肿瘤坏死因子刺激基因-6对H9c2心肌细胞中氯化钴诱发的缺氧损伤的保护作用

《Journal of Surgical Research》：Protective Role of Tumor Necrosis Factor-Stimulated Gene-6 Against Cobalt Chloride –Induced Hypoxic Injury in H9c2 Cardiomyocytes

　　

张彪|李龙龙|李慧|李静|刘海涛

中国安徽省阜阳市安徽医科大学第五附属医院心胸外科

摘要

引言

心肌缺氧通过氧化应激、细胞凋亡和血管生成受损导致心肌细胞损伤。肿瘤坏死因子刺激基因6（TSG-6）产生一种参与免疫调节和组织修复的糖蛋白。本研究旨在评估TSG-6在氯化钴诱导的低氧损伤中对H9c2心肌细胞的保护作用，并探讨其潜在机制。

材料与方法

使用200 μM氯化钴在H9c2细胞中建立低氧模型。细胞被分为正常氧、低氧、TSG-6处理或TSG-6中和组。通过细胞计数试剂盒-8检测、定量实时聚合酶链反应、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口末端标记染色、Western blot和氧化应激检测来评估细胞活力、细胞凋亡、血管生成因子表达和氧化状态。

结果

TSG-6显著提高了低氧条件下的细胞活力，其中200 ng/mL浓度最为有效（P < 0.05）。它降低了B-cell淋巴瘤-2的表达，同时抑制了Bcl-2相关的X蛋白和切割的caspase-3蛋白的表达（P < 0.01）。此外，TSG-6通过诱导血管内皮生长因子和低氧诱导因子-1α，有助于缓解氧化应激，表现为活性氧和丙二醛水平的下降以及超氧化物歧化酶活性的提高（P < 0.01）。TSG-6的中和部分逆转了这些效应，证实了其保护功能的特异性。

结论

TSG-6通过抑制细胞凋亡、促进血管生成和减少氧化应激，对低氧损伤的H9c2心肌细胞具有保护作用。这些观察结果表明，TSG-6可能成为治疗与心肌缺氧相关疾病的有效候选分子。

引言

包括心肌梗死、心力衰竭和冠状动脉综合征在内的多种心血管疾病，其主要的病理因素是心肌缺氧。^1,2 在低氧条件下，活性氧（ROS）水平升高，再加上线粒体功能障碍和血管生成受损，共同导致心肌细胞损伤。^3,4 尽管有多种药物干预手段，但由于低氧引起的心肌损伤具有多因素性质，其疗效仍然有限。⁵ 因此，阐明低氧损伤的分子机制并寻找新的治疗靶点仍是心血管医学的研究重点。

在细胞层面上，低氧诱导的细胞凋亡和氧化应激是心肌细胞死亡的根本原因。⁶ 线粒体依赖的细胞凋亡由促凋亡的Bcl-2相关X蛋白（Bax）与抗凋亡的B-cell淋巴瘤-2蛋白（Bcl-2）的比例严格控制，这种比例的变化是低氧损伤的标志。^7,8 此外，过多的ROS产生会损害关键的抗氧化酶，如超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX），从而加剧氧化损伤。⁹ 同时，低氧条件下的血管生成反应由低氧诱导因子-1α（HIF-1α）调节，该因子可转录激活血管内皮生长因子（VEGF）；然而，其表达失调可能导致异常或不足的血管化。^10,11

肿瘤坏死因子刺激基因-6（TSG-6）是一种分泌的糖蛋白，具有免疫调节和组织保护作用。¹² 研究表明，TSG-6可通过调节透明质酸的代谢和抑制促炎细胞因子来减轻炎症和组织损伤。¹³ 最近的研究提示TSG-6在非心脏低氧损伤模型中可能参与氧化应激调节和血管生成。^14,15 然而，其在心肌缺氧中的功能作用和潜在机制仍大多未被探索。

在本研究中，我们假设TSG-6通过调节细胞凋亡、氧化应激和血管生成信号通路，对低氧损伤的心肌细胞具有细胞保护作用。利用氯化钴（CoCl₂）诱导的低氧模型在H9c2细胞中进行研究，旨在探讨TSG-6的功能相关性，并明确其对关键分子途径的调节效应。这项研究不仅揭示了TSG-6所提供的生物保护作用，也为其在心血管治疗中的应用开辟了新途径。

节选

模型建立与分组

H9c2心肌细胞是一种来自BD1X大鼠胚胎心脏组织（ATCC, CRL-1446）的大鼠胚胎心肌细胞系，在37°C、5% CO₂湿润环境中使用高葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基（Gibco）进行培养，培养基中添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（Gibco）。

为了优化TSG-6的治疗浓度，进行了剂量-反应研究。H9c2细胞被预先处理不同剂量的重组TSG-6（0,

低氧抑制H9c2细胞内源性TSG-6的表达

为了确定该实验模型中内源性TSG-6的基线水平，我们首先研究了CoCl₂诱导的低氧对H9c2细胞中TSG-6表达的影响。通过qRT-PCR和Western blot分析发现，与正常氧对照组相比，低氧处理24小时后，细胞中的TSG-6信使RNA（mRNA）（图1A）和蛋白质（图1B）表达水平显著下降（P < 0.001）。这一结果表明，在CoCl₂诱导的低氧条件下

讨论

本研究表明TSG-6能够对H9c2心肌细胞中由CoCl₂诱导的低氧损伤提供多重保护作用。我们的一项重要发现是，在CoCl₂诱导的低氧条件下，H9c2细胞内源性TSG-6的表达显著减少。这表明在低氧应激状态下，内源性TSG-6的产生不足，可能会增加心肌细胞对损伤的敏感性。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。

资助

本研究得到了安徽省高等教育机构（2022AH040096）和安徽医科大学科研基金（2022xkj070）的支持。

数据获取

如需本文的数据，可向通讯作者提出合理请求。

CRediT作者贡献声明

张彪：撰写 – 审稿与编辑、原始稿撰写、方法学设计、概念构建。李龙龙：项目管理、实验实施。李慧：原始稿撰写、指导。李静：数据分析与资源准备。刘海涛：撰写 – 审稿与编辑。