用于下一代RNA测序和小RNA定量分析的无凝胶文库制备方法

《Communications Biology》：Gel-free library preparation for next-generation RNA sequencing and small RNA quantification

　　

摘要

下一代RNA测序（RNA-seq）受到“引物二聚体”（primer dimer，简称PD）现象的干扰，其定量分析效果也因此受到聚合酶在RNA修饰位点和二级结构处脱附（polymerase fall-off，简称PF）的影响而降低。为提高RNA测序的效率，我们采取了以下措施：（i）在逆转录（RT）后利用大肠杆菌（Escherichia coli）的外切核酸酶I消化多余的引物，从而减轻PD现象，进而省去了RNA测序文库制备过程中的凝胶纯化步骤；（ii）使用高效率的逆转录酶来增加全长测序数据的获取量。我们对基于全因子实验设计的绝对定量RNA测序（AQRNA-seq）方法进行了优化，这是目前最精准的用于小RNA定量分析的下一代测序（NGS）技术。该方法使用由大肠杆菌产生的小RNA（主要为tRNA，占比超过85%）构建的cDNA文库进行测序，随后进行数据 processing 和数据分析。这些创新的PD和PF抑制策略将AQRNA-seq的灵敏度提高了10倍以上，有效减少了目标RNA分子的丢失。通过提升灵敏度并无需依赖凝胶电泳去除PD产物，AQRNA-seq及其他基于NGS的RNA测序方法可以实现自动化操作，从而提高通量并减少RNA样本的使用量。