PACS2通过激活ERK–MAPK信号通路抑制内质网自噬缓解脓毒症诱导的肌病

《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》：PACS2 Alleviates Sepsis-Induced Myopathy by Activating ERK–MAPK Signalling Pathway to Suppress ER-Phagy

　　

背景：脓毒症诱导的肌病（sepsis-induced myopathy, SIM）是常见且危及生命的并发症，其潜在机制尚不明确。磷酸化弗林酸性簇分选蛋白2（phosphofurin acidic cluster sorting protein 2, PACS2）是线粒体相关内质网膜（mitochondria-associated endoplasmic reticulum membranes, MAMs）的关键驻留蛋白，在多种病理条件下调控内质网稳态，但脓毒症是否破坏PACS2依赖的MAM完整性进而触发内质网功能障碍和肌肉萎缩尚未见报道。 方法：研究人员通过盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture, CLP）建立脓毒症小鼠模型，采用复合肌肉动作电位（compound muscle action potential, CMAP）记录和抓力测量评估肌肉功能；通过苏木精-伊红（haematoxylin and eosin, H&E）染色和蛋白质印迹法评估肌肉萎缩；通过蛋白质印迹法、免疫组织化学和定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）检测PACS2表达；通过免疫荧光共定位IP3R和电压依赖性阴离子通道1（voltage-dependent anion channel 1, VDAC1）评估MAM完整性，通过透射电子显微镜、蛋白质印迹法和荧光显微镜评估内质网自噬（ER-phagy）激活情况；通过腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）介导的PACS2过表达干预小鼠胫骨前肌和腓肠肌，结合转录组测序分析功能；通过蛋白质印迹法检测丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）通路蛋白磷酸化水平，并通过腹腔注射ERK抑制剂SCH772984验证通路作用。 结果：脓毒症小鼠术后出现进行性骨骼肌萎缩（p<0.001）和功能障碍（p<0.01），伴随CLP后96小时PACS2表达降低56%（p<0.01）、MAM完整性下降25%（p<0.05）及随后FAM134B介导的内质网自噬激活（p<0.01）。AAV介导的PACS2过表达通过恢复MAM完整性28%（p<0.01）、降低FAM134B表达43%（p<0.01）和减轻内质网自噬（p<0.01）显著缓解肌肉萎缩。免疫共沉淀未检测到PACS2与FAM134B的直接蛋白相互作用。转录组测序和蛋白质印迹分析显示，PACS2过表达特异性激活ERK–MAPK信号通路（p-ERK升高55%，p<0.01），不影响p-P38或p-JNK水平（p>0.05），该通路通过抑制转录因子EB（transcription factor EB, TFEB）核转位（p<0.01）抑制FAM134B介导的内质网自噬（p<0.05）并改善肌肉萎缩（p<0.05）。ERK抑制剂SCH772984通过促进TFEB核转位（p<0.001）和TFEB介导的FAM134B表达（p<0.001）抵消PACS2的保护作用。 结论：研究结果表明SIM与MAM完整性破坏密切相关，PACS2通过ERK–MAPK–TFEB信号轴维持MAM结构完整性并调控FAM134B介导的内质网自噬，为SIM提供了新机制见解和潜在治疗靶点。

该研究发表于《Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle》，围绕脓毒症诱导的肌病（SIM）的病理机制展开。SIM以严重神经肌肉功能障碍、肌肉再生能力下降和进行性肌肉萎缩为特征，会显著延长重症患者康复周期、损害功能预后并提升死亡风险，但目前其分子驱动机制尚未完全明确，限制了靶向干预策略的开发。线粒体相关内质网膜（MAMs）是内质网与线粒体之间的特化细胞通讯平台，协调自噬起始与进程，对细胞稳态和应激适应至关重要。磷酸化弗林酸性簇分选蛋白2（PACS2）是首个被鉴定的MAM驻留蛋白，调控MAM完整性，在膜运输、凋亡和自噬调控中发挥作用，但其是否在骨骼肌病理生理尤其是SIM中发挥作用尚不清楚。内质网自噬（ER-phagy）是选择性自噬降解内质网组分的质控机制，其中FAM134B是首个被鉴定的ER-phagy受体，通过LC3相互作用区（LIR）和网状同源域（RHD）介导内质网片段被自噬体包裹并降解，其在SIM发病中的作用也未被探索。本研究旨在阐明PACS2介导的MAM完整性改变及ER-phagy在SIM中的作用机制，明确PACS2与ER-phagy受体FAM134B的关联，为SIM发病机制提供新视角。

研究人员采用盲肠结扎穿孔（CLP）建立脓毒症小鼠模型，实验所用6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠来自西南医科大学实验动物中心，研究方案经该校动物伦理委员会批准。关键技术方法包括：通过CLP手术构建脓毒症模型，以假手术组为对照；采用腺相关病毒（AAV）局部注射胫骨前肌和腓肠肌实现PACS2过表达；通过透射电子显微镜观察内质网和线粒体超微结构；采用免疫荧光共定位和免疫共沉淀评估MAM完整性及蛋白相互作用；通过转录组测序分析差异基因及通路富集；通过核质分离结合蛋白质印迹检测TFEB核转位；采用ERK特异性抑制剂SCH772984进行药理阻断验证通路功能。

研究结果如下：

3.1 脓毒症诱导小鼠骨骼肌萎缩和无力：CLP术后小鼠血清促炎因子IL-6、TNF-α、IL-1β显著升高，术后96小时体重、腓肠肌和胫骨前肌湿重分别降低约20%、25%，复合肌肉动作电位（CMAP）振幅下降、潜伏期延长，抓力较对照组降低23%，肌纤维横截面积（CSA）缩小50%，肌肉特异性E3泛素连接酶MuRF1和Atrogin-1表达显著上调，成功模拟SIM的核心表型。

3.2 脓毒症导致小鼠骨骼肌FAM134B介导的ER-phagy激活：透射电镜显示脓毒症小鼠骨骼肌内质网含量减少、形态破坏，线粒体膜受损、嵴结构紊乱；转录组测序显示ER-phagy相关基因FAM134B上调最显著（约4倍），蛋白质印迹验证其蛋白水平术后持续升高约3倍；免疫荧光显示FAM134B与LC3B共定位增强，证实脓毒症触发FAM134B介导的ER-phagy激活。

3.3 脓毒症导致PACS2表达降低和MAM结构损伤：免疫荧光显示脓毒症小鼠骨骼肌IP3R与VDAC1共定位降低25%，免疫共沉淀验证二者存在物理相互作用，提示MAM完整性破坏；蛋白质印迹、qRT-PCR和免疫组化均证实脓毒症小鼠骨骼肌PACS2在mRNA和蛋白水平显著下调，术后96小时蛋白表达降低56%。

3.4 PACS2过表达缓解脓毒症小鼠骨骼肌萎缩：AAV介导的PACS2过表达使骨骼肌PACS2表达升高约12倍，可阻止脓毒症导致的肌肉质量丢失，改善肌纤维CSA缩小，恢复CMAP异常，降低MuRF1和Atrogin-1表达（分别降低77%和50%），并使IP3R与VDAC1共定位恢复约28%，证实PACS2通过维持MAM完整性发挥保护作用。

3.5 PACS2过表达抑制脓毒症骨骼肌FAM134B介导的ER-phagy：PACS2过表达使脓毒症小鼠骨骼肌FAM134B表达降低43%，透射电镜显示内质网结构完整性改善，免疫荧光显示FAM134B与LC3B共定位减少；STRING数据库预测二者存在互作位点，但免疫共沉淀未检测到直接蛋白相互作用，提示调控为间接机制。

3.6 PACS2过表达通过激活ERK–MAPK信号通路抑制FAM134B表达：转录组测序KEGG富集显示PACS2过表达后MAPK信号通路显著激活；蛋白质印迹显示脓毒症降低p-ERK水平，PACS2过表达使其升高55%，对p-P38和p-JNK无显著影响，提示PACS2通过激活ERK–MAPK通路发挥作用。

3.7 ERK激活通过抑制TFEB核转位降低脓毒症骨骼肌FAM134B转录水平：ERK抑制剂SCH772984使p-ERK/ERK比值降低88%，逆转PACS2对FAM134B的抑制作用，恢复FAM134B与LC3B共定位；免疫荧光和核质分离实验显示，脓毒症诱导TFEB核转位，PACS2过表达使其核水平降低36%，而SCH772984可恢复TFEB核积累；同时SCH772984可抵消PACS2对肌肉萎缩和功能损伤的改善作用。

讨论部分指出，MAM结构破坏与多种肌肉疾病相关，本研究首次证实脓毒症下调PACS2导致MAM完整性破坏，进而促进FAM134B介导的ER-phagy引发肌肉萎缩。既往研究显示FAM134B可通过调控ER-phagy影响MAM结构和线粒体功能，但其在SIM中对MAM和线粒体的反向调控仍需进一步研究。此前ER应激被证实参与SIM发病，本研究补充了ER-phagy独立调控SIM的新证据，ER-phagy与ER应激的互作关系仍需深入探索。MAPK通路调控多细胞生理过程，本研究明确PACS2通过激活ERK–MAPK通路抑制TFEB核转位，进而降低FAM134B转录，该机制与脂肪肝、阿尔茨海默病等疾病的调控模式一致。研究局限性包括局部AAV注射无法评估整体功能，未来将采用尾静脉注射实现系统性递送；此外FAM134B磷酸化和寡聚化、PACS2磷酸化位点在SIM中的作用也有待阐明。

研究结论为：SIM与PACS2表达降低引发的MAM完整性破坏及FAM134B介导的过度ER-phagy密切相关；PACS2通过激活ERK–MAPK信号通路，抑制TFEB核转位并降低FAM134B转录水平，最终缓解SIM，为SIM提供了新的机制见解和潜在治疗靶点。