在鼠模型中，将壳聚糖-唾液酸配制剂通过鼻腔给药可以降低病毒性呼吸道感染的风险

《Materials & Design》：Nasal application of a chitosan-sialic acid formulation mitigates the risk of viral respiratory infections in mouse model

　　 Ting Cao | Xinxia Gu | Jun Mou | Meiling Sun | Shaohua Guo | Chunxu Huang | Yilin Zhang | Jiangshan Ouyang | Hanfei Gu | Zhiming Hu | Wenlong Chen | Shuixian Zhang | Jie Liu
四川大学华西医学院西华医院包虫病与分子免疫学实验室，成都610041，中国

摘要
呼吸道病毒感染对公共卫生构成了重大威胁。虽然疫苗和抗病毒疗法在预防和治疗这些感染方面效果显著，但它们在疗效、安全性和患者依从性方面存在挑战。黏膜屏障是经过进化形成的天然防御系统，黏液在阻止病原体入侵中起着关键作用。维持呼吸道黏液的完整层是补充疫苗的有效且便捷的措施。壳聚糖是一种来自天然来源的碱性多糖，对人体具有生物相容性和安全性。其带正电的氨基团以及在酸性条件下聚合的能力使其具备用于黏膜涂层的粘附特性。多种病毒常利用唾液酸作为进入宿主细胞的结合位点，当唾液酸附着在壳聚糖聚合物上时，可以起到诱饵受体的作用。本文介绍了一种壳聚糖-唾液酸复合物（CS），它能够阻止流感病毒和呼吸道合胞病毒附着并进入易感细胞。将这种复合物应用于小鼠鼻腔可降低病毒感染风险并预防肺部炎症。这些结果证明了CS作为黏液类似物和预防多种上呼吸道感染的通用预防剂的潜力。

1. 引言
由各种病原体引起的呼吸道感染对公共卫生构成严重威胁。2025年报道最频繁的病原体是流感病毒、呼吸道合胞病毒（RSV）和SARS-CoV-2 [1]。传统的预防措施是接种疫苗。尽管疫苗通常有效且安全，但其策略在疗效、覆盖范围、延迟保护、不良反应和物流困难等方面面临挑战 [2], [3]。抗病毒化疗有可能减少病毒释放、减轻疾病严重程度和并发症，并缩短恢复时间。然而，大多数抗病毒药物的效果参差不齐，作用窗口狭窄，且只能覆盖有限的病原体范围。此外，疫苗和药物的给药方式（尤其是肌肉注射）也存在显著的物流挑战。例如，肌肉注射具有侵入性，存在刺激、疼痛和安全问题 [6]，需要前往医院或诊所，并需要受过培训的医疗专业人员，这限制了可及性和患者依从性。这些挑战使得疫苗接种计划变得复杂，并阻碍了大规模免疫工作的推进 [7]。人们一直在寻找一种方便且有效的应对广泛呼吸道病原体的方法。

气道是呼吸道病原体的入口，呼吸道上皮细胞容易受到大多数病原体的侵袭 [8], [9]。因此，保护这些细胞对于拦截呼吸道感染的发病至关重要。黏液层是一种粘稠的凝胶状层，覆盖在呼吸道上皮表面，提供了抵御病原体入侵的第一道物理和生化屏障 [10], [11]。该层是一个高度水化的聚合物网络，主要由分泌的黏蛋白组成，黏蛋白是高度糖基化的凝胶形成蛋白 [11], [12]。黏蛋白是复杂的O-连接糖蛋白，其特征是在肽骨架末端存在糖基团，如唾液酸、岩藻糖和半乳糖 [13]。这些黏蛋白糖蛋白大约占黏液总质量的70–80%，并显著影响黏液的物理特性及其在先天气道防御中的作用 [13], [14], [15]。黏液层通过阻止病原体入侵、捕获病原体、促进黏液纤毛清除以及利用其效应分子抑制病原体复制来提供保护 [16]。当屏障被破坏时，上皮细胞会直接暴露于病原体之下，从而易受感染 [17]；而维持或恢复黏液层的完整性则可以降低病毒性呼吸道感染的风险 [18]。

壳聚糖是一种从几丁质衍生的多糖。这种线性生物聚合物由两种单体组成：2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（N-乙酰-葡糖胺，GlcNAc）和N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-D-葡萄糖（葡糖胺，GlcN），通过β-1,4-糖苷键连接 [19], [20]。其氨基（–NH2）和羟基（–OH）团使其在酸性条件下能够质子化并具有溶解性 [20]，同时通过众多分子间和分子内氢键形成网络结构 [20], [21], [22]。作为一种天然产物，壳聚糖具有适合人体使用的关键特性，特别适合用于黏膜应用。其生物相容性和可降解性使其无毒性、耐受性良好，并能在人体内降解 [23]。正电荷使其能够与带负电的黏液表面相互作用 [19], [20]。据报道，壳聚糖可以刺激成纤维细胞增殖和胶原蛋白沉积，从而促进组织再生和伤口愈合 [24]；此外，壳聚糖还表现出抗菌活性 [25] 和免疫调节作用，通过增强巨噬细胞激活和细胞因子产生 [26]，因此在医疗、制药、食品和化妆品领域有广泛应用 [25], [27], [28], [29], [30]。唾液酸是一类单糖家族，常见于唾液、大脑和各种哺乳动物细胞中 [31]，对黏蛋白的生化和物理性质有贡献 [32]。在人类中最为常见的是N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac），它具有四个突出功能团：C2位置的羧基、C4位置的羟基、C5位置的乙酰氨基以及类似甘醇的功能团（C7、C8和C9位置的羟基）[33]。多种病毒（包括流感病毒 [34]、呼吸道合胞病毒（RSV）[35]、SARS-CoV-2 [36], [37]、腺病毒 [38], [39]、偏肺病毒 [40]、鼻病毒 [41] 和副流感病毒 [42]）常利用唾液酸作为进入受体。例如，流感A型血凝素（HA）[34]、SARS-CoV-2刺突蛋白 [43], [44], [45] 和腺病毒37型纤维突起 [46] 均被报道能与Neu5Ac结合。因此，唾液酸被用作诱饵来捕获病毒颗粒并释放易受攻击的宿主细胞 [47], [48]。据报道，带负电的唾液酸可以通过电荷吸引和氢键与壳聚糖相互作用 [19], [20], [49]。壳聚糖的C3和C6位置的羟基以及C5位置的氨基 [50]，以及唾液酸的C5位置的羟基和C8位置的氨基 [50] 都是易于形成分子间氢键的活性位点 [51]。壳聚糖和唾液酸的结合凭借其独特的物理和生化特性，具有作为黏液类似物增强黏膜防御的潜力。

在本研究中，我们通过将唾液酸与壳聚糖聚合物骨架结合制备了壳聚糖-唾液酸复合物（CS），然后表征了该复合物的物理和生化特性，并评估了其防止流感病毒和RSV附着、进入和复制的能力。我们还评估了CS在保护小鼠免受感染及随后的肺部炎症方面的效果。结果表明，CS可能成为一种通用预防剂，能够降低上呼吸道感染的风险。

2. 结果
2.1. 壳聚糖聚合和壳聚糖-唾液酸复合物的形成
在酸性条件下，壳聚糖分子C5位置的氨基（–NH2）从醋酸的羧基（–COOH）获得一个质子（H+），形成–NH3+。这种质子化使多糖链展开、膨胀，并变得水溶和可溶。带电且溶解的多糖链通过壳聚糖链（–NH3+）之间的静电相互作用以及壳聚糖主链上的羟基（–OH）与未质子化的胺之间的氢键相互连接。此外，乙酰化单元（N-乙酰-葡糖胺）之间也存在疏水相互作用。唾液酸通过与质子化壳聚糖的COO?基团和–NH3+基团之间的分子间静电相互作用以及–OH和氨基之间的氢键结合，形成了壳聚糖-唾液酸复合物（CS）（图1a和1b）。我们制备了一系列不同C/S比例的CS（CxSy），其中x = 1、2、2.5、3和4 mg/mL，S = 1 mg/mL。

2.2. CxSy的物理特性
傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示，CxSy的大小与壳聚糖浓度（1至4 mg/mL）之间存在相关性。在壳聚糖浓度为1至2.5 mg/mL时，尺寸增加最为明显，并在2.5 mg/mL时达到峰值。唾液酸的结合对CxSy的大小影响有限，仅比单独使用壳聚糖略有增加（图2a）。CS制剂的粒径和多分散指数（PDI）详见补充表1。随着壳聚糖比例的增加，粒径从1576 ± 739 nm增加到3771 ± 358 nm。PDI的范围为0.34 ± 0.03至0.52 ± 0.01，反映了高分子量壳聚糖复合物典型的中等异质性。Zeta电位分析显示，酸性溶液中的壳聚糖带正电，而唾液酸带负电。由于电荷中和，CxSy的正电荷略有减少，但这些变化不具有统计学意义（图2b）。

2.3. CxSy的细胞毒性、效力和安全性
为了评估CxSy的细胞毒性，我们在维持x:y = 2.5:1（mg/mL）的质量比的条件下，用不同浓度的壳聚糖和唾液酸培养MDCK和HEp-2细胞。24小时后，使用C2.5S1、C2S0.8和C1S0.4浓度组合，MDCK和HEp-2细胞的存活率均超过90%（图4a）。下载：下载高分辨率图片（1MB）下载：下载全尺寸图片。

图4. CS复合物的效力、细胞毒性和安全性。(a) MDCK和HEp-2细胞被接种在12孔板中并培养过夜。将CS复合物（CxSy，x = 1.0、2.0、2.5、3.0和4.0；y = 0.4、0.8、1.0、1.2和1.6；x和y分别代表CS复合物溶液中的质量浓度（mg/mL）加入板中以替换原始培养基。将板在37°C和5% CO2条件下培养24小时。使用Cell Titer 96 Aqueous One Solution细胞增殖测定试剂盒评估细胞存活率。点线表示90%的细胞存活率。(b) MDCK和HEp-2细胞被接种在96孔板中并培养过夜。将CS复合物（CxSy，x = 1.0、2.0和2.5；y = 0.4、0.8和1.0；x和y代表质量浓度（mg/mL）加入板中以替换原始培养基。将板在37°C和5% CO2条件下培养1小时。分别向MDCK和HEp-2细胞中加入100 μL的APR8和RSV，感染比为0.2 MOI。受感染的细胞在37°C和5% CO2条件下培养72小时。用q-PCR检测上清液中的病毒拷贝数。(c) 小鼠每天鼻内给予50 μL的CS复合物（C2.5S1），持续2天。使用生理盐水作为对照。每天监测体重，并将其表示为给予CS复合物（C2.5S1）前第0天的体重的百分比。(d) 在第10天收集(c)中的肺部和鼻甲组织。用H&E对组织样本进行染色，并在显微镜下观察。所示切片代表每组的五个动物。数据以平均值±标准差表示（n = 每组5次重复）。

为了评估阻断病毒感染的效力，分别用C2.5S1、C2S0.8或C1S0.4处理MDCK和HEp-2细胞。然后用APR8或RSV以0.2的感染比率（MOI）感染这些细胞。72小时后，收集细胞培养上清液并用q-PCR检测病毒拷贝数。通过比较有无CxSy时的病毒RNA拷贝数来评估对病毒复制的抑制作用。我们的数据显示，C2.5S1处理使APR8和RSV的RNA拷贝数减少了90%以上（图4b），表明C2.5S1在保护细胞免受病毒感染方面具有最大的效力。因此，选择C2.5S1进行进一步评估，并简称为CS以便于识别。

为了评估C2.5S1对哺乳动物的安全性，每天鼻内给予小鼠50 μL的C2.5S1，持续2天。使用50 μL的生理盐水作为对照。连续10天每天监测体重，并在第10天收集鼻甲和肺部组织进行组织病理学分析。数据显示，接受C2.5S1处理的小鼠体重与对照组相似（图4c）。组织切片研究表明，接受C2.5S1处理的小鼠的肺泡、间质、细支气管和血管组织以及鼻腔上皮层的组织学特征与接受生理盐水处理的小鼠相似，没有明显的结构变化或炎症浸润（图4d）。

2.3. CS在细胞培养中阻断病毒附着、进入和复制

为了探索C2.5S1在阻断病毒附着方面的效力，首先用C2.5S1预处理MDCK和HEp-2细胞，然后在4°C下以0.2 MOI感染这些细胞2小时。用生理盐水预处理并感染相同病毒的细胞作为对照。之后收集细胞，清洗并用荧光标记的抗APR8 HA和抗RSV抗体进行染色。如图5a所示，使用流式细胞仪评估抗体结合细胞的频率。我们的数据显示，在10和100 MOI下，80.13%的C2.5S1预处理过的MDCK细胞被APR8附着，而未预处理过的细胞中有88.67%被APR8附着。在10和100 MOI下，C2.5S1预处理过的HEp-2细胞中有3.22%被RSV附着，而未预处理过的细胞中有22.33%被RSV附着（图5b和c）。

图5. CS复合物保护细胞免受病毒附着、进入和复制。(a) 评估病毒附着于细胞的示意图。将CS复合物（C2.5S1）或生理盐水加入MDCK和HEp-2细胞中，并在37°C和5% CO2条件下培养1小时。然后在4°C下分别用APR8和RSV感染细胞2小时。收集细胞并用荧光标记的抗APR8 HA和抗RSV抗体进行染色。使用流式细胞术评估细胞的荧光强度。(b) 用流式细胞术评估APR8附着的MDCK细胞和RSV附着的HEp-2细胞的门控策略。(c) APR8附着的MDCK细胞和RSV附着的HEp-2细胞的百分比。(d) 评估病毒进入和复制于细胞的示意图。将CS复合物（C2.5S1）、几丁质、唾液酸或生理盐水分别加入MDCK和HEp-2细胞中。然后在37°C和5% CO2条件下用APR8和RSV感染细胞72小时。收集培养上清液，用q-PCR和Reed-Muench算法方法评估病毒拷贝数和TCID50。(e) APR8和RSV的病毒拷贝数和TCID50。数据以平均值±标准差表示（n = 每组3次重复），并用单因素方差分析进行分析。

为了探索C2.5S1在阻断病毒进入和复制方面的效力，先用C2.5S1预处理MDCK和HEp-2细胞，然后在37°C下用APR8和RSV以0.2 MOI感染这些细胞1小时。分别用几丁质、唾液酸或生理盐水处理的细胞作为对照。感染后，清洗细胞并在新鲜培养基中继续培养72小时。收集培养上清液，用q-PCR和Reed-Muench算法方法评估病毒拷贝数和TCID50。我们的数据显示，用唾液酸或生理盐水预处理的MDCK细胞的上清液中的APR8 RNA拷贝数为1.1×10^7和1.2×10^7拷贝/μL，感染滴度分别为10^3.5和10^3.4 TCID50/mL；而用C2.5S1和几丁质预处理的细胞的上清液中的APR8 RNA拷贝数为5.2×10^2拷贝/μL，感染滴度分别为10^1.2和10^4 TCID50/mL。用唾液酸和生理盐水预处理的HEp-2细胞的上清液中的RSV RNA拷贝数为3.9×10^5和4.4×10^6拷贝/μL，感染滴度分别为10^5.2和10^5.4 TCID50/mL；而用C2.5S1和几丁质预处理的细胞的上清液中的RSV RNA拷贝数为4.3×10^3拷贝/μL，感染滴度分别为10^3.7和10^4.6 TCID50/mL（图5e）。与生理盐水相比，唾液酸预处理对减少APR8和RSV的RNA拷贝数和TCID50没有影响，而C2.5S1和几丁质处理显著减少了RNA拷贝数和TCID50，其中C2.5S1的效果最好。数据表明C2.5S1在减少病毒感染力和阻断病毒复制方面具有最大的效力。

2.4. C2.5S1在小鼠模型中缓解病毒性呼吸道感染

为了评估C2.5S1在缓解病毒性呼吸道感染方面的效力，每天鼻内给予BALB/c小鼠50 μL的C2.5S1，持续2天。用生理盐水处理的小鼠作为对照。在第二剂后1小时，分别在麻醉状态下鼻内给予小鼠25 μL的APR8或50 μL的RSV。连续10天每天监测体重变化，或在感染后4小时或4天处死小鼠，以评估病毒载量和进行鼻甲和肺部组织的组织病理学检查。实验方案如图6a所示。我们的数据显示，在APR8攻击后，接受C2.5S1处理的小鼠仅有轻微的体重下降，与未感染组相比统计学上不显著。相比之下，接受生理盐水处理的小鼠表现出明显的体重下降和疾病症状，如蜷缩、不活跃和毛丝竖立。在C2.5S1复合物组中未观察到这些疾病症状。在接受RSV攻击的小鼠中，我们没有观察到体重或行为的显著变化，因为RSV对小鼠不具传染性，且剂量不足以使病毒到达下呼吸道（图6b）。

图6. CS复合物在小鼠模型中预防呼吸道病毒感染。(a) 评估CS复合物（C2.5S1）保护小鼠免受呼吸道病毒感染的示意图。每天鼻内给予小鼠50 μL的CS复合物（C2.5S1），持续2天。然后在麻醉条件下鼻内给予25 μL的2.8×10^2 PFU的APR8和50 μL的3.5×10^6 PFU的RSV。连续10天每天监测体重变化，或在感染后4小时或4天处死小鼠，以评估病毒载量和进行鼻甲和肺部组织的组织病理学分析。(b) 体重变化表示为感染前体重的百分比。(c) 通过q-PCR在感染后4小时和4天评估鼻甲和肺部的病毒拷贝数。数据代表两个独立实验（n = 每组5次重复），并用双尾学生t检验进行分析。

为了验证APR8和RSV攻击模型，我们在感染后第10天检测血清中的病毒特异性抗体。数据显示，接受生理盐水处理的小鼠的APR8和RSV特异性抗体水平升高，而接受C2.5S1处理的小鼠仅轻微升高。在没有C2.5S1的情况下，APR8和RSV的抗体水平升高具有统计学意义（图S1）。这些结果表明病毒攻击的有效性和C2.5S1在缓解呼吸道病毒感染方面的有效性。

我们评估了感染后4小时和4天收集的鼻甲和肺部中的病毒RNA载量。我们的数据显示，接受C2.5S1处理的小鼠的呼吸道组织中的APR和RSV RNA拷贝数比接受生理盐水处理的小鼠低3-16倍（图6c）。免疫组化检查显示，接受C2.5S1处理并攻击APR8和RSV的小鼠的鼻甲中表达病毒抗原的上皮细胞很少。相比之下，接受生理盐水处理的小鼠的鼻甲中表达APR8和RSV抗原的细胞较多（图7a）。此外，接受C2.5S1处理并攻击APR8和RSV的小鼠的肺部中表达病毒抗原的细胞较少。相反，接受生理盐水处理的小鼠的肺部中表达APR8和RSV抗原的细胞较多（图7b）。使用ImageJ软件版本6.0量化鼻甲和肺部中病毒抗原的荧光强度，并在图7c中进行比较，结果显示接受C2.5S1处理的小鼠的呼吸道组织中APR8和RSV抗原的表达水平显著降低。组织学检查显示，接受C2.5S1处理的小鼠的鼻甲具有完整的上皮屏障结构，即使在APR8和RSV攻击下也没有明显的细胞脱落。相反，接受生理盐水处理的小鼠的鼻甲具有受损的上皮屏障结构，且在上呼吸道病毒攻击时有严重的上皮细胞脱落（图7d）。此外，接受C2.5S1处理并攻击APR8（但不包括RSV）的小鼠的肺部显示出完整的肺泡、间质和细支气管结构以及血管，且炎症细胞浸润较少。而在接受生理盐水处理并攻击APR8和RSV的小鼠中，肺部的肺泡、间质和细支气管结构受损，且有炎症细胞聚集（图7d）。鼻甲和肺组织分别在感染后4小时和4天被收集，如图6（a）所示，然后用H&E染色和荧光标记的抗-HA或抗-RSV抗体进行染色，并在显微镜下分析。（a）鼻甲的典型组织病理学。（b）肺的典型组织病理学。（c）使用Image-J软件评估鼻甲和肺中荧光标记的抗-HA和抗-RSV抗体的荧光强度。数据以平均值±标准差（每个组n=5个重复样本）显示，并使用双尾学生t检验进行分析。（d）鼻甲和肺的典型组织病理学。

3. 讨论
我们开发了一种壳聚糖-唾液酸配方（CS），其理化特性与呼吸道黏液相似，通过将壳聚糖聚合成多糖链网络，并通过静电相互作用和氢键将唾液酸连接到网络支架上来实现。这种CS复合物被设计用于作为人类鼻腔的物理屏障。聚合的壳聚糖形成支架，而连接的唾液酸则充当诱饵受体。这种物理屏障可以阻止病毒进入细胞，从而阻止感染的发生。CS配方的制备pH值为5.4，以匹配鼻黏膜的pH值。我们发现，壳聚糖浓度≤2.5 mg/mL和唾液酸浓度≤1.0 mg/mL时对哺乳动物细胞没有细胞毒性，且质量比为2.5:1（C2.5S1）的配方在保护易感细胞免受APR8和RSV感染方面最有效。该配方与呼吸道黏膜和肺组织相容，适合鼻内应用。当涂覆在细胞表面时，CS可以阻止流感病毒（APR8株）和RSV（A2株）附着和进入培养中的易感细胞，从而阻止随后的病毒复制和细胞病变。当预防性地施用于小鼠模型的鼻腔时，CS增强了黏液屏障，降低了呼吸道感染的风险。病毒感染后，小鼠的鼻腔和肺组织中的病毒载量减少，鼻部和肺部炎症轻微或最小，病毒特异性抗体的升高也有限。因此，小鼠保持了体重，没有表现出任何疾病迹象。这些结果表明CS作为上呼吸道感染通用预防剂的潜力。

保护作用归因于CS增强了鼻腔黏液的屏障功能，截留了APR8和RSV，从而阻止它们进入气道上皮。CS具有与哺乳动物黏液相似的物理和生化特性。壳聚糖是一种线性多糖，由β-(1,4)-连接的D-葡糖胺（去乙酰化单元）和N-乙酰-D-葡糖胺（乙酰化单元）组成，其特征是葡糖胺单元上丰富的游离氨基（–NH2）。在酸性介质中，氨基团从乙酸中接受一个质子（H+），转化为带正电的铵基团（–NH3+），使多糖链呈现多电荷状态。强烈的静电排斥作用使多糖链从紧凑状态展开为扩展状态。多电荷链还通过离子-偶极相互作用与水分子结合，变得水合和可溶。带电的多糖链在水介质中相互连接，形成水合网络结构[52]，[53]。这些交联主要通过带正电的壳聚糖链（–NH3+）与带负电离子之间的静电相互作用、壳聚糖主链上的羟基（–OH）与未质子化的氨基之间的氢键以及乙酰化单元（N-乙酰-葡糖胺）之间的疏水相互作用来实现。随着这些交联在多糖链之间形成，连续的网络结构得以建立。这种网络结构在其孔隙中捕获大量水分，形成粘弹性、粘附性和凝聚性的水凝胶。该网络结构不仅可以捕获病原体颗粒，还为唾液酸提供附着点。唾液酸是黏液的关键成分，主要作为寡糖链末端的糖类，装饰黏蛋白糖蛋白。除了在黏液的化学物理性质中的作用外，唾液酸还作为诱饵吸引呼吸道病原体。许多病毒和细菌利用唾液酸作为受体附着并侵入宿主细胞，包括流感病毒[34]、RSV[35]、SARS-CoV-2[36]、[37]、腺病毒[38]、[39]、副流感病毒[40]、鼻病毒[41]、铜绿假单胞菌[54]和肺炎链球菌[55]。在CS中，带负电的唾液酸通过去质子化的羧基（COO?）与带正电的壳聚糖之间的静电相互作用以及两种分子上的羟基（–OH）之间的氢键结合，加入到广泛的网络中。我们的FTIR光谱和Zeta电位数据揭示了两种分子之间存在氢键和静电相互作用。此外，唾液酸的N-乙酰基团和壳聚糖中的乙酰化单元的甲基也提供了有助于壳聚糖-唾液酸形成的疏水斑块[56]。壳聚糖上丰富的自由漂浮唾液酸作为分子诱饵，与病原体结合，防止它们到达上皮表面[34]，[43]，[44]，[45]，[46]。被捕获的病原体最终通过黏液纤毛清除[16]。我们数据显示，感染后小鼠模型中的病毒载量减少，呼吸道炎症轻微，对病毒的免疫反应温和，表明CS作为上呼吸道感染通用预防剂的有效性。

保护作用归因于CS增强了鼻腔黏液的屏障功能，截留了APR8和RSV，从而阻止它们进入气道上皮。CS具有与哺乳动物黏液相似的物理和生化特性。壳聚糖是一种线性多糖，由β-(1,4)-连接的D-葡糖胺（去乙酰化单元）和N-乙酰-D-葡糖胺（乙酰化单元）组成，其特点是葡糖胺单元上丰富的游离氨基（–NH2）。在酸性介质中，氨基团从乙酸中接受质子（H+），转化为带正电的铵基团（–NH3+），使多糖链呈现多电荷状态。强烈的静电排斥作用使多糖链从紧凑状态展开为扩展状态。多电荷链还通过离子-偶极相互作用与水分子结合，变得水合和可溶。带电的多糖链在水介质中相互连接，形成水合网络结构[52]，[53]。这些交联主要通过带正电的壳聚糖链（–NH3+）与带负电离子之间的静电相互作用、壳聚糖主链上的羟基（–OH）与未质子化的氨基之间的氢键以及乙酰化单元（N-乙酰-葡糖胺）之间的疏水相互作用来实现。随着这些交联在多糖链之间形成，连续的网络结构得以建立。这种网络结构在其孔隙中捕获大量水分，形成粘弹性、粘附性和凝聚性的水凝胶。这种网络结构不仅可以捕获病原体颗粒，还为唾液酸提供附着支架。唾液酸是黏液的关键成分，主要作为装饰黏蛋白糖蛋白的寡糖链上的末端糖类。除了在黏液化学物理性质中的作用外，唾液酸还作为诱饵吸引呼吸道病原体。许多病毒和细菌利用唾液酸作为受体附着并侵入宿主细胞，包括流感病毒[34]、RSV[35]、SARS-CoV-2[36]、[37]、腺病毒[38]、[39]、副流感病毒[40]、鼻病毒[41]、铜绿假单胞菌[54]和肺炎链球菌[55]。在CS中，带负电的唾液酸通过去质子化的羧基（COO?）与带正电的壳聚糖之间的静电相互作用以及两种分子上的羟基（–OH）之间的氢键结合，加入到广泛的网络中。我们的FTIR光谱和Zeta电位数据揭示了两种分子之间存在氢键和静电相互作用。此外，唾液酸的N-乙酰基团和壳聚糖中的乙酰化单元的甲基也提供了有助于壳聚糖-唾液酸形成的疏水斑块[56]。壳聚糖上丰富的自由漂浮唾液酸作为分子诱饵，与病原体结合，防止它们到达上皮表面[34]，[43]，[44]，[45]，[46]。被捕获的病原体最终通过黏液纤毛清除[16]。我们在储存条件下监测了CS配方的稳定性一年，没有发生沉淀，pH值或物理化学外观也没有变化。此外，CS配方在储存一年后仍保持其功能性。这些结果表明，CS配方在物理和功能上至少稳定一年。

CS预防措施的优势在于它与宿主黏液层结合形成连续的物理屏障。与大多数疫苗不同，其有效性不依赖于识别特定抗原，而是通过机械增强黏膜屏障来阻挡和捕获所有吸入的颗粒，包括病原体和刺激物[16]，[18]。这种屏障保护是普遍的，不受覆盖范围或病原体变种的限制[57]。这种非特异性和静态障碍不针对特定的病原体分子，也不偏爱具有改变的抗原性或毒力因子的突变体。相反，物理屏障施加了普遍的生存压力。与疫苗不同，疫苗施加的目标性和抗原特异性免疫压力是免疫逃逸突变的主要因素[58]，而CS屏障不会促进免疫原性、毒力和抗性突变的产生。一旦应用于黏膜层，CS屏障立即提供保护。这种预先部署的自然防御在疫苗诱导的适应性免疫出现之前提供即时的先天保护[57]。这种快速建立的防御减少了病原体侵入、潜伏和传播的可能性，从而在疫情早期阶段阻止疾病的传播。它还为疫苗开发、实施和诱导免疫提供了关键的时间窗口。在大流行期间，当出现新型大流行病原体且人群中尚无群体免疫力且疫苗仍在研发时，这一点尤为重要。由于CS的便利性和低成本，它可以轻松扩大规模，比传统的疫苗接种活动更快地提供群体层面的完整性和有效性。其分发和应用不需要复杂的供应链、冷链存储或专业的医疗人员[59]，[60]。接受者不需要访问授权机构，且应用不会引起任何刺激、疼痛或外观改变，不像口罩。CS预防措施在人群中的有效性因其便利性和易于遵守而得到推广。

CS是人类应用的安全预防剂。其安全性基于其成分壳聚糖和唾液酸的生物学特性。壳聚糖是一种来自天然来源的阳离子多糖[20]。当应用于呼吸道黏膜层时，CS通过黏液纤毛运动被清除，要么被吞咽进入消化道，要么通过咳嗽或打喷嚏排出[16]。在肠道中，壳聚糖被溶菌酶、几丁质酶和壳聚糖酶降解，这些酶常见于人体，并由各种微生物如拟杆菌和链霉菌产生[61]，[62]，[63]。这种消化作用切割了壳聚糖分子D-葡糖胺主链中的β-1,4-糖苷键，将其分解为无毒的寡糖，主要是N-乙酰-葡糖胺和D-葡糖胺[64]。N-乙酰-葡糖胺由所有人体组织中存在的N-乙酰-葡糖胺激酶代谢，而D-葡糖胺则通过糖胺聚糖或糖酵解代谢途径中的己糖激酶代谢[65]，[66]。壳聚糖被认为是一种普遍安全的材料，并已被美国食品药品监督管理局（FDA）批准为食品添加剂[67]，主要用作食品工业中的乳化剂、澄清剂、增稠剂和稳定剂。关于壳聚糖口服给药的研究显示，即使成人每天摄入2.5克，连续4天也没有不良影响[68]。壳聚糖还以其优异的生物相容性而闻名。它已用于各种给药途径的药物治疗，包括口服、外用、肠外和眼用，能够促进药物的可控释放[67]。例如，它被用于伤口敷料，在皮肤伤口上形成黏附屏障以止血，其阳离子性质吸引并交联带负电的红细胞，促进止血和伤口愈合[69]，[70]。壳聚糖还与明胶-甘油磷酸盐配制成制剂，用于治疗青光眼，其中壳聚糖的多电荷基团与眼前部黏膜表面的带负电唾液酸相互作用，增强活性成分通过角膜膜进入眼后段的保留和渗透[71]，[72]。唾液酸是一类九碳糖和神经氨酸衍生物，存在于所有脊椎动物组织（包括人类组织）的糖脂和糖蛋白末端[36]，[37]，[73]。来自食物来源的外源性唾液酸如寡糖、糖蛋白和神经节苷脂被细菌唾液酸酶和N-乙酰神经酰胺酶消化，并在胃肠道系统中吸收[74]，[75]。它们已被美国FDA批准在婴儿配方中以0.3–0.5克/升的浓度使用[76]。游离的唾液酸可以通过粪便或尿液排出[77]，或者作为生物合成的底物转移到细胞内。一旦进入细胞，唾液酸被唾液酰转移酶利用来合成神经节苷脂，并由多唾液酰转移酶催化形成多唾液酸（polySia）。例如，在神经细胞中，神经节苷脂和polySia对于细胞迁移、神经突起、分支、神经元路径寻找、再生和突触可塑性等细胞过程至关重要[78]。我们的安全性评估显示，壳聚糖与呼吸道黏膜和肺组织具有优异的生物相容性，几乎没有细胞毒性，在哺乳动物模型中没有急性毒性。其在动物模型中的有效性和安全性表明了CS作为上呼吸道感染通用预防剂的潜力。

我们的研究存在一些局限性。1. 我们没有定量检测CS在鼻腔中的覆盖范围。这可以通过标记壳聚糖主链并进行125I和SPECT/CT扫描来实现[79]。然而，技术挑战在于在保持阳离子电荷和黏附特性的同时进行位点特异性标记。2. 我们通过鼻内接种而不是气溶胶暴露来挑战小鼠，后者在临床上更为相关，但需要专门的腔室、精密雾化器和连续的颗粒监测。维持均匀的颗粒大小、恒定的湿度和稳定的流速是具有挑战性的。这些因素的任何变化都会影响吸入剂量和测试的可重复性[80]。3. 我们没有检测CS的保护持续时间，这是确定应用方案的关键因素。后续的实验室测试和临床试验将优先在人类受试者中进行这项检测，旨在将CS预防措施转化为呼吸道感染预防策略。4.在本研究的范围内，我们测试了壳聚糖（CS）作为预防剂针对流感APR8株和RSV A2株的有效性，并推测基于其物理阻断和捕获的机制，CS对其他呼吸道病原体也具有类似的效果。需要进一步的研究来测试其对包括细菌在内的其他常见呼吸道病原体的有效性。尽管如此，我们已经验证了增强先天黏膜屏障以保护呼吸道的概念，并开发了一种壳聚糖配方作为预防剂，以降低小鼠模型中病毒性呼吸道感染的风险。5. 使用唾液酸作为诱饵受体来捕获病毒颗粒的想法是理论上的。这一假设得到了大量研究和出版物的支持，这些研究表明许多病毒，包括流感病毒、RSV、SARS-CoV-2和腺病毒，都利用唾液酸作为进入易感细胞的受体。我们认识到直接研究病毒颗粒与其天然形式下的唾液酸之间的相互作用存在技术挑战，需要进一步的研究来确认这一假设。6. 可收集的小鼠呼吸道黏液的体积极其有限（通常少于一微升），这不足以满足需要毫升级样本的经典流变学测量要求。

**材料与方法**

4.1. 细胞、病毒、小鼠和试剂
Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞购自BeNa Culture Collection（中国）；Hep-2细胞、流感H1N1病毒A/Puerto Rico/8/34株（APR8）和呼吸道合胞病毒A2株（RSV）由美国国立卫生研究院（NIH）提供。MDCK细胞和Hep-2细胞在添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Gibco，美国）中培养。6至8周大的无特定病原体的雌性BALB/c小鼠购自成都Dossy Experimental Animals（中国）。这些小鼠在四川大学西华医院实验动物中心的无病原体条件下饲养，没有交叉通风。所有小鼠都能自由获取水和标准饲料，并在12小时光/暗循环的气候控制笼子中保持。

4.2. 壳聚糖复合物的制备
将0.4克壳聚糖（CAS#: 9012-76-4，德国Merck）溶解在100毫升0.5%醋酸（CAS#: 64-19-7，中国成都Kelong Chemical）中，不断搅拌直至完全溶解。使用2M NaOH溶液（CAS#: 1310-73-2，中国成都Kelong Chemical）将溶液的pH值调整至5.4。按照指定的比例向质子化的壳聚糖溶液中添加唾液酸（CAS#: 131-48-6，德国Merck），制备不同壳聚糖和唾液酸比例的壳聚糖-唾液酸（CS）复合物，表示为CxSy（如C1S1、C2S1、C2.5S1、C3S1、C4S1、C4S1.6、C3S1.2、C2S0.8、C1S0.4），其中x和y代表CS复合物溶液中各自的浓度（质量单位）。

4.3. 动态光散射分析
将CxSy、壳聚糖和唾液酸样品在25°C下制备，并转移至无气泡形成的比色皿中。将比色皿放入NanoBrook Omni Dynamic Light Scattering（美国Brookhaven）分析仪中，按照仪器指令分析尺寸分布和ζ电位。

4.4. 傅里叶变换红外光谱
将CxSy和壳聚糖样品用Alpha 1–2 LD Plus真空冷冻干燥机（德国Marin Christ）冻干，与高纯度KBr粉末（CAS#: 7758-02-3，中国成都Kelong Chemical）混合，在25°C下形成透明均匀的薄片，然后用VERTEX 70v光谱仪（德国Bruker）在水平衰减全反射（HATR）模式下进行分析，按照仪器指令进行操作。傅里叶变换红外光谱的波长范围为400至4000 cm?1，分辨率为4 cm?1。

4.5. 扫描电子显微镜
将CxSy和壳聚糖样品用Alpha 1–2 LD Plus真空冷冻干燥机冻干，然后涂覆金溅射层，在10.5毫米的工作距离和10千伏的加速电压下用扫描电子显微镜（SEM，Inspect FEI，美国）观察。

4.6. 细胞活力测定
将MDCK和Hep-2细胞以每孔1×10?个细胞的密度接种在96孔板中，并在添加了10% FBS的DMEM高糖培养基中培养过夜。将含有CS复合物（C4S1.6、C3S1.2、C2.5S1、C2S0.8和C1S0.4）的100 μL DMEM高糖培养基加入孔中，替换原有的培养基。将板子在37°C和5% CO?条件下再培养24小时。细胞活力使用Cell Titer 96 Aqueous One Solution细胞增殖测定试剂（MTS，Promega，美国）进行评估。具体操作为：向每个含有100 μL细胞样本的孔中加入20 μL Cell Titer 96 Aqueous One Solution试剂，然后在37°C和5% CO?条件下培养2小时。使用Spectramax i3X微孔板读数器（Molecular Devices，美国）在490 nm处测量光密度。细胞活力计算公式为：活力（%）= [(At ? Ab) / (Ac ? Ab)] × 100%，其中At为CxSy处理组的OD490；Ac为未处理MDCK或Hep-2细胞的OD490；Ab为无细胞的DMEM培养基的OD490。

4.7. 体外病毒复制
将MDCK和Hep-2细胞悬浮在添加了10% FBS的DMEM高糖培养基中，以每孔1×10?个细胞的密度接种在12孔板的孔中，并在37°C和5% CO?条件下培养过夜。移除培养基后，向每个孔中加入200 μL CS复合物（C2.5S1、C2S0.8和C1S0.4）。将板子在37°C和5% CO?条件下培养1小时。分别向MDCK和Hep-2细胞中加入100 μL的APR8病毒和RSV病毒，浓度为0.2 MOI。将板子在室温下于摇床中以10–20 rpm的速度摇匀1小时。去除上清液后，用500 μL磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤MDCK和Hep-2细胞两次，再加入2 mL新鲜的高糖DMEM培养基（含2% FBS），并在37°C和5% CO?条件下培养72小时。收集上清液以评估病毒载量（TCID50）。

4.8. 病毒TCID50的评估
APR8和RSV的TCID50评估方法如前文[81]、[82]所述。将MDCK和Hep-2细胞悬浮在添加了10% FBS的DMEM高糖培养基中，以每孔1×10?个细胞的密度接种在96孔板中，并在37°C和5% CO?条件下培养过夜。移除培养基后，分别向MDCK或Hep-2细胞中加入10倍稀释的APR8或RSV病毒，每种病毒重复八次，然后在37°C和5% CO?条件下培养72小时。病毒致病效应通过细胞圆缩、脱落和细胞内包涵体的形成来表征。使用Reed-Muench算法[83]计算病毒TCID50/mL。

4.9. q-PCR检测病毒RNA
用gentleMACS M管（Miltenyi Biotec，德国）和gentleMACS Octo Dissociator（Miltenyi Biotec）将病毒攻击小鼠的肺和鼻甲组织在1毫升无菌PBS中匀浆。将匀浆液以1500×g离心10分钟以回收上清液用于RNA提取。使用QIAamp Viral RNA试剂盒（Qiagen，德国）根据制造商说明从组织匀浆液和细胞培养物中提取RNA。具体操作为：加入560 μL Buffer AVL在高变性条件下裂解上清液140 μL，以灭活RNase并确保RNA的完整性。将560 μL无水乙醇与RNA溶液混合。将最后一步的裂解液加入QIAamp Mini柱中，然后在4°C下以6000×g离心3分钟以沉淀RNA。收集RNA沉淀物，用洗涤缓冲液洗涤两次，短暂风干，再用60 μL无核酸酶的水溶解。使用NanoDrop one光谱仪（ThermoFisher，美国）在230、260和280 nm波长处测量RNA产品的数量和质量。使用PrimeScriptTM RT试剂盒（TaKaRa，日本）进行cDNA合成和基因组DNA去除。具体操作为：将2 μg RNA与反应成分混合，在42°C下孵育15分钟，然后在85°C下灭活5秒。使用SYBR? Green Supermixes（Bio-Rad，美国）根据制造商说明进行APR8和RSV RNA拷贝的定量实时PCR检测，引物如下：APR8-HA-F：TGGAGCCATTGCCGGTTTTA；APR8-HA-R：CTGCATAGCCTGATCCCTGT；RSV-N-F：AGGATTGTTTATGAATGCCTATGGT；RSV-N-R：GCTTTTGGGTTGTTCAATATATGGTAG。APR8 HA（基因ID：956529）和RSV N（基因ID：1494470）的核酸片段由Tsingke Biotechnology（中国）制备，以十倍稀释液作为病毒RNA定量标准。标准模板也按照制造商说明与SYBR? Green Supermixes和引物混合，然后加载到CFX Connect实时PCR检测系统（Bio-Rad，美国）上进行扩增。APR8 HA RNA的循环条件为95°C 3分钟，随后是39个循环：95°C 10秒、57°C 20秒、72°C 30秒；RSV N RNA的循环条件为95°C 3分钟，随后是39个循环：95°C 10秒、55°C 10秒和72°C 30秒。通过拟合标准曲线的Ct值计算感染细胞或组织的病毒拷贝数。

4.10. 病毒附着测定
病毒附着实验方法如前文[84]所述。将MDCK和Hep-2细胞悬浮在添加了10% FBS的DMEM高糖培养基中，以每孔1×10?个细胞的密度接种在12孔板中，并在37°C和5% CO?条件下培养过夜。移除培养基后，向每个孔中加入200 μL CS复合物（C2.5S1）。将板子在37°C和5% CO?条件下培养1小时。分别向MDCK和Hep-2细胞中加入100 μL的APR8病毒和RSV病毒，浓度为10 MOI。将板子在室温下于摇床中以10–20 rpm的速度摇匀1小时。之后，用500 μL PBS洗涤MDCK和Hep-2细胞两次，以去除未结合的病毒。将MDCK和Hep-2细胞收集在5-mL管中作为单细胞悬浮液，用100 μL 3%（w/v）BSA（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4）在室温下孵育30分钟。然后用兔抗流感A H1N1 HA抗体（SinoBiological，中国）染色MDCK细胞，用山羊抗呼吸道合胞病毒抗体（Sigma-Aldrich，美国）染色Hep-2细胞，每种抗体分别孵育30分钟。之后，用AF647标记的二级抗体（ZEN BIO，中国）对MDCK和Hep-2细胞进行染色30分钟。染色后，用PBS洗涤MDCK和Hep-2细胞两次，以500×g离心5分钟，然后用BD FACSymphony A5仪器（BD Biosciences，美国）在4°C下分析。

4.11. 小鼠模型中CS复合物的安全性和效力
6至8周大的雌性BALB/c小鼠通过鼻内注射1.5%异氟烷麻醉。为了安全性评估，每天鼻内给予50 μL的CS复合物（C2.5S1）两天，并连续10天监测体重。第10天收集左肺和鼻甲组织，固定于4%福尔马林中，浸渍于石蜡中，切片并用苏木精和伊红（H&E）染色进行组织病理学分析。为了抗病毒效力评估，每天鼻内给予50 μL的CS复合物（C2.5S1）两天。第二次给药后一小时，分别用2.8×102 PFU的APR8或3.5×10? PFU的RSV感染小鼠。连续10天监测小鼠体重。感染后4小时和4天时，收集鼻甲和肺部样本，通过q-PCR和显微镜进行病毒载量分析。

4.12. 组织病理学和免疫组化分析
将鼻甲和肺部组织用10%缓冲福尔马林固定24小时，脱钙7天（仅限鼻甲），浸渍于石蜡块中并切成5 μm厚的切片。**H&E染色步骤：**
将切片放置在65°C下8小时进行脱蜡处理，然后用苏木精（Sigma-Aldrich，美国）染色5分钟，冲洗后浸入预先准备的酸醇溶液中2秒，再用碳酸氢钠冲洗，接着用伊红（Sigma-Aldrich，美国）染色2分钟，最后用脱水剂清洗至去除多余颜色。

**免疫染色步骤：**
首先将切片在65°C下干燥8小时，然后进行脱蜡，并在EDTA缓冲液（MXB Biotechnologies，中国）中用微波处理30分钟以恢复抗原活性。

- **APR8-HA抗原检测：**
将鼻甲和肺部切片与100 μL浓度为2 μg/mL的胰蛋白酶和N-甲酰-L-苯丙氨酸氯甲酮（TPCK）混合物（MedChemExpress，美国）一起在PBS缓冲液（Solarbio，中国）中于37°C下孵育18小时，随后用PBS冲洗。接着用山羊血清（MXB Biotechnologies，中国）在室温（RT）下封闭2小时，然后加入稀释比例为1:200的兔抗流感A H1N1 HA抗体（SinoBiological，中国）作为一抗，在4°C下过夜孵育。最后在室温下加入稀释比例为1:250的TRITC标记的山羊抗兔IgG（Zen Bio，中国）作为二抗，孵育1.5小时。

- **RSV抗原检测：**
将切片用山羊血清在室温下封闭2小时，随后加入稀释比例为1:200的山羊抗RSV抗体（Sigma，美国）在4°C下过夜孵育，再加入稀释比例为1:250的TRITC标记的兔抗山羊IgG（Zen Bio，中国）作为二抗，孵育1.5小时。孵育完成后，用PBS冲洗切片，再用浓度为0.1 μg/mL的DAPI溶液（Abcam，英国）进行复染5分钟，最后使用水溶性 mounting medium（MXB Biotechnologies，中国）将切片固定在载玻片上，并在显微镜（Olympus BX43，Olympus Corporation，日本）下观察。

**血清抗体检测：**
将APR8和RSV在水浴中56°C加热灭活30分钟后，分别稀释至3.5 × 10^4 PFU/mL（RSV）和2 × 10^5 PFU/mL（APR8），然后每孔加入100 μL到96孔板上。将板子置于4°C下过夜，然后用3%（w/v）的BSA在PBST（137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na2HPO4、1.8 mM KH2PO4、0.1%（v/v）Tween-20）溶液中封闭2小时，再用0.1% Tween-20在PBS中冲洗。接着加入4倍系列稀释的血清样本（从1:50开始），每个孔100 μL，在37°C下孵育1小时。之后用1:8000稀释的抗小鼠IgG-HRP抗体（Abcam，美国）在PBST中孵育1小时，并用TMB底物（Solarbio，中国）显色5分钟。用0.5 M H2SO4终止显色反应，使用SpectraMax i3x微孔板读数仪（Molecular Devices，美国）在450 nm波长下测量光密度值。使用GraphPad Prism（版本8.0）计算曲线下面积（AUC）。

**统计分析：**
数据图形展示和统计分析使用GraphPad Prism（版本8.0）完成。对于多组数据采用单因素方差分析（one-way ANOVA）和Tukey多重比较方法；对于两组数据则使用独立样本的双尾t检验。

**项目资助：**
本项目得到了国家自然科学基金的支持（项目编号：82374120和82204731）。

**未引用的参考文献：**
[85], [86]

**作者贡献说明：**
曹婷：撰写、审阅与编辑、资源准备、方法设计、研究实施、数据分析、概念构思。
顾新霞：撰写、审阅与编辑、资源准备、研究实施。
Mou Jun：撰写、审阅与编辑、研究实施、数据分析。
孙美玲：撰写、审阅与编辑、研究实施、数据分析。
郭少华：方法设计、研究实施。
张一琳：方法设计、研究实施。
欧阳江山：方法设计、研究实施。
顾汉飞：研究实施。
胡志明：研究实施。
陈文龙：研究实施。
张瑞贤：研究实施。
刘杰：撰写、审阅与编辑、项目管理和方法设计、概念构思。