛选标准为p值<0.05且倍数变化>1.2）进行GO功能注释、KEGG通路富集分析以及基于STRING数据库的PPI网络分析，以探究其潜在功能与相互作用。

研究结果

3.1. YXQNG成分分析

通过液相色谱分析，在YXQNG中鉴定出五个特征色谱峰，分别对应芍药苷、芍药内酯苷、阿魏酸、洋川芎内酯I和迷迭香酸。这些成分来源于白芍、当归、川芎和夏枯草四味药材。

3.2. 脑血流分析

BCCAO术后，CCH组和YXQNG组大鼠双侧大脑半球CBF立即显著下降。术后10天，YXQNG组左侧半球CBF较术后即刻显著增加，且高于同期CCH组。术后42天，YXQNG组大鼠双侧半球CBF均显著高于CCH组，表明YXQNG能够增加CCH大鼠的脑血流量。

3.3. YXQNG改善CCH大鼠认知障碍

MWMT结果显示，与假手术组相比，CCH组大鼠逃避潜伏期和游泳路径长度显著增加，运动轨迹紊乱。YXQNG治疗显著降低了逃避潜伏期和路径长度。在探索试验中，CCH组穿越平台位置的次数和在目标象限停留时间均减少，而YXQNG治疗组这两项指标均显著增加，表明YXQNG改善了CCH导致的空间学习和记忆障碍。

3.4. YXQNG改善CCH大鼠探索行为障碍

OFT结果显示，与假手术组相比，CCH组大鼠运动总距离、进入中心区次数、在中心区运动距离和停留时间均减少。YXQNG治疗显著增加了线交叉次数、进入中心区次数、在中心区的运动距离和停留时间，表明YXQNG改善了CCH大鼠在新环境中的运动与探索功能。

3.5. YXQNG减轻CCH大鼠海马和皮层神经元损伤

HE染色显示，CCH组皮层和海马神经元数量显著减少，排列紊乱，出现细胞肿胀、核固缩和碎裂。YXQNG治疗组神经元数量增加，排列趋向有序，细胞形态明显改善，表明YXQNG减轻了CCH诱导的神经元损伤。

3.6. 皮层和海马差异表达蛋白分析

蛋白质组学分析发现，与假手术组相比，CCH大鼠皮层有503个DEPs（206个上调，297个下调），海马有689个DEPs（277个上调，412个下调）。经YXQNG干预后，综合比较发现有98个皮层DEPs和162个海马DEPs是CCH诱导且被YXQNG调控的。其中，YXQNG下调了35个CCH上调的皮层蛋白表达，上调了63个CCH下调的皮层蛋白表达；下调了66个CCH上调的海马蛋白表达，上调了96个CCH下调的海马蛋白表达。交集分析发现，YXQNG中的活性成分可能作用于多个靶点，例如表儿茶素下调皮层血管紧张素转换酶（Angiotensin-Converting Enzyme, ACE）表达等。

3.7. DEPs的GO、KEGG富集分析与PPI分析

GO和KEGG富集分析表明，在皮层，YXQNG主要改善了CCH引起的突触功能损伤，并抑制了CCH诱导的胆固醇合成增加。在海马，YXQNG增强了突触可塑性，减轻了内质网应激，促进了甘油三酯水解并抑制了脂肪酸合成，同时减弱了由鞘糖脂合成诱导的神经损伤。综合分析表明，突触可塑性和脂质代谢是YXQNG在皮层和海马调控的关键因素。PPI网络分析在海马中发现了紧密连接的蛋白：Mrps16（上调）、Dmgdh（下调）、Xylb（上调）和Rgn（下调）。

讨论与结论

研究人员在讨论中指出，YXQNG作为一种由十多味中药组成的复方制剂，其多组分特性使其能够发挥协同、整合的多靶点效应。本研究发现YXQNG能够改善CCH大鼠的空间记忆、运动、探索和认知障碍，并减轻皮层和海马的神经元损伤。蛋白质组学分析揭示，能量代谢、线粒体功能和信号转导是YXQNG作用于皮层和海马的关键调控因素。对DEPs的深入分析发现，YXQNG中的活性成分可能通过下调ACE表达以增加CBF，或通过激活α-2A肾上腺素能受体和谷氨酸受体2以减轻钙超载、缓解神经元损伤并增强突触可塑性。GO、KEGG和PPI分析共同支持YXQNG通过改善突触可塑性和调节脂质代谢来发挥神经保护作用。海马PPI网络中关键蛋白的变化提示YXQNG还可能通过抑制氧化应激、缓解神经元损伤来发挥效益。

研究结论

养血醒脑颗粒（YXQNG）作为一种中成药，能够减轻CCH后大鼠皮层和海马组织的神经元损伤，并改善认知障碍。这些效应可能是通过减轻神经元损伤、改善突触可塑性和调节脂质代谢来实现的。