用于灭活耐抗生素大肠杆菌及降解抗生素抗性基因的介质阻挡放电等离子体技术：效率、影响因素及作用机理

《Journal of Water Process Engineering》：Dielectric barrier discharge plasma for inactivation of antibiotic-resistant Escherichia coli and degradation of antibiotic resistance genes: Efficiency, influencing factors, and mechanisms

　　王杰|张凯|刘世坤|刘星国
中国渔业科学院渔业机械与仪器研究所，中国上海赤峰路63号，200092

摘要
抗生素耐药细菌和抗生素耐药基因（ARGs）被认为是水生系统中的新兴污染物。本研究系统地探讨了介质阻挡放电（DBD）等离子体在灭活耐药大肠杆菌（AR E. coli）及其携带的ARGs方面的效率、影响因素及作用机制。DBD等离子体能够有效灭活AR E. coli，并且在能量效率方面，选择107.9 W/40分钟的参数作为最佳处理条件。共存的Fe2+和Cu2+通过类芬顿反应促进灭活过程，而CO32?、Cl?和腐殖酸则通过清除活性氧物种来抑制等离子体的效果。机制分析表明，DBD等离子体产生的OH、1O2、O3和H2O2会破坏细胞结构，引发氧化应激，最终导致细胞破裂。随着细胞分解，释放到细胞外的ARGs可以直接被DBD等离子体降解。此外，DBD等离子体还能通过破坏如intI1这样的移动遗传元件的结构来阻止ARGs的传播。转录组分析显示，DBD等离子体能有效抑制AR E. coli中的三磷酸腺苷（ATP）合成，并在一定程度上影响细胞外聚合物物质的分泌功能，从而阻碍ARGs的横向转移。本研究强调了DBD等离子体作为处理抗生素耐药病原体和ARGs的有前景的技术。

引言
抗生素作为预防和治疗细菌性传染病的药物以及促进动物生长的饲料添加剂，在医疗保健、畜牧业和水产养殖等行业中被广泛使用[1]。大规模且不合理地使用抗生素导致大量残留物和代谢物进入水体、空气、土壤和污水处理厂等环境介质中并逐渐积累[2]。通常，环境中的抗生素浓度远低于最低抑菌浓度。在长期低浓度抗生素的选择压力下，细菌逐渐产生耐药性并携带抗生素耐药基因（ARGs）。即使携带ARGs的耐药细菌（ARB）被灭活，这些基因仍可能保持活性并通过移动遗传元件传递给其他细菌[3]。ARGs的出现和广泛传播降低了抗生素的治疗效果，迫使人们不断更新抗生素种类。因此，作为新型全球污染物的ARB和ARGs引起了广泛关注[4]。

现有的去除ARB和ARGs的方法主要包括物理化学处理、生物处理和新型技术。紫外线和氯消毒是常用的方法，但它们对某些ARB（如β-内酰胺酶耐药细菌、磺胺甲噁唑耐药细菌）的灭活效果有限，且不能完全去除ARGs[5],[6]。高级氧化工艺（如紫外线/H2O2、硫酸根自由基）能有效灭活ARB并降解ARGs，但可能产生副产物（如Cl），影响处理稳定性[7]。电化学膜处理（如CeO@CNT-NaClO体系）结合氧化剂可以高效去除抗生素和ARGs，但其效果依赖于材料性能和操作条件[8]。厌氧消化有望减少ARGs，但其效果受工艺参数影响，对某些ARGs（如核糖体保护型基因）的去除效果有限[3],[9]。堆肥可以减少部分ARB和ARGs，但其效果不稳定，甚至可能富集某些耐药细菌[10],[11]。基于CRISPR基因编辑的新型技术可以靶向切割ARGs以抑制其横向转移，但实际应用仍处于研究阶段[12]；基于DNA结合蛋白的方法（如Avd-Sso7d）能特异性去除ARGs，但其应用范围受序列特异性的限制[13]。总体而言，现有方法在效率、成本、副产物控制和技术成熟度上存在差异，需要根据具体场景选择最优方案。

等离子体技术是一种新型高级氧化工艺，通过放电将空气电离成包含电子、离子、激发原子、光子等的复杂体系，同时具有紫外线、微波、超声波和冲击波等物理效应。这可以在常温条件下高效进行难以进行或反应缓慢的化学反应[14]。等离子体技术整合了电化学、光催化和高能电子轰击等多种效应，具有高效和低运行成本的优势，在医疗治疗、环境保护、材料科学和隐身技术等领域得到了广泛应用[15],[16]。在全球能源日益紧张的背景下，利用电场将气体转化为化学能量无疑是一项突破性创新。因此，等离子体技术有望成为未来环境污染控制和工业节能减排的重要手段[15]。其中，DBD等离子体技术无需高温条件即可生成和控制等离子体，具有更广阔的应用前景[17],[18]。由于其无需外加化学物质即可产生活性物种，并且适用于多种水环境，DBD等离子体在土壤[15]、空气[16]、地表水[17]、垃圾填埋场渗滤液[19]等多种应用场景中具有巨大潜力。

研究表明，DBD技术在防控ARB和ARGs污染方面表现出色，能够有效降解ARB（如大肠杆菌、金黄色葡萄球菌）和ARGs（如aac(3)-II、mec A等）[20],[21]，并破坏移动遗传元件（如intI1）和DNA，通过抑制移动遗传元件的结合来减少ARGs的横向转移能力[20]。此外，羟基自由基（OH）和单线态氧（1O2）被认为是阻断ARGs传播的关键活性物种[20]。因此，将DBD等离子体技术应用于去除ARB和ARGs具有重要的科学研究价值。尽管已有研究应用DBD去除ARB和ARGs，但该领域的研究仍处于早期阶段，仍存在一些关键科学问题未解决。本研究的创新之处在于：（1）首次系统揭示了DBD等离子体处理下细胞内和细胞外ARGs的去除规律，弥补了以往仅关注总ARGs的不足；（2）结合转录组分析，从ATP合成和EPS分泌的角度阐明了DBD等离子体抑制ARGs横向转移的机制；（3）系统研究了水环境中共存离子和天然有机物对DBD效率的影响，为实际应用提供了理论基础。

基于此，本研究以AR E. coli为研究对象，旨在系统探讨DBD等离子体去除ARB和ARGs的效率、影响因素及作用机制。具体研究目标包括：（1）评估DBD功率和处理时间对AR E. coli及其目标ARGs（tetC、tetA、sul1、blaTEM-1、intI1）的影响；（2）研究共存物质（如Fe2+、Cu2+、CO32?、Cl?）对DBD效果的影响，并揭示其促进或抑制机制；（3）阐明DBD等离子体对AR E. coli的多尺度破坏机制；（4）从转录组角度解释DBD等离子体对ARGs传播的影响。本研究旨在深入理解基于DBD的技术机制，为制定有效策略以减轻水环境中的抗生素耐药性提供科学依据。

### 材料准备
硫酸亚铁（FeSO4，AR）、硫酸铜（CuSO4，AR）、碳酸钠（Na2CO3，AR）、 Histidine、叔丁醇、对苯醌等清除剂，以及腐殖酸（HA）、胰蛋白胨、酵母粉、琼脂、牛肉提取粉、酵母提取粉等均购自Macklin Biochemical Technology Co., Ltd.；三磷酸腺苷（ATP）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化氢酶（CAT）试剂盒购自江苏Addison Biotechnology Co., Ltd.

### 实验方法
首先考察了DBD参数对AR E. coli去除效果的影响（图2a和图S1）。在四种功率条件下，AR E. coli的去除效率随处理时间的延长而提高。此外，在相同处理时间内，功率越大，去除效率越高。例如，在48.5 W的功率下处理40分钟后，AR E. coli的对数灭活效率为4.0，反应速率常数k为0.2 min^-1；而在107.9 W的功率下处理40分钟后，对数灭活效率更高。

### 结论
研究表明，DBD等离子体是一种高效的灭活AR E. coli及其携带的ARGs的技术。最佳处理条件（107.9 W，40分钟）在效率和能量产出之间取得了平衡，Fe2+/Cu2+通过类芬顿反应增强效果，而无机阴离子/腐殖酸通过清除活性氧物种抑制效果。从机制上看，DBD等离子体采用多途径作用机制：氧化物种（如OH、1O2、H2O2、O3）破坏细胞膜，引发细胞死亡。

### 作者贡献声明
王杰：撰写、审阅与编辑、监督、概念构思；
张凯：方法设计、实验实施、数据分析；
刘世坤：数据处理、软件应用、方法优化；
刘星国：原始稿撰写、验证、资源协调。

### 利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本报告研究的已知财务利益或个人关系。

### 致谢
本研究得到了国家重点研发计划（项目编号2023YFD2400502）、现代农业产业技术体系（项目编号CARS-46）、中央公益性科学事业单位基础研究基金（项目编号2025CG04）和中央公益性科学事业单位基础研究基金（项目编号2023TD67）的支持。