新型氨基甲基哌啶酮衍生物作为二肽基肽酶-4抑制剂的发现

《Letters in Drug Design & Discovery》：Discovery of novel aminomethyl-piperidone derivatives as dipeptidyl peptidase-4 inhibitors

　　普里娅·德维 | 苏巴迪普·马伊蒂 | 阿斯塔·辛格 | 阿马尔·布里巴巴布 | 萨米尔·奇特塔 | 阿布泽尔·阿里 | 阿梅娜·阿里 | 维韦克·阿萨蒂
印度旁遮普省莫加ISF药学院药学系

**摘要**
背景：
DPP-IV抑制剂作为一种口服抗糖尿病药物，通过阻止增加胰岛素分泌的激素的分解来控制2型糖尿病。本研究展示了氨基甲基哌啶酮衍生物作为抗糖尿病药物的有效性。

**目的**：
本研究旨在通过计算方法探究氨基甲基哌啶酮衍生物的抗糖尿病潜力，并识别出有前景的新DPP-IV抑制剂。

**方法**：
共使用32种配体进行药效团建模、3D-QSAR分析、虚拟筛选、分子对接及ADME预测。

**结果**：
HHPRR_1药效团模型表现出最高的存活得分（5.73）。3D-QSAR研究的R2值为0.9439，Q2值为0.8405。在这些化合物中，化合物13e与受体的结合效果最佳。该药效团模型用于筛选ZINC化合物，其中ZINC57775421与Tyr666、Arg125、Tyr547和Trp629氨基酸残基的结合效果最佳（PDB ID: 2OQI）。通过计数研究，化合物P1和P2的结合得分分别为?9.302和?8.202。MD模拟（100 ns）进一步验证了所有DPP-4复合物的结合稳定性，RMSD值在1.5–2.5 ?范围内，表明ZINC57775421的稳定性极高。RMSF分析显示残基的灵活性小于1.8 ?，证实了受体-配体间的稳定结合。

**结论**：
本研究的结果可能有助于未来开发更有效的甲基哌啶酮衍生物作为DPP-4抑制剂。

**1. 引言**
二肽基肽酶-4（DPP-4），也称为CD26，是一种膜结合糖蛋白，分子量约为110 kDa。DPP-4通过切割肽链N端区域的两个氨基酸来调节GLP-1的活性，在倒数第二个氨基酸为丙氨酸或脯氨酸的情况下起重要作用。DPP-4抑制剂已被证明是有效的口服抗糖尿病药物，用于管理2型糖尿病。第一种此类药物西格列汀于2006年获得批准；其他成员包括维格列汀、沙格列汀、利拉格列汀、阿洛格列汀和特纳格列汀（图1）。

**图1. DPP-4抑制剂示意图：**
(a) 西格列汀 (b) 维格列汀 (c) 沙格列汀 (d) 利拉格列汀 (e) 阿洛格列汀 (f) 特纳格列汀

这类药物通过维持增加胰岛素分泌的激素（主要是GLP-1和葡萄糖依赖性胰岛素促分泌多肽GIP）的水平，在餐后增强其生物效应。这通过抑制胰高血糖素的分泌并增加胰岛素的分泌来降低肝脏产生的葡萄糖量。因此，此类药物作为抗高血糖剂，通过维持增加胰岛素分泌的激素水平，改善胰岛功能、促进胰岛素分泌并减少胰高血糖素，从而实现血糖平衡（图2）。

**2. 材料与方法**
2.1. 数据集选择：
使用包含32种氨基甲基哌啶酮衍生物的数据集来寻找潜在的DPP-4抑制剂。这些衍生物的二维结构使用ChemDraw Professional 16.0软件生成，并将其转换为三维结构。在QSAR分析中，将IC50值（单位为nM）转换为pIC50值。
表1列出了具有不同取代基的氨基甲基哌啶酮模板及其相应的IC50和pIC50值。
为了预测pIC50值，数据集被分为7:3的比例的训练集和测试集。使用五元最小二乘（PLS）因子建立模型。

2.2. 药效团建模（PM）：
通过基于原子的3D-QSAR分析生成统计上有效的模型。此外，还进行了虚拟筛选（VS），从ZINC数据库中识别出具有DPP-4抑制能力的新型化合物。通过对接分析确定了参与DPP-4抑制的关键氨基酸残基。最后，运用了多种计算方法（如药效团建模、3D-QSAR、虚拟筛选和分子动力学模拟）来寻找新的强效DPP-4抑制剂。

**图3. 发现潜在DPP-4抑制剂的计算方法工作流程**

2.3. 3D-QSAR分析：
采用了基于原子的方法，使用来自已发表研究论文的数据集。首先对所有配体进行能量优化，然后进行对接以预测其活性。数据分为70%的训练集和30%的测试集。3D-QSAR技术中的回归系数用于评估特定化学特征的益处或危害程度。

2.4. 3D-QSAR模型验证：
3D定量结构-活性关系（3D-QSAR）模型在评估模型的预测能力方面起着关键作用。定义模型可靠性和准确性的因素包括：标准差（SD）、方差比（F）、测试集的RMSE、预测活性的Q2值以及皮尔逊相关系数（R2）和回归系数（R2）。

2.5. R基团替换：
该技术通过用不同基团替换核心来生成化合物多样性。选择氨基甲基哌啶酮作为核心，替换位置和特征根据基于原子的3D-QSAR建模确定。R基团包含作为氢键供体和水的替代物的羟基基团，有助于生成活性分子。

2.6. 虚拟筛选：
对2170种哌啶酮类似物进行了虚拟筛选，以寻找DPP-4抑制剂。首先根据Lipinski的五规则进行筛选，然后使用OPLS_2005力场对化合物进行优化。

2.7. 分子对接研究：
使用Schr?dinger Maestro包的Glide模块对一系列氨基甲基哌啶酮类似物进行了 docking模拟。

2.8. ADME分析：
ADME（吸收、分布、代谢和排泄）分析提供了关于化合物药代动力学的信息。

**3. 结论**
本研究结果可能有助于未来开发更有效的甲基哌啶酮衍生物作为DPP-4抑制剂。分子动力学（MD）模拟
分子动力学（MD）模拟被用来研究四种特定化合物的行为和相互作用：P1、P2、ZINC57775417和ZINC57775421。为了建立一个有意义的参考点，使用了一种对照化合物晶体配体进行了比较分析，作为评估分子相互作用的基准。分子动力学（MD）模拟是针对人类二肽基肽酶IV（DPP4）的晶体结构及其与含有吡啶酮结构的苯乙胺抑制剂（PDB ID：2OQI）的相互作用进行的。这里采用的程序遵循了标准协议，以确保结果的一致性和可靠性。所有模拟都是使用Schr?dinger 2020–3软件包中的Desmond模块完成的。在模拟之前，通过使用蛋白质准备向导确保蛋白质结构的适当准备，以获得能够与药物结合的优化形式。由于OPLS3E力场在MD模拟中的成功应用，因此用于蛋白质和药物的参数化。为了模拟生理状态，系统被一个正交水盒包围，水盒中的SPC水分子之间至少相隔10 ?。这种设置与自然的水环境非常相似，增强了模拟的生物学相关性。在开始生产阶段之前，系统在恒定体积条件下进行了1纳秒（ns）的平衡步骤，以稳定系统并达到热力学上具有代表性的状态。主要模拟在恒定压力下进行了100 ns，以分析化合物与目标蛋白的长期稳定性和相互作用。在模拟过程中评估了关键的结构参数，包括均方根偏差、均方根波动和回转半径。配体-蛋白质复合物的结合自由能是通过Schr?dinger的Maestro软件包中提供的MM-GBSA方法计算的溶剂化能量来得出的。对于某些分子，MM-GBSA计算是在Prime软件包的MM-GBSA面板中进行的，同时考虑了酶的结构作为模拟盒的一部分。为了估计化合物的结合自由能，应用了VSGB溶剂化模型，并结合了OPLS3E力场。

**结果与讨论**
3.1. 顶级药效团假设的数据集
共生成了20个假设，每个假设都显示了与受体分子的相互作用，并根据各种分数进行了排名，具体数值如表2所示。顶级假设HHPRR_1（图6）是根据其存活分数和姿势假设分数选出的。距离计算工具被用来找到内部特征距离图的准确位置，如表3所示。

**表2. 药效团假设的开发及其得分和排名。**
| S. No. | HypoID | Survival | Site | Vector | Volume | Select | Matches | Inactive | Adjusted BEDROC | Ref. Lig. |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1 | HHPRR_1 | 5.73 | 0.69 | 10.97 | 96 | 0.78 | 88 | 2.57 | 32 | 1 |
| 2 | AHPRR_1 | 5.67 | 0.88 | 10.88 | 22 | 0.78 | 28 | 2.42 | 39 | 3 |
| 3 | AHPRR_2 | 5.66 | 10.92 | 12 | 0.82 | 22 | 0.80 | 2.41 | 97 | 5 |
| 4 | AHPRR_3 | 5.66 | 15.09 | 0.90 | 79 | 0.99 | 32 | 0.70 | 33 | 2 |
| 5 | AHPRR_4 | 5.66 | 5.65 | 30.70 | 46 | 0.93 | 15 | 22 | 45 | 3 |
| 6 | HHPRR_2 | 5.65 | 30.70 | 46 | 0.93 | 15 | 22 | 45 | 3 |
| 7 | HHPRR_3 | 5.62 | 73 | 0.70 | 30.88 | 40 | 75 | 1 |
| 8 | AHPRR_3 | 5.60 | 63 | 0.82 | 40 | 75 | 1 |
| 9 | AHPRR_4 | 5.62 | 73 | 0.82 | 40 | 75 | 1 | 8 |
| 10 | HHPRR_2 | 5.65 | 30.70 | 46 | 0.93 | 15 | 22 | 45 | 6 |
| 11 | HHPRR_2 | 5.65 | 30.70 | 46 | 0.93 | 15 | 22 | 45 | 3 |
| 12 | HHPRR_4 | 5.54 | 23 | 0.62 | 50.98 | 17 | 0.79 | 16 | 2.44 | 5 |
| 13 | HHPRR_4 | 5.53 | 98 | 0.62 | 44 | 0.94 | 29 | 0.71 | 52 | 9 |
| 14 | AHPRR_2 | 5.52 | 74 | 0.82 | 19 | 0.98 | 5 | 10 | 6 |
| 15 | HHPRR_4 | 5.62 | 53 | 0.62 | 44 | 15 | 22 | 5 | 1 |
| 16 | HHPRR_2 | 5.65 | 30.70 | 46 | 0.93 | 15 | 22 | 45 | 3 |
| 17 | AHPRR_3 | 5.60 | 63 | 0.82 | 40 | 75 | 1 |
| 18 | AHPRR_3 | 5.60 | 63 | 0.82 | 40 | 75 | 1 |
| 19 | HHPRR_4 | 5.54 | 23 | 0.62 | 50.98 | 17 | 0.79 | 16 | 2.44 | 5 |
| 20 | AHPRR_3 | 5.62 | 73 | 0.82 | 40 | 75 | 1 | 8 |

3.2. 药效团假设的验证
使用ROC图和% screen图等指标评估了药效团假设的验证。ROC图显示了不同截止阈值下的灵敏度和特异性之间的关系，而% screen图识别了所有配体中活跃的化合物。当两个分布之间没有重叠时，测试是完美的，其ROC曲线通过左上角时显示出100%的精确度和100%的灵敏度。图7中详细描述了这些图表。HHPRR_1的ROC值为1.00，AUAC也为1.00。

3.3. 3-D QSAR验证
3D QSAR数据为模型创建提供了关键信息。表4中的每一行显示了创建模型的实际和预期活性。该模型使用多种统计特征进行了评估，包括R2、Q2、SD、F、P、RMSD和Pearson-R。对于3-D QSAR验证，SD、P和RMSD值较低，而R2和F值较高的模型被认为是最好的。模型的预测能力由较高的Q2值表示。根据表5，该模型使用了多个PLS因素。PLS因子值最大的模型显示出显著的Q2、R2和R2 scramble值，分别为0.8405、0.9439和0.6118。然而，前三个模型的Q2、R2和R2 scramble值极低，使得选择最佳模型的可能性很小。表6显示了开发的QSAR模型中氢键供体、疏水/非极性基团、正离子基团和吸电子原子的比例。原子类型对训练集的贡献在原子类型比例图中详细说明。通过原点（0,0）的散点图获得了训练集的分布；它几乎与图8中显示的直线相同。

3.4. 等高线图的评估
等高线图估计了生物活性及其与核心 moieties 上各种取代基的关系，并评估了取代基添加对生物活性的影响。这种颜色编码对于开发新的DPP4激酶抑制剂化合物至关重要。蓝色和红色分别代表取代基类型及其对生物活性的影响。在这里，蓝色表示生物活性的增加，红色表示活性的降低。图9A中，2,4,5-三氟基团在苯环上的取代对活性有利，而5-丙基苯并[d]1,3二氧环在吡啶环上的取代对疏水性活性不利。图9B中，如图所示，吸电子取代基如-CN、-NO2、-COR、-X和卤素对活性有利，包括在吡啶环上添加5-丙基苯并[d]1,3二氧环。

3.5. 分子对接分析
使用Glide模块进行了抑制作用所需的关键氨基酸的对接分析。Schr?dinger的GLIDE软件对配体在受体活性区域内的构象、方向和位置空间进行了广泛研究。所有准备的配体都与DPP-4酶（PDB ID：2OQI）进行了对接。X射线晶体学分析显示，含有卤素的苯环对S1结合位点的亲和力较高。在所有配体中，13e、13b、13c、13d和12u的对接分数分别为?8.61、?8.19、?8.05和?7.88 kcal/mol。最常见的相互作用类型是配体胺基团与Glu205之间的静电吸引力。甲二氧苯基团与残基Phe357形成疏水相互作用，该基团的氧原子与NH通过Arg358残基形成氢键。此外，嘧啶环与苯环之间形成了π-π相互作用。在化合物12u、13b和13e中，氨（NH3）与氨基酸残基Glu205、Glu206和Tyr662相互作用；在化合物12f中，3,6-二氟苯环与残基Tyr666相互作用。化合物13b和13e的3,4,6-三氟苯环与相同残基相互作用；化合物13c和13d中的氨（NH3）与残基Glu205和Glu206以及3,4,6-三氟苯环相互作用。从上述讨论中观察到，氨基酸残基Glu205和Glu206在活性口袋内是重要相互作用，紫色箭头表示氢键相互作用。

3.6. ZINC化合物的虚拟筛选
通过R基团枚举研究可以生成新的化合物，通过更换不同的官能团来实现。使用Maestro 12.5准备了包含2701个分子的库进行虚拟筛选。首先，每个分子都通过Lipinski的五规则进行了筛选，然后使用HTVS、SP和XP方法进行对接。所有分子首先通过HTVS筛选，然后前10%的分子通过SP重新对接，再用XP方法对接。最终选择了27个分子，其中两个被认为是命中化合物。这些化合物是P1和P2，它们的XP对接分数分别为?9.302和?8.202 kcal/mol。这两种化合物与氨基酸残基Tyr 662、Tyr666、Glu205、Glu206、Ser209和Phe357相互作用，紫色线条表示氢键相互作用。

3.7. ADME属性的预测
通过Schr?dinger软件套件中的QikProp模块分析了所有配体（包括ZINC数据库中的化合物、设计的配体和参考化合物）的物理化学特性。这些特性是通过测量logP（辛醇-水分配系数）、Caco-2渗透性（nm/sec）、脑-血分配系数、MDCK渗透性（nm/sec）、白蛋白结合亲和力等确定的。所有评估的化合物都表现出良好的ADME和药物类似性特性，并且在Lipinski规则的可接受范围内。合成的衍生物P1和P2表现出良好的亲脂性（QPlogPo/w = 1.14–1.25），氢键参数（DHB = 3，AHB = 7.5）以及预测的口服吸收率（100%），表明它们具有较高的溶解度和生物利用度。ZINC化合物（ZINC57775421、ZINC57775417、ZINC57775426）的亲脂性更高（QPlogPo/w = 5.52–5.75），膜通透性的指标也更优（QPP Caco-2 = 4168–4745?nm/sec；QPPMDCK = 3673–7601?nm/sec），并且预测的吸收率也为100%，表明它们具有更强的生物膜穿越能力。然而，增强的亲脂性也可能导致与血浆蛋白的结合程度增加（QPlogKhsa ≈ 0.88–0.95）。总体而言，所有设计的化合物以及基于ZINC的化合物都显示出很好的药代动力学潜力，因此P1、P2和ZINC化合物是最有潜力进一步开发的候选物，作为有效的、口服活性的DPP-4抑制剂。表8列出了这些化合物的ADME特性。

3.8 分子动力学模拟
进行了多次分子动力学（MD）模拟，以深入理解所选配体与人类二肽酶IV（DPP4）以及在哌啶酮约束的苯乙胺受体相互作用的情况。这些模拟的目的是研究配体在蛋白质结合位点内的动态行为和结构变化。MD模拟的起始结构是通过对接过程形成的原始分子复合物。特别是，模拟集中在结合能量最低的配体构象上。在MD模拟过程中，配体在规定的时间框架内自由移动，模仿其在生物环境中的自然行为。这种技术能够动态地显示配体如何结合到蛋白质上。通过分析这些模拟，我们可以了解配体与蛋白质之间的分子相互作用，这对药物开发和生物系统研究非常有用。

3.9 RMSD分析
在MD模拟开始时，对100纳秒的轨迹进行了分析，以研究人类二肽酶IV（DPP4）受体及其结合配体复合物的结构稳定性。结构的稳定性基于蛋白质骨架和结合配体在活性位点的Cα原子的均方根偏差（RMSD）来衡量，这是根据它们的初始结构计算的。通过这项研究，获得了关于复合物构象变化和稳定性的重要信息。RMSD值随时间绘制在图表上，显示了结构随时间的偏离程度。图14和图15直观地展示了100纳秒模拟期间观察到的结构波动和相互作用。在初始波动阶段之后，所有复合物都达到了平衡，确认了系统的稳定性。在所研究的化合物中，参考配体和ZINC57775421表现出最低的RMSD波动，表明结构扰动最小且结合稳定性强。相比之下，P1和P2复合物的RMSD变化略高，可能是由于结合口袋内的微小构象调整。此外，参考配体和ZINC57775421保持了最稳定的相互作用，这反映在它们较低的RMSD偏差上。P1和P2显示出相似的RMSD趋势，进一步证实了它们相似的结合行为。值得注意的是，ZINC57775417表现出稍高的波动，表明其在结合位点内可能有一定的移动。

3.10 RMSF分析
为了进一步分析结构动态，计算了受体中碳-α（Cα）原子的均方根波动（RMSF）。这一分析提供了关于单个氨基酸残基的灵活性及其在不同配体相互作用下的变化的见解。图16展示了模拟过程中各个残基的波动模式。正如预期的那样，最灵活的区域对应于环状结构，而结合位点内的关键残基表现出最小的波动，表明它们的结构稳定性。值得注意的是，ZINC57775421复合物在关键相互作用位点的RMSF值较低，表明配体-受体相互作用更加稳定。根据RMSF数据，ASP_243、GLU_244、SER_245、LEU_246、GLN_247和TYR_248残基表现出最高的波动，反映了它们的高度灵活性。这些较高的波动表明这些残基可能属于高度动态的区域，如环状结构或结合位点部分，能够根据配体的相互作用进行调整。

3.11 回转半径（Rg）
回转半径（Rg）是模拟中的一个关键参数，定义为从共同质心的平均质量加权均方根偏差。这一参数提供了关于蛋白质大小、紧凑程度以及与特定蛋白质相关的大规模构象变化的重要信息。此外，Rg广泛用于确定蛋白质稳定性和MD模拟过程中蛋白质-配体复合物的结构稳定性。图17显示了模拟过程中记录的Rg值。通过分析这些数据，可以判断蛋白质及其结合形式的稳定性和构象变化。

3.12 MM-GBSA评估
使用MM-GBSA方法计算了结合自由能（ΔG-bind），以确定五种不同配体-蛋白质复合物的稳定性。MM-GBSA方法用于计算结合自由能，提供了关于相互作用稳定性的见解。表9中得到的ΔG_bind值（-46.55?kcal/mol和-46.55?kcal/mol）表明配体-蛋白质复合物的稳定性，较低的值表示结合能较好且稳定性高。两种配体P1和P2的ΔG_bind值相同，这合乎情理，因为这两种配体具有相似的结构和能量特性。在所有测试的配体中，ZINC57775421的结合自由能最低（-56.23?kcal/mol），而晶体参考配体的ΔG_bind值为-52.99?kcal/mol。

4. 新配体的优化
从3D-QSAR研究和分子对接技术的结果来看，成功的配体-受体结合需要满足某些结构要求。此外，图18展示了不同取代基对氨基甲基哌啶酮核心结构-活性关系的影响。R基团中的亚甲二氧基苯乙基取代以及Ar位置上的2,5-二氟苯基的存在提高了DPP-4抑制活性。另外，含有2-三氟甲基-三唑[1,5-b]吡嗪或3-三氟甲基-三唑[4,3-b]吡嗪取代基的化合物也表现出DPP-4抑制活性。总体而言，所提出的方法可用于设计DPP-4抑制剂。

5. 结论
本研究旨在评估DPP-4抑制剂的潜力。为此，采用了多种策略，包括药效团假设的开发、3D-QSAR、枚举研究、分子动力学研究、虚拟筛选和分子动力学分析。本研究利用了一组32个氨基甲基哌啶酮衍生物，并基于这一药效团假设进行了进一步的研究。最有希望的假设是HHPRR_1，其生存得分为5.73。这一假设被用于Zinc数据库的虚拟筛选和化合物的枚举。3-D QSAR研究显示最强大的模型具有R2 = 0.9439和Q2 = 0.8405。根据对接研究，化合物13e被评为得分最高的化合物，它与Tyr666、Tyr662、Glu205和Glu206等氨基酸残基发生了相互作用。对ZINC化合物的虚拟筛选显示，化合物ZINC57775421的XP对接得分为-5.095，该化合物与Tyr666、Arg125、Tyr547和Trp629（PDB ID: 2OQI）等氨基酸残基发生了相互作用。排名第一的化合物P1的对接得分为-9.302，与Tyr 662、Tyr666、Glu205、Glu206、Ser209和Phe357等残基发生了相互作用。包括RMSD、RMSF和Rg评估在内的全面MD模拟分析证实了所有配体-蛋白质复合物的结构稳定性。值得注意的是，ZINC57775421表现出优异的结合亲和力和稳定性，突显了其在治疗应用中的潜力。此外，这项研究还提供了关于增强DPP-4抑制作用的结构决定因素的机制洞察。 electrodes205、Glu206、Tyr662、Tyr666和Phe357等残基的静电和疏水相互作用在维持这些配体结合中的作用非常明显。3D-QSAR模型产生的等高线图数据显示，吸电子基团（尤其是卤素和-CF?基团）对各种芳香基团的抑制活性有显著增强作用。100纳秒MD模拟的结果表明，所有配体-蛋白质复合物在结构上保持稳定，RMSD值在1.5至2.5埃之间，残基偏差最小。MM-GBSA的结果显示ZINC57775421的结合自由能为-56.23?kcal/mol，具有最强的结合潜力和最小的RMSD及RMSF波动，可以作为一个有前途的DPP-4抑制剂。这里应用的计算策略展示了如何通过整合基于药效团的虚拟筛选、QSAR引导的设计和动态模拟来有效减少早期药物发现的时间和成本。这种方法不仅识别出了 potent 的DPP-4抑制剂骨架，还提供了一个预测未来类似物的框架。