缺氧诱导的内皮细胞外体MSTRG.12883.2增强了氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）对血管平滑肌细胞表型转变的促进作用

《Life Sciences》：Hypoxia-induced endothelial exosomal MSTRG.12883.2 enhances ox-LDL- induced phenotypic switching of vascular smooth muscle cells

　　

任奇寅|张国新|阮鹏|屈乐峰|沈振伟|支康康

中国上海海军医科大学第二附属医院血管外科

摘要

目的

动脉粥样硬化（AS）斑块区域长期处于低氧状态，这可能损害内皮功能并影响血管平滑肌细胞（VSMC）的行为。本研究旨在探讨对低氧有反应的内皮源性长链非编码RNA（lncRNAs）及其在氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）诱导的VSMC表型转换中的作用。

材料与方法

选择在低氧条件下内皮细胞（ECs）中差异表达的lncRNAs进行分析和验证，使用qRT-PCR技术。通过 Luciferase和ChIP-PCR实验评估HIF-2α对MSTRG.12883.2的转录调控作用。利用生物信息学分析、Luciferase和RIP实验研究MSTRG.12883.2与miR-632/KLF4轴的相互作用。分离并表征外泌体，并证明MSTRG.12883.2能从ECs转移到VSMCs。通过功能试验（CCK-8和迁移试验）和分子分析（ELISA和Western blotting）评估VSMC的表型转换。

主要发现

MSTRG.12883.2是一种由HIF-2α转录调控的、在低氧条件下富集于内皮细胞的lncRNA，主要存在于外泌体中，并可从ECs转移到VSMCs。其机制为：MSTRG.12883.2作为竞争性内源性RNA，与miR-632结合，从而解除KLF4的抑制作用，促使VSMC从收缩型向合成型转变。

意义

本研究揭示了独特的斑块微环境可触发内皮源性MSTRG.12883.2的表达，使其通过外泌体转移至VSMCs。这种对低氧有反应的调控轴是斑块不稳定性和血管重塑的关键驱动因素。这些发现突显了内皮细胞与VSMC之间重要的通讯机制，并将MSTRG.12883.2视为一个潜在的诊断和治疗靶点。

引言

动脉粥样硬化（AS）是大多数心血管疾病的基础，全球范围内导致超过40%的心血管相关死亡[1]。尽管在管理高血压、血脂异常、糖尿病和吸烟等传统危险因素方面取得了进展，但AS的全球负担仍在增加[2],[3]。斑块形成和破裂仍是急性心血管事件的主要诱因；然而，调控斑块进展和不稳定的微环境机制尚未完全阐明。

越来越多的证据表明，斑块区域存在持续的低氧微环境[4]。低氧会促进内皮功能障碍和炎症信号传导，从而重塑血管微环境并改变血管壁内的细胞间通讯。内皮损伤使血管平滑肌细胞（VSMCs）暴露于病理刺激，触发其激活、迁移以及从收缩型向合成型的表型转换，这些过程对斑块进展和不稳定起着关键作用[5]。除了屏障功能受损外，血管内皮细胞（VECs）还可以通过旁分泌机制（包括释放外泌体）调节VSMC的行为[6],[7]。

Kruppel样因子4（KLF4）是调控VSMC表型转换的关键转录因子[8]。生物信息学分析预测miR-632能与KLF4的3′非翻译区（3′UTR）结合，实验结果也证实miR-632直接调控KLF4的表达并抑制其活性。然而，在动脉粥样硬化斑块区域的VSMCs中，尽管miR-632水平相对稳定，KLF4的表达却显著上调，表明在病理条件下这一调控轴的功能出现紊乱。值得注意的是，这种“解耦”现象仅在低氧和ox-LDL共同作用或单独低氧条件下的ECs/VSMCs共培养系统中才显现，提示这一过程涉及内皮源性可转移因子。

外泌体是细胞间通讯的重要介质，它们能够促进包括非编码RNA在内的生物活性分子在细胞间的转移[6],[9]。长链非编码RNA（lncRNAs）可作为竞争性内源性RNA（ceRNAs）调节microRNA活性，这可能是内皮源性信号调控VSMC行为的一种机制。为此，系统分析了低氧与正常氧条件下ECs中差异表达的lncRNAs，随后通过ceRNA网络分析识别可能与miR-632相互作用的分子。其中，lncRNA MSTRG.12883.2被确定为潜在的调控分子。进一步研究了其在动脉粥样硬化过程中调节细胞间通讯和VSMC表型转换中的作用。此外，还评估了针对该lncRNA的治疗潜力，包括RNA干扰和抑制外泌体释放等方法，以调控异常的VSMC激活。

部分摘录

细胞培养与处理

原代人主动脉内皮细胞（HAECs）和人主动脉平滑肌细胞（HASMCs）购自ScienCell Research Laboratories（美国加利福尼亚州）。HAECs在添加低血清生长补充剂（LSGS）的M200培养基中培养，HASMCs在添加平滑肌生长补充剂（SMGS）的M231培养基中培养（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州）。共培养实验中，M200和M231按1:1的比例混合。两种贴壁细胞类型均进行传代培养。

轻度低氧促进ox-LDL处理的HASMCs在HAECs介导下从收缩型向合成型的表型转换

qRT-PCR分析显示，在24小时时，HASMCs组、HASMCs+ox-LDL组、HAECs/HASMCs+ox-LDL组以及HAECs/HASMCs+ox-LDL+低氧组之间的α-SMA、Desmin、Vimentin和OPN的mRNA水平无显著差异（所有P>0.05）。48小时后，ox-LDL处理本身并未显著改变这些标志物的表达（所有P>0.05）。然而，在HAECs/HASMCs+ox-LDL+低氧组中，α-SMA的mRNA表达显著下降（P<0.01）。

讨论

动脉粥样硬化（AS）是心血管疾病（CVD）的主要病理基础，随着心血管代谢危险因素的广泛传播以及不良生活方式和环境变化的加剧，其发病率和发病年龄不断提前[1],[3],[5],[7]。AS是一种慢性进行性的血管疾病，其特征是动脉狭窄或闭塞，最终导致心肌梗死、中风等严重心血管和脑血管事件。

作者贡献声明

任奇寅：撰写初稿、方法学设计、实验实施、数据管理。张国新：验证结果、软件开发、实验设计、数据分析。阮鹏：结果验证、实验设计、数据管理。屈乐峰：撰写文本、编辑内容、资源协调、概念构思。沈振伟：撰写文本、编辑内容、数据可视化、结果验证、资源准备。支康康：撰写初稿、资源管理、项目协调、资金申请、概念构思。

资助

本研究得到了国家自然科学基金（NSFC）（编号81971710）和上海2020年“科技创新行动计划”生物医学科技支持专项（编号20S31902000）的资助。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。