利用苹果酒副产物进行微生物发酵：甘露醇生产用低成本培养基的优化

《LWT》：Utilization of Cider By-Products for Microbial Fermentation: Optimization of Low-Cost Culture Media for Mannitol Production

　　

本研究探讨了可持续利用三种苹果酒工业副产物——苹果渣、苹果酒酒泥和腐烂苹果——来开发低成本培养基，用于异型发酵乳酸菌（LAB）发酵生产甘露醇。首先，以苹果渣为基础，补充了酵母提取物和硫酸锰的培养基，有利于本研究使用的细菌种子培养物的生长，从而避免使用商业培养基。其次，由于腐烂苹果汁果糖含量高，被用作甘露醇生产的主要碳源，并补充酵母提取物或苹果酒酒泥作为氮源。48小时后，菌株Fructobacillus fructosus CECT 7088在酵母提取物存在下表现出平均70%的果糖转化率，而菌株CECT 8046（注：摘要此处原文为CECT 8046，但在结果部分与后续讨论中实际使用CECT 8146，此处保留摘要原文）即使在苹果酒酒泥条件下也显示出更高的发酵能力。为了进一步提高生产率，对腐烂苹果汁应用了低温（Cryo-）浓缩，以标准化和提高初始糖水平。使用Leuconostoc mesenteroides CECT 8146和酵母提取物，大约98%的果糖被转化，产生了102.8 ± 1.8 g/L的甘露醇。相比之下，苹果酒酒泥由于其初级氨基态氮（PAN）含量低，未能证明是有效的氮源，这限制了果糖向甘露醇的转化，并导致工艺效率降低。总的来说，这些发现突出了苹果酒副产物（苹果渣和腐烂苹果）作为微生物甘露醇生产底物的潜力，为当前未被充分利用的产品提供了一种循环利用的方法。

一、研究背景与目的

苹果酒酿造产业产生多种被低估的副产物，如苹果渣、发酵酒泥、富含有机物的废水、腐烂损坏的苹果以及发酵过程产生的二氧化碳。在全球倡导循环经济的背景下，这些废弃物若能有效回收、再利用或资源化，将极大提升苹果酒产业的环保与经济效益。甘露醇是一种在食品（如无糖口香糖）和制药等领域有重要应用价值的甜味剂、质构改良剂和填充剂，其全球市场需求不断增长。某些异型发酵乳酸菌（LAB）能以果糖和葡萄糖混合物高效生产甘露醇。然而，传统的甘露醇生产成本较高，需要开发可持续的低成本生产工艺。

目前，苹果渣、腐烂苹果和苹果酒酒泥这三种副产物的利用面临挑战。苹果渣虽有多种用途，但经济价值低（约10欧元/吨）。腐烂苹果因真菌感染存在产真菌毒素棒曲霉素（Patulin）的风险，其处理带来直接经济损失（约20欧元/吨）。苹果酒酒泥则由于开发利用不足，其处理需符合环保法规并产生额外成本。因此，探索将这些副产物转化为高附加值产品（如甘露醇）的途径，对于实现苹果酒产业的可持续发展具有重要意义。

本研究旨在全面评估利用苹果渣、腐烂苹果和苹果酒酒泥开发低成本培养基，用于乳酸菌菌种的扩培和甘露醇的生产，以探索苹果酒副产物资源化管理的可持续替代方案，推进该行业的循环经济实践。

二、主要技术方法概要

本研究主要采用了以下关键技术方法：

1. 1.
   副产物预处理：收集并制备了苹果渣、苹果酒酒泥粉末和腐烂苹果汁（RAJ）。对苹果渣进行自水解和酶（纤维素酶）处理制备苹果渣培养基（APM）；对苹果酒酒泥进行灭菌、超声破碎和冻干制备酒泥培养基（CLM）；对腐烂苹果汁采用低温浓缩（Cryo-concentration）以富集果糖，得到浓缩腐烂苹果汁（RAJ-e）。
2. 2.
   菌株与培养：研究选用两株异型发酵乳酸菌：Fructobacillus fructosus CECT 7088 和 Leuconostoc mesenteroides CECT 8146。种子培养在APM中进行，发酵实验在2升生物反应器中进行，使用RAJ或RAJ-e为碳源，并补充不同氮源（酵母提取物或CLM）及矿物质。
3. 3.
   分析评估：通过酶法、高效液相色谱（HPLC）和光谱分析等多种方法，监测了细菌生长、底物（果糖、葡萄糖）消耗、产物（甘露醇、有机酸、乙醇）生成、氮源（初级氨基态氮PAN、酵母可利用氮YAN）和多酚含量等指标，并测定了终产品的棒曲霉素浓度。通过计算曲线下面积（AUC）、得率、利润因子、生产率、比生长率等参数评估发酵效率。

三、研究结果与讨论

3.1. 苹果渣作为种子培养基

研究人员通过对苹果渣进行预处理和酶水解，获得富含糖分的培养基，但氮含量低。补充0.5 g/L酵母提取物和0.05 g/L硫酸锰后，制得的APM能够支持两株测试菌株（CECT 8146和CECT 7088）达到约8 log₁₀cfu/mL的细胞浓度，这虽低于商业MRS培养基的水平，但已足以作为发酵工艺的种子培养物。数据显示，使用APM替代MRS培养基，理论上可节省约14%的成本。这证实了苹果渣作为低成本、可持续的种子培养基替代品的潜力。

3.2. 苹果酒副产物作为甘露醇生产底物

腐烂苹果汁果糖含量高，其果糖与葡萄糖比例（约3.5:1）高于正常苹果汁。研究发现，以酵母提取物为氮源时，菌株CECT 8146表现出卓越的甘露醇生产能力，在48小时内实现了约92%的果糖转化率和2.3 ± 0.0 g/L·h的高生产率，甘露醇对脂肪族酸（乳酸和乙酸）的比值约为2.2，表明果糖被高效地定向转化为甘露醇。相比之下，以苹果酒酒泥（CLM）为氮源时，尽管CECT 8146仍能发酵，但发酵效率显著降低，这主要归因于CLM中极低的初级氨基态氮（PAN）含量限制了细菌的代谢活性，导致发酵周期延长，甘露醇产量和利润因子下降。研究明确显示，CLM因其氮含量不足，不适合作为该过程的氮源。

为进一步提高产量，研究人员对腐烂苹果汁进行了低温浓缩，以提高初始果糖浓度。当使用浓缩汁（RAJ-e，初始果糖约105 g/L）和酵母提取物时，菌株CECT 8146在168小时内将约98%的果糖转化，甘露醇产量达到102.8 ± 1.8 g/L，利润因子高达99.3 ± 2.5 g/L。值得注意的是，初始棒曲霉素浓度为480.3 μg/kg的浓缩汁，在发酵终点其含量降至检测限（8 μg/kg）以下，表明发酵过程同时实现了毒素脱除。然而，当试图通过进一步提高初始果糖浓度（至约125 g/L）来增加产量时，并未观察到甘露醇合成的改善，反而导致果糖转化不完全，降低了整体工艺效率，表明存在一个最优的初始糖浓度窗口。

四、研究结论与意义总结

本研究结果表明，苹果渣和腐烂苹果可作为微生物生产甘露醇的低成本碳源，在优化条件下可实现高果糖可用性和高效转化。特别是经过低温浓缩的腐烂苹果汁，能够实现果糖含量的标准化，并促进其近乎完全的转化。使用L. mesenteroides CECT 8146菌株可获得高达102.8 ± 1.8 g/L的甘露醇，同时将棒曲霉素含量控制在现行法规限值以下。相比之下，苹果酒酒泥由于其初级氨基态氮含量低，不适合作为氮源，这限制了果糖转化率和整体工艺性能。总而言之，苹果酒副产物的资源化利用为降低腐烂苹果处理成本、提高苹果渣价值提供了可持续的途径。

这项研究为苹果酒行业的废弃物管理提供了创新性的生物技术解决方案，契合循环经济发展理念。相关成果发表在食品科学与技术领域国际期刊《LWT》上。未来研究可致力于优化苹果渣和苹果酒酒泥的水解条件，并通过技术经济分析和生命周期评估来量化所提出的甘露醇生物技术生产路径的经济与环境效益。