鹿茸多肽通过激活神经感觉PGE2/EP4/p-CREB轴促进成骨以加速骨折愈合

《Journal of Orthopaedic Translation》：Deer antler polypeptides promote osteogenesis for fracture healing via activating neurosensory PGE2/EP4/p-CREB axis

　　

背景：鹿茸多肽是鹿茸中最具生物活性的成分之一，据报道具有多种生物学功能。然而，鹿茸多肽在骨折愈合中的作用尚不清楚。本研究旨在探究鹿茸多肽对骨折愈合的治疗效果并阐明其潜在的药理机制。 方法：采用液相色谱-串联质谱法分析鹿茸多肽的肽组成和血清代谢物。对感觉神经特异性EP4受体敲除 (EP4Avil) 小鼠、感觉神经特异性荧光报告小鼠和骨骼干细胞/祖细胞特异性荧光报告小鼠建立胫骨横向骨折模型，随后以50 mg/kg/天的剂量口服给予鹿茸多肽。在体外，用含有鹿茸多肽的血清孵育原代骨髓细胞，随后用从这些骨髓细胞收集的条件培养基处理背根神经节神经元。在体内和体外模型上，进行了一系列实验方法，包括步态分析、微型计算机断层扫描、三点弯曲测试、钙黄绿素双标记染色、免疫组织化学、免疫荧光、酶联免疫吸附试验、定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质印迹。 结果：液相色谱-串联质谱分析鉴定出303个功能肽和32个差异代谢物。鹿茸多肽通过增强骨痂形成，显著加速了小鼠的骨折愈合。在鹿茸多肽处理的小鼠骨折骨痂中，以及在用含鹿茸多肽血清刺激的骨髓细胞中，前列腺素E2的产生显著增加，这激活了体内和体外感觉神经和背根神经节神经元中的EP4受体。该激活进而改善了丘脑cAMP反应元件结合蛋白的磷酸化并降低了交感神经张力，从而促进了骨骼干细胞/祖细胞的成骨分化。然而，由于神经感觉PGE2/EP4/p-CREB信号传导被阻断，鹿茸多肽介导的骨折骨痂成骨在EP4Avil小鼠中被消除。 结论：本研究表明，鹿茸多肽通过神经感觉PGE2/EP4/p-CREB轴促进成骨，从而加速骨折愈合。 本研究文章的转化潜力：鹿茸多肽是鹿茸（一种具有自我再生能力的哺乳动物器官）的主要生物活性成分。本研究揭示，鹿茸多肽可通过激活神经感觉PGE2/EP4/p-CREB轴促进小鼠骨折愈合。这些发现为增强骨修复提供了一种新型生物活性候选物，在临床上具有开发治疗骨折或其他骨缺损疗法的转化潜力。

鹿茸多肽通过激活神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴促进骨折愈合的机制研究解读

一、 研究背景与目的

骨折是全球范围内最常见、致残风险最高的骨骼疾病之一。尽管当前的治疗手段如固定和手术能够提供机械稳定性，但无法为骨再生提供必要的生物刺激。因此，迫切需要开发能够增强骨折愈合的新型治疗策略。骨折愈合是一个复杂的生物学过程，涉及骨膜内成骨和软骨内成骨两种途径，骨骼干细胞/祖细胞介导的骨形成在其中起着关键作用。近年来，研究揭示骨组织中密集分布的感觉神经在监测和调节骨再生中扮演着重要角色。前列腺素E₂作为一种常见的炎症介质，除了介导疼痛外，对骨折修复也具有促成骨效应。PGE₂通过与感觉神经上的EP₄受体结合，触发信号传导，导致下丘脑腹内侧核的cAMP反应元件结合蛋白磷酸化，进而抑制交感神经张力，最终促进骨骼干细胞/祖细胞的成骨分化。这条神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴被视为促进骨折愈合期间成骨的潜在治疗靶点。

鹿茸（鹿茸）是一种具有完全再生能力的独特哺乳动物器官，在中医理论中因其“补肾壮骨”的功效而被用于治疗骨折等骨骼疾病。鹿茸多肽是鹿茸蛋白经酶解产生的生物活性成分，相比大分子蛋白质，其具有更好的胃肠道吸收率和生物活性。已有研究报道鹿茸多肽具有抗氧化、抗器官纤维化、抗衰老、抗肿瘤、抗神经系统疾病和抗骨质疏松等多种生物效应。然而，鹿茸多肽在骨折愈合中的作用和具体机制尚不清楚。基于此，本研究旨在阐明鹿茸多肽在骨折愈合中的治疗效果及其分子机制。研究人员提出假设：鹿茸多肽通过激活神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴，下调交感神经张力，从而增强骨痂成骨以促进骨折愈合。本研究发表于《Journal of Orthopaedic Translation》。

二、 关键技术方法

为验证假设，研究人员采用了多学科技术方法。在分子层面，通过液相色谱-串联质谱对鹿茸多肽的肽组成及其在大鼠体内的血清代谢物进行定性和定量分析。在动物模型层面，研究使用了多种基因工程小鼠，包括感觉神经特异性Advillin-Cre报告小鼠、骨骼干细胞/祖细胞特异性Gli1-CreER^T2报告小鼠，以及感觉神经特异性EP₄受体条件性敲除小鼠。所有8周龄小鼠（包括C57BL/6J背景和上述转基因品系）均接受单侧胫骨横向骨折手术建模，术后分为模型组和鹿茸多肽治疗组，治疗组每日口服给予50 mg/kg的鹿茸多肽。在细胞实验层面，研究人员从小鼠骨髓腔分离原代骨髓细胞，并从腰椎背根神经节分离培养原代神经元。为模拟体内环境，使用经鹿茸多肽处理的大鼠血清或其条件培养基对骨髓细胞和背根神经节神经元进行干预。评估手段包括步态分析、微型计算机断层扫描评估骨痂形态与骨量、三点弯曲测试骨生物力学性能、组织学染色（阿利新蓝/橙黄G染色、钙黄绿素双标）、免疫组化/免疫荧光、蛋白质印迹、酶联免疫吸附试验和定量逆转录聚合酶链反应，以从功能恢复、结构、力学、细胞分化、蛋白与基因表达等多维度综合评价骨折愈合效果及相关信号通路变化。

三、 研究结果

3.1. 鹿茸多肽的肽组成与血清代谢物分析

通过液相色谱-串联质谱分析，从鹿茸多肽中鉴定出总计48,607个肽段，通过与六个已知功能肽数据库比对，最终确认了303个功能肽。对大鼠血清的代谢组学分析显示，鹿茸多肽处理组与对照组的代谢谱存在明显分离，共鉴定出32个差异代谢物，可归类为13个化学类别。京都基因与基因组百科全书通路富集分析识别出5条显著代谢通路，包括甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢，精氨酸和脯氨酸代谢，色氨酸代谢，亚油酸代谢以及不饱和脂肪酸的生物合成。

3.2. 鹿茸多肽通过增强成骨加速小鼠胫骨骨折愈合

在体实验表明，口服鹿茸多肽显著改善了骨折肢体在术后21天的步态参数（步长、摆动时长、爪印面积）。微型计算机断层扫描成像显示，治疗组小鼠在术后7天和14天形成更大的骨折骨痂，并在术后21天实现骨折间隙的完全愈合，同时骨体积和骨体积分数显著增加。三点弯曲测试证实治疗组骨折胫骨的最大载荷和弹性模量显著提升。组织学分析（阿利新蓝/橙黄G染色）显示，治疗组小鼠骨折骨痂中央区域的软骨面积和边缘区域的编织骨面积均增加。钙黄绿素双标染色定量分析表明，骨矿物沉积率和骨形成率显著升高。此外，骨折骨痂中成骨相关基因（碱性磷酸酶、Runt相关转录因子2、I型胶原α1链）的表达以及碱性磷酸酶蛋白水平均显著上调。这些结果综合表明，鹿茸多肽通过促进骨折骨痂的成骨作用加速了小鼠胫骨骨折愈合。

3.3. 鹿茸多肽通过激活神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴以下调交感神经张力来促进成骨

机制探索发现，鹿茸多肽处理显著上调了骨折血肿/骨痂中环氧合酶-2蛋白的表达，并提高了血清、骨髓和骨折骨痂中的前列腺素E₂水平。体外实验进一步证实，用含鹿茸多肽的血清处理原代骨髓细胞，可上调其环氧合酶-2蛋白表达并促进前列腺素E₂分泌。然而，鹿茸多肽血清处理并未直接上调骨髓细胞或C3H10T1/2细胞中的Runt相关转录因子2蛋白水平或碱性磷酸酶活性，表明其不直接促促成骨。在神经调控方面，免疫荧光染色显示，鹿茸多肽处理后，骨折骨痂和背根神经节中EP₄⁺CGRP⁺（降钙素基因相关肽）感觉神经的比例、以及背根神经节中CGRP的表达均增加。在使用感觉神经报告小鼠的实验中，也观察到了骨折骨痂和背根神经节中EP₄⁺Avil⁺神经比例的升高。用经鹿茸多肽血清刺激的骨髓细胞条件培养基处理原代背根神经节神经元，同样上调了其EP₄和CGRP的表达。下游信号检测发现，鹿茸多肽处理促进了小鼠下丘脑腹内侧核中p-CREB的表达。同时，作为交感神经张力关键指标的下丘脑室旁核、背根神经节和骨折骨痂中的酪氨酸羟化酶表达，以及血清去甲肾上腺素水平均显著下降。使用骨骼干细胞/祖细胞报告小鼠的实验进一步证实，鹿茸多肽处理增加了骨折骨痂中OCN⁺Gli1⁺细胞（即成骨分化的骨骼干细胞/祖细胞）的比例。这些结果提示，鹿茸多肽通过激活神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴，抑制交感神经张力，从而促进骨骼干细胞/祖细胞的成骨分化。

3.4. 条件性敲除感觉神经EP₄受体消除了鹿茸多肽介导的骨折愈合加速效应

为确证上述轴的关键作用，研究人员在感觉神经特异性EP₄受体敲除小鼠及其同窝对照小鼠中进行了验证。微型计算机断层扫描结果显示，在EP4^Avil小鼠中，鹿茸多肽处理未能增加其骨折骨痂骨量或加速骨折间隙愈合，而这些促愈合效应在同窝对照小鼠中依然存在。组织学和动态骨形成分析也一致表明，鹿茸多肽对软骨骨痂面积、编织骨面积、骨矿物沉积率和骨形成率的提升作用在EP4^Avil小鼠中被完全消除。

3.5. 感觉神经EP₄受体的缺失废除了鹿茸多肽在骨折愈合期间的成骨作用

进一步分析发现，在EP4^Avil小鼠中，鹿茸多肽处理虽然仍能上调骨折骨痂环氧合酶-2和血清前列腺素E₂水平，但未能激活下游信号：骨折骨痂和背根神经节中EP₄/CGRP共标面积、下丘脑腹内侧核p-CREB水平均无显著变化。同时，交感神经张力标志物（下丘脑室旁核、背根神经节、骨折骨痂中的酪氨酸羟化酶及血清去甲肾上腺素）也未下调。相应地，骨折骨痂中成骨细胞标志物骨钙素与瘦素受体共标细胞的比例也未增加。这综合证明，感觉神经EP₄受体的缺失阻断了整个神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴的激活，从而废除了鹿茸多肽的促成骨与促愈合效应。

四、 讨论与结论

讨论部分指出，尽管鹿茸多肽具有多种已报道的生物功能，但其对正常骨折愈合的作用及机制此前不明。本研究通过液相色谱-串联质谱明确了鹿茸多肽的复杂成分。体内外实验证实，鹿茸多肽能通过促进骨骼干细胞/祖细胞成骨分化来加速骨折愈合，但其本身不直接作用于成骨细胞谱系细胞。机制上，鹿茸多肽或其代谢物通过促进骨髓细胞及其他组织（如肝、肾）合成前列腺素E₂，进而激活感觉神经上的EP₄受体。该信号经背根神经节传递至中枢，引起下丘脑腹内侧核p-CREB磷酸化，从而抑制下丘脑室旁核介导的交感神经张力，最终为骨骼干细胞/祖细胞的成骨分化创造有利的微环境。感觉神经特异性EP₄受体敲除实验确证了该轴的必要性。研究也指出了若干局限性，例如未在体外彻底排除鹿茸多肽对骨骼干细胞/祖细胞的直接作用、EP₄敲除小鼠本身存在骨量基础差异、以及未深入探讨同时上调的CGRP在其中的具体贡献等。

结论：总之，本研究利用液相色谱-串联质谱鉴定了鹿茸多肽的303个功能肽和32个差异代谢物。通过体内外实验，研究人员揭示鹿茸多肽通过激活神经感觉PGE₂/EP₄/p-CREB轴以下调交感神经张力，从而加速小鼠骨折愈合。