综述：单细胞液滴封装技术用于药物探索：原理、方法及未来发展方向综述

《Materials & Design》：Single-cell droplet encapsulation for drug exploration: A review of principles, methodologies, and future directions

　　赵志新|魏盼盼|叶小敏|赵永祥|张清飞|刘希宇
广西靶向肿瘤学国家重点实验室，国家生物靶向治疗国际研究中心，广西生物靶向治疗重点实验室，靶向肿瘤诊断和治疗协同创新中心，广西重大新药创新与开发人才高地，广西高等教育靶向治疗研究中心，广西医科大学，南宁，广西530021，中国

**摘要**
由于细胞异质性导致的药物耐药性和个体化疗效的差异已成为药物开发过程中的核心瓶颈。传统的群体分析只能获得细胞的平均信号，无法表征单个细胞之间的真实差异，并掩盖了细胞异质性。为克服这一瓶颈，单细胞液滴封装技术应运而生。该技术能够在单细胞水平上捕捉肿瘤细胞的异质性，从而准确识别耐药亚群，加速药物筛选，并指导个性化治疗。本文概述了单细胞液滴封装技术，包括其基本原理、微流控液滴生成、细胞封装策略和下游分选方法。进一步讨论了其在药物发现中的转化应用，包括：(i) 通过罕见耐药亚克隆的分子谱型识别目标；(ii) 高通量单细胞药物敏感性评估；(iii) 通过针对特定细胞亚群的定制策略实现精确药物递送。这些进展旨在加速个性化医学的发展，并扩大基于液滴平台的在制药研究中的实用性。

**1. 引言**
细胞是生命活动的基本单位，结构和功能的多样性是复杂生物体形成的基础。由于其功能多样性，生物体内的细胞通常在形态结构、基因表达和生理功能上表现出异质性[1]、[2]。即使在表型相似的细胞群体中，这种异质性也存在，并在疾病进展和药物反应中起着决定性作用[3]。具体而言，肿瘤内的异质性通过克隆选择、分支进化和治疗压力下的适应性表型可塑性等机制驱动耐药亚克隆的出现[4]、[5]，最终导致治疗失败和癌症复发。然而，由于患者之间的遗传突变、表观遗传调控以及肿瘤微环境组成的差异[6]、[7]，对同一药物的反应也各不相同。这严重限制了治疗的疗效和安全性，凸显了精准医学的必要性[8]。因此，在单细胞水平上分析细胞异质性尤为重要。无论是直接进行单细胞分析还是传统的批量细胞分析技术，都难以满足这一需求。一方面，直接的单细胞研究面临固有的挑战，如微量体积和分泌物浓度极低[9]、[10]；另一方面，传统的批量细胞分析技术只能提供细胞群体的平均状态，无法捕捉细胞间的功能异质性。这掩盖了稀有细胞亚群的关键行为，使得揭示疾病发生和治疗反应的真实机制变得困难[11]、[12]、[13]。因此，迫切需要高灵敏度、高通量的单细胞分析技术来分析细胞异质性。

近年来，单细胞技术的迅速发展为深入探索细胞异质性提供了强大的工具[14]、[15]。该技术能够在单细胞水平上识别和分析关键的稀有细胞亚群，从而揭示疾病的起源并为基础个性化治疗的发展奠定基础[16]、[17]。同时，为了解决传统单细胞技术（如流式细胞术[18]）在成本、通量和样本损伤方面的局限性，微流控技术[19]、[20]、[21]逐渐成为高效单细胞分析的强有力工具。该技术具有试剂消耗低、灵敏度高和精度高等优势[22]、[23]。最重要的是，它具备两个独特的能力：首先，通过创建可控的浓度梯度和流体剪切力[24]，模拟体内微环境；其次，利用微阀[26]、介电泳[27]或光镊[28]等技术，实现单个细胞的精确捕获、刺激和分选。这两种能力的结合为单细胞研究提供了前所未有的机会。

目前，研究人员已开发出多种基于微流控技术的单细胞分析策略，包括基于光热效应的单细胞分选[29]和基于泊松分布技术的单细胞分选[30]。前者利用光热效应实现目标单细胞的精确非接触分离，具有高精度和最小细胞损伤的优点，但通常依赖复杂且昂贵的设备，通量有限；后者通过调节细胞密度和液滴体积以及利用随机封装原理实现高通量单细胞分选，操作简单且通量高；然而，其单细胞封装效率受到泊松分布统计的限制，理论上不超过37％。尽管上述技术在单细胞分析中各有优势，但仍然面临通量、单细胞封装效率和仪器方面的挑战。相比之下，单细胞液滴微流控技术在高通量和低交叉污染方面将单细胞分析提升到了新的高度[31]、[32]。该技术可以通过两种或更多不相溶液体施加的剪切力在微尺度通道中稳定生成数千万个大小一致、相互独立的液滴[33]、[34]。每个液滴作为一个独立的微反应器，有效防止分子扩散和交叉污染，从而为封装单个细胞或生物分子提供了高度可控的微环境[35]、[36]、[37]。单细胞液滴封装技术代表了液滴微流控技术和单细胞技术的先进融合[38]、[39]、[40]。通过将单个细胞与所需反应试剂一起封装在单个液滴中，有效克服了传统单细胞操作技术在通量、规模和精度方面的瓶颈。在这一框架下，细胞在独立的微反应器中进行培养、刺激或生化反应，使研究人员能够实时监测和记录基因表达[41]、蛋白分泌[42]和生理动态等多维信息，从而深入探索细胞异质性和功能分析。

鉴于细胞异质性在药物耐药性和个体化疗效方面的核心瓶颈，单细胞液滴微流控技术在药物发现领域展现了独特的应用价值。目前，药物开发面临几个未满足的需求：传统的群体平均方法掩盖了耐药亚群的存在，导致目标识别效率低；传统的高通量筛选难以在单细胞分辨率下评估疗效；个性化药物递送系统缺乏针对特定细胞亚群的设计基础。单细胞液滴封装技术通过整合高通量单细胞分选、功能性药物反应检测和稀有亚群分子分析三大核心功能，为上述挑战提供了系统解决方案[43]、[44]。与对微流控技术的广泛介绍不同，本综述重点关注该技术与药物发现应用之间的联系，探讨它如何直接推动目标识别、药物筛选和精确递送，旨在为药学和工程领域的交叉学科研究人员提供实际指导。

因此，本综述旨在系统总结单细胞液滴封装技术的最新进展，并探索其在药物发现中的创新应用（图1）。首先详细阐述液滴生成的核心物理原理，包括无量纲参数及其主动和被动液滴生成策略。其次，重点讨论基于液滴和水凝胶的单细胞封装技术，以及封装单细胞液滴的分选方法。随后，总结该技术在药物靶点发现、高通量药物筛选和药物递送系统中的前沿应用案例，阐明其如何推动个性化药物开发的范式转变。最后，我们将客观评估当前的技术挑战和局限性，并展望未来的发展方向。

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**图1. 单细胞液滴封装及其在药物探索中的应用。**

**2. 液滴生成技术**
微流控芯片的材料和制造工艺构成了液滴生成的物理基础。芯片内的微通道必须具有高集成度、特定的几何结构和物理特性；因此，根据具体应用选择合适的芯片材料和采用适当的制造方法至关重要[33]、[45]。目前，微芯片最常用的材料是聚二甲基硅氧烷（PDMS），这是一种弹性体，通常用于软光刻技术制造微通道结构[46]。PDMS具有透光性、透气性好、生物相容性好和成本低等优点，使其成为单细胞封装（尤其是水包油液滴）的首选材料[31]。玻璃或硅芯片采用光刻和湿法蚀刻技术制造，具有广泛的溶剂兼容性和热稳定性[47]。玻璃材料表面亲水，硅芯片也可以通过氧化处理变得亲水[48]。因此，这些芯片适用于生成水包油液滴或用于有机溶剂系统，适用于需要亲水界面或化学抗性的应用[49]、[50]。这些材料和工艺特性直接影响液滴生成行为：例如，微通道制造的精度决定了最小液滴尺寸，表面润湿性决定了连续相的选择，溶剂兼容性限制了可使用的两相系统类型。这些因素直接影响液滴生成的稳定性和性能以及后续的单细胞封装。

液滴生成是实现单细胞封装和分析的前提。该技术的核心原理是利用两种不相溶液体（通常是水和油相）在特定结构微通道界面处存在的不稳定性，从而促进分散相破碎成尺寸一致且高度可控的液滴[51]、[52]。与传统乳化技术相比，基于微流控的液滴生成方法可以实现高度功能化液滴的可控制备，具有优异的单分散性[53]、尺寸均匀性[54]和高通量[55]，从而实现对微反应器的精确控制。

液滴生成是一个涉及多个物理场相互作用的复杂动态过程，主要受流体惯性力、粘性力、界面张力和外部场力共同影响[56]。为了定量分析液滴生成过程，研究人员通常使用一系列由流体属性定义的无量纲数（例如密度（ρ）、动态粘度（μ）、界面张力（σ）、流速（V）和通道几何形状（通道形状和大小）[57]。通过分析这些无量纲数（见表1），可以揭示流体流动规律。其中，毛细数（Ca）是控制液滴生成的关键参数，反映了粘性力与界面张力的相对比例，直接影响液滴尺寸和生成模式[58]。通常，较低的Ca值意味着在流动过程中界面张力的影响远大于粘性力[59]。在这种情况下，液滴会最小化自身表面积，并最终形成球形且尺寸均匀的液滴。相反，在高Ca值下，粘性力相对于界面张力占主导地位，分散相被连续相强烈拉伸，导致无法在颈缩处停止，从而形成向下游延伸的连续射流。韦伯数（We）表示惯性力与界面张力的比率[56]，在微流控层流系统中较小，但在高速喷射（如喷墨打印）中起重要作用。雷诺数（Re）定义了流体惯性与粘性力的比率，在微流控系统中通常远小于1（Re?1），表明流动是由粘性力主导的层流。此外，调整油相与水相的流速比是控制生成液滴尺寸的最直接方法。粘度比对液滴破碎过程和卫星液滴的形成有显著影响[61]。

**表1. 微流控液滴生成的关键无量纲参数**
| 符号 | 公式 | 物理意义 | 在液滴形成中的作用 | 参考文献 |
|------|------|----------|-------------|--------------|小λ值（低滴粘度）有利于生成小滴；大λ值可能会阻碍滴体的形成[61]。流量比φ=Qd/Qc（分散相流量/连续相流量）可以直接控制滴体大小：随着φ的增加，滴体大小通常会增大[63]。在单细胞封装应用中，调整这些无量纲参数可以直接决定滴体的均匀性、生产率和封装效率。在典型的聚焦流动结构中，增加连续相流量或减少分散相流量会增加Ca值，从而促进滴体的形成[64]。滴体形成模式也会从挤压模式（Ca<0.01，滴体大且不规则）转变为滴落模式（Ca≈0.01–0.1，滴体高度均匀），最后变为喷射模式（Ca>0.1，滴体多分散）[65]。Srikanth等人对聚焦流动结构进行了系统实验，并证明当Ca在0.01–0.1范围内时，滴体的形成始终遵循稳定的逐个滴体生成模式[66]。在滴落模式下，滴体大小和Ca遵循幂律关系d∝Ca^-1.3；流量比φ的增加意味着连续相施加的剪切应力增大，从而导致滴体大小减小。在这项研究中，当φ从2.5增加到20时，滴体长度从大约160微米减小到大约50微米，形状也从细长变为球形。同时，粘度比（λ）必须保持在0.01到0.5之间，以防止卫星滴体的形成并确保滴体的均匀性。研究还指出，当λ从0.013增加到0.018时，分散相在破裂前的挤出时间显著增加，导致滴体延长，表明λ的增加会降低滴体的均匀性。在微流控中，Re通常远小于1，但在设计高通量系统（例如流量>1 m/s）时，Re可能接近1[67],[68]。在这种情况下，不能忽略惯性效应，必须使用We来预测喷射破碎行为。这些原理直接指导了实际平台的设计。例如，基于聚焦流动滴体生成的商用单细胞RNA测序平台（如10x Genomics）通常在滴落模式下运行，保持Ca值在大约0.01到0.1之间，以确保单细胞封装效率和细胞存活率[41]。在这个范围内，报道的单细胞封装效率可达70–90％，滴体生成频率大约为100–1000 Hz，细胞存活率通常高于90％[69]。总之，通过明确无量纲参数之间的耦合关系及其与单细胞封装性能的定量关系，研究人员可以从试错方法转向理性的、可预测的滴体生成设计。

根据驱动力的来源，微流控滴体生成技术主要分为两类：被动生成和主动生成。被动生成方法依靠微通道的几何形状，利用剪切力和界面张力来自发引导滴体生成。主动生成法则通过施加外部场能量来主动调控滴体生成。图2展示了不同被动和主动方法的典型几何配置。表2和表3分别系统总结了被动和主动方法的优点、缺点和适用场景。下面详细描述了各种方法的滴体生成原理、性能特性和适用场景，为构建单细胞封装平台提供了技术基础。

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图2. 两种不同滴体生成方法的示意图。
被动通道结构：(a) 交叉流，(b) 流动聚焦流，(c) 合流流。
主动通道结构：(d) 在直接交叉流系统中电控滴体生成。(e) 用磁镊子产生的磁场在流动聚焦装置中控制磁流体力学滴体生成。(f) 通过对分散相流中的微管施加机械振动来刺激滴体生成。(g) 在流动聚焦装置中对滴体生成进行温度控制。

表2. 不同被动滴体生成技术的比较。

| 技术 | 实现方式 | 主要优点 | 主要限制 | 典型应用 | 参考文献 |
|-------|--------|---------|----------|--------|
| 交叉流 | 垂直交叉通道，连续相剪切分散相 | 结构简单，成本低且易于集成 | 低通量，对滴体大小的控制有限 | 基础研究，验证滴体生成机制 [53], [70], [71] |
| 流动聚焦 | 对称侧通道聚焦，收缩区剪切挤压 | 优秀的均匀性（CV<3％），高通量，剪切损伤小 | 高通量单细胞测序（例如10x Genomics），稀有细胞分析 [64], [72], [73], [41] |
| 合流流 | 同轴毛细管或平面通道，分散相居中，连续相环绕 | 可制备核壳微胶囊和多室微球，核材料嵌入可控 | 低通量，滴体尺寸相对较大 | 药物递送载体，组织工程微胶囊 [74], [59], [75] |

表3. 不同主动滴体生成技术的比较。

| 控制类型 | 具体方法 | 实现方式 | 主要优点 | 主要限制 | 典型应用 | 参考文献 |
|-------|--------|---------|---------|----------|--------|这一特性使其特别适合于温和地封装生物成分，如细胞[73]。正因如此，这种结构已成为商业单细胞测序平台（例如10×Genomics）的首选液滴生成单元[41]。然而，该结构相对复杂的通道设计和高制造成本在一定程度上限制了其更广泛的实际应用，这是未来技术优化需要面对的一个挑战[19]。总之，这种以流动为中心的结构，凭借其对称的配置，可以稳定地生成高单分散性的液滴。液滴在通道的中心区域破裂，这显著减少了细胞受到的剪切损伤，使其适合于高效且温和的大规模单细胞封装。同时，这一优势也使其成为商业单细胞测序平台的首选解决方案，并为后续的高通量单细胞药物筛选提供了技术基础。尽管这种结构的制造成本相对较高，但对于稀有细胞分析和个性化药物敏感性测试等高价值应用来说，这种投资是值得的。

2.1.3. 共流（Co-flow）
共流是一种经典的微流控液滴生成策略。其核心设计依赖于同轴微通道，分散相和连续相分别从中心通道和外围通道注入，形成平行共流（图2c）[99]。在这种结构中，液滴的生成主要受界面剪切力的控制：连续相对分散相的剪切作用克服了分散相的凝聚力，最终精确控制了其变细和断裂过程。通过调整两相流速比等参数，可以灵活实现三种典型的流动模式（图3c）[59]。在挤压模式下，由于分散相的速度较大，上游压力积聚，在通道出口处形成液滴并几乎完全阻断连续相的流动。生成的液滴大小均匀且大于通道宽度。在滴落模式下，液滴在通道出口处逐渐生长，最终被切断。通过这一过程生成的液滴具有极高的单分散性和统一的大小。这一特性使其成为制备具有精确结构的微胶囊（核壳结构）或多腔微球的理想选择[74]。在喷射模式下，连续相的流速较大，分散相会延伸形成细长的喷射流，随后由于瑞利-普拉托不稳定性而在下游断裂成多分散的液滴[59]。共流结构生成的液滴特性与流动聚焦结构类似，但液滴大小的控制更加灵活直观。通过精确设计分散相通道的宽度，可以直接控制初始喷射流或液滴生成点的直径，从而实现对最终液滴大小的精确控制[75]。值得注意的是，在滴落模式下，生成的液滴直径通常大于分散相通道的宽度。在设备实现方面，共流结构表现出良好的灵活性。该结构使用玻璃毛细管，将更细的分散相毛细管同轴插入方形或圆形的主毛细管中作为连续相通道[100] [101]。此外，还可以利用标准软光刻等微加工技术在二维平面芯片上构建高效的共流结构[102]。总之，同轴共流结构在液滴形成条件下具有稳定的同轴剪切力和高单分散性，适用于制备核壳微胶囊和多腔微球，在药物递送载体设计、多药物共封装以及模拟组织微环境方面具有独特的优势。然而，与流动聚焦相比，这种方法的液滴吞吐量较低，生成的液滴较大，因此不太适合高通量单细胞封装；它更适合制备功能化药物载体。

2.2. 主动液滴生成（Active droplet generation）
与依赖通道几何形状和流体特性的被动方法不同，主动方法需要外部能量的介入以实现快速响应液滴生成过程[33]。这种方法相较于被动液滴生成有以下几个优势：（i）更宽的操作灵活性：通过调节外部能量，主动方法可以突破被动方法对流体流速范围的依赖，能够在更宽的流速范围内稳定生成液滴；（ii）更高的精度控制：通过精确调整外部参数，可以在微米级别独立且精确地控制液滴大小和生成频率，而无需改变芯片结构和流体流速；（iii）按需生成能力：通过外部信号的切换，主动方法可以准确触发单个液滴的生成，实现按需生产液滴。

2.2.1. 电控（Electrical control）
电控已成为一种重要的液滴生成方法，因为它响应迅速并且与微通道结构兼容[53]。该方法通过在微通道中集成电极并施加外部电场来实现（例如，流动聚焦结构，图2d）。生成的麦克斯韦应力梯度用于主动干扰液-液界面，从而克服表面张力并实现液滴的精确控制[76]。Yin等人提出的“电剪切”方法就是这一原理的典型代表[77]（图4a）。正方形或正弦电场对稳定有机层流的同时切割，不仅实现了液滴大小与电场频率之间的线性调节，还突破了传统PDMS材料对生成凝胶（O/W）液滴的疏水性限制，为各种有机流体的通用化和无表面液滴的生成提供了关键技术支持。除了界面剪切机制外，介电泳（DEP）[78]和电润湿（EWOD）[81]等机制也被广泛应用于电驱动液滴生成中。DEP机制依赖于非均匀电场对流体体积产生的作用力，有效加速了喷射流断裂过程，实现了高频液滴生成[79] [80]。例如，Tan等人通过合理设计电极布局，证明了DEP力可以显著增强喷射流的不稳定性，提高了液滴生成的频率和均匀性[76]。同时，EWOD机制通过改变液-固-气接触角来驱动界面。Park等人提出了一种基于EWDO的可重复使用微流体芯片（eDrop-rChip）用于主动液滴生成[82]。其超薄的PET介电层大大降低了电压要求，能够在62毫秒内生成体积范围为0.35至1.2纳升的液滴。该设备在高频（>10 kHz）和高导电性样品下表现出良好的性能，同时保持液滴内的高细胞存活率。这不仅提高了液滴操作的灵活性和集成度，还为高通量液滴应用提供了可靠且可适应的解决方案。需要注意的是，虽然电控方法可以实现高频、精确的液滴生成，但电场可能会损害细胞活性，因此特别不适合敏感细胞或高通量单细胞药物筛选；在这种情况下，推荐使用磁控或机械控制方法进行活细胞封装。

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图4. 主动液滴生成方法。（a）使用直流（DC）和交流（AC）电场在流动聚焦微流体设备中生成微滴[77]。（b）通过磁镊施加局部场在微流体流动聚焦接头中形成铁磁流体液滴[84]。（c）使用压电驱动器在微流体中生成主动上升液滴[103]。（d）流动聚焦设备接触两个铜液体热交换器形成两个恒温区，利用热电偶测量喷嘴温度来生成液滴[91]。

2.2.2. 磁控（Magnetic control）
磁控液滴生成技术通过施加外部磁场来精确控制液滴生成过程[104]。其核心原理是利用磁性流体在磁场中的响应特性来控制液滴的生成。磁性流体（如铁磁流体[83]）是一种含有悬浮磁颗粒的流体。这些颗粒可以作为分散相或连续相存在，并在外部磁场的作用下改变液滴的形成行为[105] [106]。图2e展示了在流动聚焦结构中利用磁镊操纵液滴的示意图。在这项研究中，Yan等人采用了结合磁镊产生的局部磁场的微流体流动聚焦芯片，实现了铁磁流体液滴大小的主动调节（图4b）[84]。研究表明，在固定流速（连续相：1 mL/h；分散相：0.2 mL/h）下，仅通过调节磁场强度（0–60 mT）即可将平均液滴直径从135 μm减小到95 μm。这一机制源于两种竞争性的磁效应：磁粘性和磁阻力，在选定的参数范围内，磁阻力占主导地位。研究还使用了方波磁场来周期性交替生成不同大小的液滴序列，突显了磁控方法在可编程液滴生成方面的潜力。除了对基本液滴行为的磁调控外，该技术在功能性材料的制备中也展示了显著的价值。Moharamzadeh等人成功合成了基于海藻酸的磁凝胶液滴，其中封装了柠檬酸修饰的磁性纳米颗粒。通过基于流动诱导断裂模型调节两相流速比，他们制备了具有高度可控颗粒分布（20–120 μm）的磁性微凝胶。所得复合微凝胶表现出优异的生物相容性，同时保持了超顺磁性能。72小时的细胞增殖实验表明，含有柠檬酸修饰磁性纳米颗粒的实验组的细胞增殖率显著高于纯海藻酸微凝胶对照组（p = 0.042）。这为磁性液滴及其衍生材料在靶向药物递送领域的应用提供了坚实的材料基础和方法支持。总之，磁控方法的生物相容性优于电热方法，使其更适合于活细胞封装（例如，在<100 mT的磁场下支持72小时的细胞增殖）。然而，过高的磁场梯度或长时间暴露可能会对磁标记细胞造成机械应力；因此，建议使用低场强、短脉冲模式，并优先使用非磁标记细胞。

2.2.3. 机械控制（Mechanical control）
机械液滴操控是一种典型的主动生成策略。其核心原理是使用外部机械执行器周期性干扰液-液界面[61]。通过输入振动能量，引发界面的不稳定性，从而控制液滴的生成。常见的机械执行器包括压电陶瓷[107]、机械振动器[86]以及液压/气动阀门[87] [88]。这些组件可以灵活地集成到被动液滴生成结构中（如平行流动（图2f）和流动聚焦），形成主动控制系统。在这种方法中，液滴大小和生成频率主要由干扰因素的幅度和频率以及系统的自然液滴生成频率决定。例如，Zhu等人将平面外机械振荡器应用于共流微流体通道，使分散相流产生正弦振荡[85]。他们系统研究了振动频率和幅度对液滴形成同步性和尺寸均匀性的影响，并实现了液滴喷射的延迟转换。另一方面，压电执行器等组件通过快速的“推-拉”变形对界面施加更直接和精确的控制。例如，Li等人报道了一种基于受限界面振动的主动液滴生成技术[103]（图4c）。他们通过对传统喷墨喷嘴的压电驱动器施加定制波形，首先喷射液体然后再将其吸回喷嘴。在回缩过程中，瑞利-普拉托不稳定性导致液滴断裂，生成明显小于喷嘴孔径的均匀液滴。这些机械控制方法提供了高灵活性和出色的按需生成能力，特别适用于复杂应用，如多组分液滴合成、高通量微反应系统和生物打印。

总之，机械控制方法温和且不引入电场或温度梯度，从而避免了电解和焦耳加热等常见的细胞损伤形式。然而，过高的振动频率可能会产生剪切应力或压力波，从而损伤细胞膜。因此，需要优化驱动波形和幅度，以确保生成高活性的单分散液滴，使该方法适用于对细胞友好的应用，如按需液滴生成和生物打印。

2.2.4. 热控（Thermal control）
基于热方法的液滴生成是主动方法中的重要技术。核心原则是通过局部和即时的热输入来改变流体的物理性质，从而实现按需生成液滴。根据热输入的方式，热控液滴生成可以分为两种主要类型：电阻加热[91]和激光加热[89]。电阻加热利用液滴生成区域内的集成微型加热器（如图2g所示的聚焦流动结构）来生成液滴。这些微型加热器通常由铂等导电材料制成。通常在加热器和流体之间放置一层PDMS薄膜，以隔离流体并防止电解反应。在液滴生成过程中，改变流体的温度可以调节其粘度和界面张力，从而控制液滴大小。例如，Stan等人展示了一种在聚焦流动装置中动态控制液滴体积和传输速度的方法[91]。改变聚焦流动喷嘴的温度可以改变液滴体积。当从5°C开始加热上游部分时，矿物油中的液滴大小增加了近两个数量级。

激光加热通过聚焦激光束在液滴生成区域实现局部加热[52]。它的优点包括高精度和灵活性，可以通过调整聚焦激光点的位置和功率来控制液滴生成。例如，Park等人提出了一种激光脉冲驱动的液滴生成（PLDG）技术，可以同时实现高速、按需生成和高度精确的液滴体积控制[90]。这项技术使用聚焦的强烈激光脉冲在水中诱导空化气泡，从而破坏油水界面的稳定性。实验结果表明，在单层PDMS装置中，可以按需生成多达10,000个液滴/秒。通过调整激光焦点的位置和能量，液滴体积可以从1皮升连续调节到150皮升，体积变化系数小于1％。这项技术突破了传统方法的限制，为需要单细胞分析和高通量筛选的应用提供了技术支持。与上述三种方法相比，热控方法对细胞活力的影响最大。局部加热超过37°C可能会导致细胞膜破裂、蛋白质变性以及细胞凋亡；因此，它不适用于活细胞 mounting，仅适用于无细胞系统或耐热细胞（如酵母）。需要注意的是，在使用这种方法处理哺乳动物细胞时必须进行实时温度监测。

总之，在可控性、通量、复杂性和适合下游单细胞分析方面，被动液滴生成方法和主动液滴生成方法之间存在显著差异。被动方法依赖于通道几何形状和两种相之间的流速比来生成液滴。它们具有高通量、低复杂性和良好的生物相容性等优点；然而，难以实现液滴大小和生成频率的实时动态控制。相比之下，主动方法通过引入外部能量来实现液滴的动态控制和按需操作，但它们的通量较低且系统架构复杂。更重要的是，来自外部电场、声场、磁场或热场的刺激可能会对生物单元（如细胞）造成潜在的生理压力或损伤。因此，对于优先考虑大规模单细胞筛选的中等通量应用，被动方法具有更大的优势；然而，在需要精确控制的场景中，如稀有细胞的分选或个别药物反应的分析，主动方法更为合适。上述互补原则为后续的单细胞封装和药物发现应用提供了重要指导。

3. 单细胞封装与分选
近年来，单细胞分析技术已成为揭示细胞异质性和动态变化的重要手段。准确高效的单细胞封装是单细胞分析的关键步骤，同时也为药物筛选、疾病机制及其他后续研究提供了技术支持。然而，基于泊松分布的传统单细胞封装方法（如微孔板方法）受到其物理原理的限制，导致细胞空载率高和封装效率低[108]。这不仅浪费了大量样品，也极大地限制了稀有细胞研究的适用性。因此，打破泊松分布规律并提高单细胞封装效率已成为推动单细胞分析技术发展的关键挑战。随着微流控技术的不断进步，液滴微流控技术应运而生[31][109]。这项技术可以生成高通量液滴，为大规模并行单细胞研究提供了可能[110]。每个细胞可以被独立封装在纳升级别的液滴中，形成一个独立的微反应器，这不仅减少了样品之间的交叉污染，还能隔离单细胞所需的营养物质，有效维持细胞活性和生物功能[111]。这显著提高了单细胞分析的准确性和效率。总之，液滴微流控技术可以精确操作和分析单细胞，并将封装、培养、分选和检测等多个步骤集成到同一平台上，从而实现整个过程的一体化研究[112]。

3.1. 基于液滴的单细胞封装
基于液滴的单细胞封装技术主要利用微流控芯片中两种相流体之间的界面张力以及流体力学来生成液滴[113]。单个细胞可以精确地封装在液滴中，形成一个可以独立操作的微反应器。通过调整两相流速、微通道大小和流体粘度，可以精确控制液滴的大小和均匀性，以满足特定的实验要求[114]。液滴封装技术旨在高效地将单细胞封装在微滴中。凭借高通量和微体积的优势，它不仅能够灵活控制实验条件，还能最小化样品消耗。该技术已广泛应用于单细胞分析和药物筛选等生物研究领域，为大规模和高通量的单细胞研究提供了关键技术支持。

在使用液滴微流控技术生成液滴的过程中，存在一个固有的复杂问题：细胞进入液滴的过程是随机的，悬浮在分散相中的细胞排列并不均匀。由于这种随机性，在形成过程中无法准确预测每个液滴中包含的细胞数量。研究人员只能确保被动细胞封装中每个液滴中的细胞数量遵循泊松分布[115]，其表达式为：
$$P_k = \frac{\lambda e^{-\lambda K!}}{K}$$
其中$k$是液滴中的细胞数量；$\lambda$是每个液滴中的平均细胞数量，由悬浮液中的细胞密度和液滴体积决定。根据泊松分布，当$\lambda = 1$时，大约63％的生成液滴至少包含一个细胞，约37％的生成液滴恰好包含一个细胞。大约58％的含细胞液滴包含一个单细胞。这些数值远低于实际单细胞分析的基本要求。因此，我们需要加强单细胞封装的控制。为了解决传统随机封装方法中由泊松分布带来的低封装效率问题，研究人员从工程角度提出了两种主要策略：被动调节（优化芯片结构和流体力学）和主动调节（利用外部能量进行精确控制）。被动和主动单细胞封装策略的代表性成果和关键优势分别总结在表4中。这两种方法将在下文中详细描述。

表4. 基于液滴的单细胞封装技术：代表性成果和优势
| 技术类别 | 具体方法 | 代表性成果 | 关键优势 | 典型应用 | 参考文献 |
| ------- | -------- | -------- | ---------- | -------- |
| 被动封装 | 直孔通道（高长宽比） | 单细胞封装率约为100％（确定性），打破泊松极限 | 无需外部场，结构简单，高通量 | 稀有单细胞的高通量分析 [116] |
| 螺旋或弯曲通道；Dean流 | 封装率约为80％（理论值36％），细胞存活率为92％ | 与Drop-seq兼容，细胞利用率提高300％ | 单细胞转录组测序 [95] [96] [97] |
| 表面声波（SAW） | 封装率从25.7％提高到73.6％ | 非接触式，非侵入性 | 高活性单细胞组学样品制备 [118] |
| 压电微阀；实时图像识别 | 无标记主动封装效率为94.9％ | 打破泊松极限，成本低，易于实施 | 稀有细胞主动捕获 [118] |
| 介电泳辅助双纳米孔阵列（ddNA） | 单细胞珠子配对率超过75％（对比泊松分布的33％） | 主动捕获，极高配对效率 | 单细胞组学样品制备 [79] [119] |

3.1.1. 被动有序排列
近年来，被动单细胞封装的核心策略是在液滴形成之前通过改变微通道结构来排列细胞[120]。这种策略的实质是将传统方法中细胞随机进入液滴区域的过程转变为确定性过程，从而提高单细胞封装效率[121][122]。在传统方法中，细胞到达液滴生成区域的时间间隔是不规则的且相互独立的，这也是泊松分布的核心原因[36]。通过预先排列流体动力学，细胞可以形成等距的单排流动，其到达频率可以预测和调节，从而从根本上绕过了泊松分布的限制[36]。确定性封装的核心机制是液滴生成率$f_{drop}$与细胞注入率$f_{cell}$的同步[123][124]。根据Nasiri等人提出的理论模型，相关公式可以表示为：
$$\lambda = \frac{f_{drop} \cdot Q_{cell} \cdot V_{drop}}{K}$$
其中$\lambda$表示每个液滴中的平均细胞数量，$f_{drop}$是液滴生成频率，$Q_{cell}$是细胞的体积流量，$V_{drop}$是液滴体积。当$\lambda = 1$且细胞间距均匀时，封装过程从随机转变为确定性封装。具体来说，当$f_{cell} > f_{drop}$时，细胞堆积导致多细胞封装；如果$f_{cell} < f_{drop}$，空液滴的比例增加。可以看出，实现接近100％单细胞封装效率的关键在于精确设计通道几何形状并控制两相的流速，确保细胞间距与液滴生成周期相匹配。在直通道中，流体动力学将随机分布的细胞集中在平面或三维（3D）表面上的狭窄流线上，使它们以有序的方式进入液滴封装区域。这显著降低了多重封装或空封装的概率，从而提高了单细胞封装的效率。例如，Edd等人提出了一种利用高长宽比直微通道的流体动力学特性实现高效单细胞封装到纳米级液滴中的方法[116]。具体来说，该方法在细胞或粒子悬浮液进入液滴生成区域之前，将其自发地排列成均匀间隔的序列，从而以与液滴生成频率相同的速率逐个发送细胞。实验结果表明，有序封装显著提高了单细胞的占比，实现了接近完美的（约100％）单细胞封装效率，标志着首次通过被动调节实现确定性封装。

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图5. 高效的被动单细胞封装。（a）细胞在高长宽比直微通道内均匀对齐，以液滴生成速率进入液滴生成器[116]。（b）基于Dean力的微流控装置中的有序细胞排列[123]。（c）结合螺旋和蛇形通道的微流控系统，用于细胞和珠子的聚焦，实现高效单细胞配对[125]。
在螺旋微通道中，悬浮细胞受到阻力和升力的共同作用，惯性升力来自壁效应和剪切梯度[117]。Dean流通过产生次级旋转流来施加阻力。惯性升力与Dean阻力之间的平衡决定了悬浮细胞在螺旋微通道中的优先有序运动。例如，Evelien W等人提出了一种结合Dean流与惯性迁移的弯曲微通道技术，实现了有序的细胞排列和高单细胞封装效率[123]。实验结果表明，通过调整流速以匹配液滴生成频率，单细胞封装率提高到约80％，远高于传统的泊松极限（36％），同时保持了高达92％的细胞存活率。此外，该方法使得细胞能够在小于1厘米的通道中快速有序地排列。这项技术不仅显著提高了单细胞封装率，减少了样品损失，还结合了高通量和易于集成的优点，大大推动了单细胞分析的发展。此外，李等人采用了螺旋形和蛇形通道来聚焦细胞和磁珠，并将其与Drop-seq平台集成，以生成有序的磁珠和细胞流动[125]（图5c）。实验结果表明，与传统的Drop-seq设备和独立的聚焦结构相比，结合这两种方法分别使细胞利用率提高了300%和40%。测序结果进一步验证了这种平台在样本量稀缺的情况下进行单细胞分析时的性能提升。最近，研究人员开发了多种高性能的被动控制结构。例如，唐等人开发了一种含有双螺旋聚焦单元和可调样本富集模块的微流控芯片，在低浓度细胞悬浮液（2×10^6细胞/毫升）中实现了细胞等距线性排列和顺序封装。YOLOv8n算法验证单细胞封装率达到了72.2%[126]。司等人通过使用直通道惯性聚焦策略，在聚乙烯醇诺博烯水凝胶中实现了单细胞的确定性封装。超过90%的单细胞封装间充质干细胞在培养7天后仍然保持活性[127]。这些研究表明，通过优化通道几何形状，被动控制策略能够将单细胞封装效率从泊松分布的理论极限（约36%）提高到70%至90%，并且在某些条件下（如高长宽比的直通道）甚至达到了近乎完美的封装效果。

3.1.2 主动精确控制
与依靠流体剪切力随机形成液滴的被动方法不同，主动单细胞封装技术通过引入外部能量场，实现了对细胞和液滴形成过程的实时精确干预和控制，从而有效地封装单个细胞。这一主动特性突破了被动方法在封装效率、通量和细胞活力方面的固有局限性。该方法可以通过声场、光场、电场或机械阀门等物理机制，逐个主动识别、排列和输送细胞[36]。因此，单细胞捕获率从理论上的约30%大幅提高到90%以上，确保每个微反应室都能准确容纳一个目标细胞[128]，[129]。实现“按需”单细胞封装的核心是构建一个“感知-决策-执行”的闭环控制系统。在感知层，高速摄像头和实时图像处理算法（如边缘检测、深度学习对象检测）持续追踪微通道中流动的细胞，以确定细胞的位置、形状以及是否为目标细胞[130]，[131]。在决策层，控制单元（如FPGA或微控制器）根据预设阈值计算执行器的触发时间和脉冲宽度，并输出控制信号[132]。在执行层，压电微阀门、声波或介电泳技术在毫秒级时间内响应，通过改变界面张力或局部压力精确生成单细胞封装液滴。从细胞检测到液滴生成的过程需要在细胞移动视野的时间范围内（通常<10毫秒）内完成，以实现准确的按需触发[133]。

声波操控技术利用表面声波实现非接触、无创的精确对齐和细胞驱动。例如，何等人创新地将表面声波（SAW）聚焦技术与鞘流控制相结合[118]。通过动态调节粒子间距，H22细胞的单细胞封装率从25.7%提高到了73.6%，并且细胞活力得到了保持。这种方法对细胞的机械性质影响很小，适用于需要极高活性的单细胞组学样本制备。同时，微阀门技术通过微通道内物理结构的周期性开闭主动拦截和分割含有细胞的液柱。例如，王等人基于压电微阀门和实时图像识别开发了一种主动单细胞包装系统[134]。该系统通过无标记视觉反馈精确控制微阀门，突破了泊松分布的极限，实现了94.9%的高效单细胞封装，并支持150毫米/秒的高通量处理。其分体设计和T形结构大大降低了成本，并能灵活生成适合不同类型细胞的大尺寸液滴。此外，这项技术还为单细胞组学中的药物筛选提供了高性能且易于实施的解决方案。介电驱动力（DEP）利用非均匀电场为极化细胞生成驱动力，从而实现细胞的主动排列和按需封装[131]。田等人开发的DEP辅助双纳米孔阵列（ddNA）设备通过微孔下指状电极产生的DEP力主动捕获细胞，实现了超过97%的单珠捕获率和超过75%的单细胞-珠子配对率，远超泊松统计的理论极限约33%[79]，[119]。

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图6. 液滴内的主动单细胞封装。(a) 基于表面声波和鞘流控制的主动单颗粒封装技术示意图[118]。(b) 基于微阀门驱动的按需液滴分配和实时图像处理的免标记主动单细胞封装技术示意图[134]。(c) 结合液滴微流体和荧光激活细胞分选的按需液滴收集系统，可实现所需微滴的连续获取[135]。

最近，南等人开发了一种主动且高效的微流控按需液滴收集系统[135]。该系统在液滴生成后依次进行分选、分配和收集。目标液滴被精确收集到微管中，有效避免了样本损失和过程中断。收集到的单细胞液滴可以高效转移至培养板进行后续培养，从而进一步研究细胞行为并全面分析单细胞特性。借助荧光激活的液滴分选和阀门驱动分配技术，该系统的单细胞筛选频率超过了200赫兹，单细胞封装效率和回收率分别高达98.5%和99%。与传统的手动细胞选择和激光捕获显微解剖方法相比，该方法的效率大幅提高，在单细胞水平分析任务（如免疫学中的细胞因子检测、蛋白质组学的质谱分析和转录组的全基因组测序）中显示出巨大潜力。

总之，这些创新方法有效克服了泊松分布的固有局限性，提高了封装精度，确保几乎每个液滴中只包含一个细胞，从而实现了高封装效率。然而，样本中稀有细胞（如循环肿瘤细胞、干细胞）的数量极低（通常为10^3细胞/毫升），难以有效处理[44]。传统的被动封装方法难以有效实施，因为它依赖于泊松分布或惯性聚焦所需的高细胞浓度（>10^6细胞/毫升）[36]。主动按需封装技术从根本上解决了这一难题：通过实时图像识别主动定位细胞，逐个捕获，样本利用率接近100%；即使在10^2-10^3细胞/毫升的低浓度下也能稳定工作。非接触或快速机械操作对细胞的损伤很小，细胞活力保持超过90%。结合荧光或形态学识别，可以选择性封装目标细胞，排除碎片和非目标细胞。这些优势使主动调控成为稀有细胞单细胞分析的核心技术路径，并为后续药物开发中的目标发现、抗体筛选和效力评估提供了理想平台。

3.2 基于水凝胶的单细胞封装
除了液滴封装技术外，微流控技术还可以通过将水凝胶前体混合到细胞悬浮液中，实现细胞或颗粒的高效封装[136]，[137]。这项技术的核心是将单个细胞独立包裹在微小的3D水凝胶网络中。这种水凝胶微球相当于一个微型反应器，构建了一个支持细胞生命活动的3D微环境，为独立细胞操作和实时监测提供了理想平台[138]，[139]。这对于在高度仿生条件下研究单细胞行为具有重要意义。

实现这项技术的关键是精确选择凝胶化策略。细胞嵌入水凝胶的核心过程包括将细胞均匀悬浮在液态水凝胶前体溶液中，通过物理或化学方法触发前体的凝胶化反应，形成三维聚合物网络来封装细胞[140]，[141]。具体机制可以分为两类：化学凝胶化和物理凝胶化。基于光聚合或化学交联的化学凝胶方法可以构建具有稳定机械性能和结构耐用性的3D矩阵[142]，[143]。原理是利用光、热或化学引发剂诱导水凝胶单体或大分子前体中不饱和双键（如丙烯酸酯）的自由基聚合，或引起聚合物链上的反应性官能团与交联剂之间的缩合反应[145]，从而形成共价键网络。通常，将细胞与单体、光引发剂和交联剂混合；使用微流控技术形成液滴；然后，在暴露于紫外线或热量下，立即触发聚合或交联，使液滴固化成水凝胶微球，细胞被封装在共价网络中[146]，[147]。其优点包括可精确调节的机械性能（如硬度和弹性模量）[148]，能够在复杂环境中长期保持结构完整性，并抵抗膨胀、降解和塌陷[149]，特别适合需要高矩阵稳定性的应用。然而，引入的交联剂可能会干扰细胞的正常生理活动[92]。相比之下，基于热诱导相变或离子键合的物理凝胶化方法可以在温和的非化学反应条件下进行，具有优异的生物相容性，更适合封装活细胞[150]。原理是通过非共价相互作用（如氢键[151]、离子配位[152]）形成可逆的网络结构。具体过程包括离子交联（例如，海藻酸盐与Ca2+形成“蛋盒”结构[152]）和热凝胶化（例如，冷却过程中琼脂糖与明胶之间的氢键结合[153]）。这种方法温和，不需要有毒化学物质，且能保持高细胞活力；然而，其机械稳定性通常比共价凝胶弱，在长期培养或复杂机械条件下可能会发生结构降解。为了清晰比较这两种凝胶化策略在机制、优点和局限性方面的差异，主要特点总结在表5中。

表5. 基于水凝胶的单细胞封装技术：代表性成就和优势

技术 类别 具体方法 代表性成就 关键优势 典型应用 参考文献
天然聚合物 海藻酸盐离子交联（预涂层技术） 细胞负载微凝胶产量增加10倍，封装效率>90% 可调节机械性能，延长体内递送时间 干细胞分化调节，体内递送[114]，[154]，[155]
琼脂糖热凝胶化 单细胞形成克隆微凝胶，减少转录组误差 优异的生物相容性，支持长期培养 同源细胞群测序[156]，[157]
合成聚合物 PEGDA光聚合 单细胞负载微凝胶纯度>90%，1 kHz制造 可定制机械性能，模块化生物墨水 3D生物打印[158]，[142]，[159]
混合（天然+合成） 海藻酸盐-ECM渗透网络 7天增殖增加7倍，维持葡萄糖刺激的胰岛素分泌 仿生微环境，支持功能性细胞存活 胰岛细胞封装，组织工程[160]

此外，在水凝胶封装过程中，凝胶化时间和交联剂浓度也是影响细胞活力的关键参数。根据Aránzazu和Paez等人的研究，凝胶化时间必须仔细控制在几秒到几分钟的范围内；如果太慢，会导致细胞沉淀；如果太快，则可能损伤细胞[161]，[162]。相反，交联剂浓度过低会导致凝胶强度不足；而浓度过高则会增加细胞毒性；通常，保持0.1–1%（w/v）的浓度可以保持细胞活力在90%以上[163]。

用于细胞封装的水凝胶材料主要分为合成聚合物和天然聚合物。天然聚合物通常具有固有的生物活性、优异的生物相容性和可降解性[154]。尽管合成聚合物可以精确调节物理和化学性质，但它们缺乏天然的细胞识别位点，通常需要额外的功能化处理[164]，[165]。进一步结合这两种聚合物类型可以进一步增强单细胞封装的可控性和灵活性，拓展其在生物医学中的应用。近年来，由于其温和的聚合条件和优异的生物相容性，天然聚合物在细胞封装中得到了广泛应用[1]。在单细胞封装研究中，海藻酸钠[154]，[155]、琼脂糖[157]和明胶[166]是最常用的天然聚合物。琼脂糖是一种从红藻中提取的线性多糖，在温度达到37℃时聚合，在冷却至约20℃时形成交联凝胶[167]，[168]。低熔点琼脂糖因其出色的生物相容性和温和的凝胶化条件而在细胞封装实验中被广泛使用[169]。例如，Liu等人提出了“同源菌落测序方法”，将单个酵母细胞嵌入低熔点琼脂糖滴中（图7a）[156]。收集后，这些滴在培养过程中会形成琼脂糖微凝胶，并发展成由单个细胞衍生的菌落微凝胶。这种方法能够在单细胞转录组学分析中获得足够的RNA产量，同时将误差降至最低。下载：下载高分辨率图片（414KB）下载：下载全尺寸图片图7. 单细胞封装在氢凝胶材料中。 (a) 通过将单个酵母细胞封装在琼脂糖微滴中，恢复微凝胶，然后培养它们以形成菌落来制备含有菌落的琼脂糖微凝胶[156]。 (b) 用于细胞封装的海藻酸微凝胶的一步微流控制备示意图[155]。 (c) 使用海藻酸-脂肪细胞外基质互穿网络氢凝胶进行胰岛细胞微封装的示意图[160]。海藻酸是从褐藻中提取的水溶性多糖[170]。它通过其葡萄糖醛酸链的羧基与Ca2+等二价阳离子的瞬时结合形成氢凝胶[171]。这些凝胶微球是细胞生物学研究、组织工程和药物筛选的重要工具。例如，Mao等人报告了一种创新的“预涂层”单细胞封装技术[114]。在这项研究中，碳酸钙纳米颗粒被吸附在细胞表面，然后通过微流控技术形成滴，从而实现从内到外的精确交联。含有细胞的微凝胶的产量提高了近十倍，封装效率超过90％。这项工作实现了对单细胞级别氢凝胶机械性能的精确调控，并展示了其在调节干细胞分化和延长体内递送时间方面的巨大潜力。在此基础上，Wang等人开发了一种基于滴微流控平台的技术。该技术能够在单细胞级别连续封装间充质干细胞（MSCs）到海藻酸微凝胶中（图7b）[155]。这种方法不仅保持了细胞的高存活率和功能活性，还扩展了细胞加载微凝胶的大规模生产，促进了这项技术在特定治疗应用中的发展。相比之下，基于合成聚合物的单细胞氢凝胶封装技术可以精确构建可控的细胞微环境[142]、[159]。这些材料的分子结构和交联密度可以灵活调整，以定制微载体的机械性能。通常，包含光引发剂、交联剂和单体的细胞悬浮液被用作分散相[172]。在微流控芯片中形成滴后，通过紫外线引发聚合以实现凝胶固定[173]。例如，Kamperman等人[158]使用聚乙二醇二丙烯酸酯在微流控设备中以1 kHz的速率封装细胞（人间充质干细胞或牛软骨细胞），并在紫外交联后制备出高活性的细胞加载微凝胶。进一步的流式细胞术分选获得了纯度大于90％的单细胞负载微凝胶，这些微凝胶可用作模块化生物墨水，实现单细胞精度的3D生物打印构造。需要注意的是，此过程中的紫外线照射可能对细胞构成一定的毒性风险。然而，这类合成材料通常缺乏天然的细胞粘附位点，可能导致封装细胞因“生态位依赖性凋亡”而活性降低。为了保留合成材料的精确性和可控性优势，并赋予其必要的生物活性，研究人员开发了多种生物功能化策略。例如，Wang等人创新地将来自人脂肪组织的全部组分细胞外基质（ECM）与海藻酸结合，构建了互穿网络氢凝胶（图7c）[160]。在这项研究中，通过ECM的热凝胶化和海藻酸的离子交联成功封装了胰腺β细胞。得益于ECM提供的复杂生化信号，封装细胞的存活率和增殖能力显著提高。一周后，细胞数量增加了七倍，并保持了其特征性的葡萄糖刺激胰岛素分泌功能。这有效地验证了将天然ECM生物分子整合到基本氢凝胶中以构建仿生微环境的可行性。

3.3. 单细胞分选技术单细胞分选是基于滴的单细胞分析过程中的关键步骤。其核心目的是：(i) 从异质群体中富集稀有目标细胞；(ii) 移除可能影响下游检测的死亡或低活力细胞；(iii) 筛除不需要的滴，如空滴或多细胞滴，从而提高后续分析的效率和准确性。借助上述单细胞封装技术，可以实现单细胞的物理分离，并构建大量独立的微反应系统。然而，在药物研究和开发过程中，对高价值稀有细胞（如高效分泌抗体的B细胞、肿瘤干细胞、特定免疫细胞等）的精准定位和分离提出了极高的要求[174]、[175]。目前，已经开发了多种基于单细胞滴封装平台的高性能分选技术。根据作用原理，它们可以分为两类：基于标记的分选技术和无标记分选技术。为了清楚比较基于标记和无标记分选技术在原理、优势和局限性方面的差异，主要特点总结在表6中。表6. 基于滴的单细胞分选技术技术类别具体方法代表性成就关键优势典型应用参考文献标记分选荧光激活滴分选（FADS）富集因子约220倍，每次处理超过10^6个滴基于分泌蛋白的功能筛选，不受表面标记影响抗体分泌细胞筛选[112]LIFT-AMFS（激光转移+膜过滤器）CTC捕获率88％，单细胞分选产量超过95％直接从全血中富集，保持活力稀有CTC单细胞测序[176]无标记分选SERS-滴微流控首次实现单细胞表面糖链表达的高通量成像无标记，静态阵列检测细胞表面糖基化分析[177]3.3.1. 标记细胞分选标记细胞分选技术依赖于细胞表面或内部的特定分子标记，并通过抗体-抗原识别原理实现目标细胞的准确识别和分离。荧光激活细胞分选（FACS）是基于滴平台上的这种技术的典型代表。Mazutis等人系统地介绍了一种基于滴微流控技术的高通量单细胞分析和分选平台（图8a）[112]。这项技术的核心优势是单细胞和检测试剂共同封装在一个改进型的滴中。每个滴作为一个独立的微反应器，实现对分泌蛋白的快速和高度敏感的检测，克服了依赖表面标记的传统流式细胞术的局限性。以抗体分泌细胞的筛选为例，研究团队展示了“滴中三明治检测方法”。在这种方法中，一个杂交瘤细胞、一个涂有捕获抗体的微珠和一个荧光检测抗体被共同封装在一个50 pL的滴中。细胞分泌的抗体被微珠捕获并与荧光探针结合，从而使荧光信号集中在微珠表面，在不需要洗涤步骤的情况下15分钟内产生强荧光信号。基于这一信号，团队使用介电驱动的荧光激活滴分选技术成功从大量非分泌细胞中富集了目标细胞。实验结果显示，单轮分离的富集因子高达约220倍，这验证了该方法的高特异性和效率。这项研究提出了一种完整且可重复的滴微流控单细胞分析方案，特别适合基于分泌蛋白的高通量细胞筛选。下载：下载高分辨率图片（628KB）下载：下载全尺寸图片图8. 基于单细胞封装的分选技术。(a) 基于滴的微流控方案，用于单细胞的高通量分析和分选[112]。(b) LIFT-AMFS富集和提取单个CTC的示意图[176]。(c) 应用于单细胞分析的SERS滴微流控技术[177]。(d) pDEP-DLD-RACS系统配置示意图[178]。磁激活细胞分选（MACS）是另一种广泛使用的高通量技术，基于超顺磁颗粒标记和磁场梯度分离原理。MACS系统操作简便，分选周期通常少于30分钟，细胞活性保留率超过90％。这项技术特别适用于临床细胞产品的生产和大规模细胞库的构建。例如，北京大学王伟教授团队开发的LIFT-AMFS系统创新性地结合了激光诱导的前向转移技术和两级微孔膜设备，实现了从全血中高效富集和分选高活性循环肿瘤细胞（图8b）[176]。该系统的细胞捕获效率高达88％，处理通量为15.0 mL/min，单细胞分选产量超过95％，并且细胞活性可以保持，适用于后续的单细胞测序和体外培养。3.3.2. 无标记细胞分选无标记细胞分选技术不依赖于已知的表面标记，而是基于细胞的生物功能[179]、[180]。这项技术绕过了已知标记的前提，因此在发现和识别新的细胞亚群方面具有独特优势。拉曼流式细胞术是一种无标记技术，可以根据细胞的内在代谢特性进行分选。Willner等人首先通过结合表面增强拉曼散射和滴微流控技术，开发了一个用于单细胞表面糖链表达分析的高通量无标记成像平台（图8c）[177]。在这项研究中，一个前列腺癌细胞和一个小麦胚乳凝集素功能化的SERS纳米探针通过微流控设备共同封装在一个水包油滴中，并将滴固定在阵列中进行静态光谱分析，有效地克服了传统流式检测中信号获取时间有限的问题。随后，Wang等人开发了一种新的拉曼激活细胞分选技术，称为pDEP-DLD-RACS（图8d）[178]。该技术结合了宽通道采样和正介电驱动的确定性侧向位移力场，实现了无标记、非侵入性的高通量单细胞分选。研究表明，pDEP-DLD-RACS系统表现出优异的性能，如高精度（>90％）、高通量（约600事件/分钟）、高回收率（>85％）和超长稳定运行时间（>10小时），并且可以保持细胞活性完整。此外，结合人工智能识别的微孔芯片技术构成了另一种功能性分选平台。ASONE自动高通量单细胞视觉筛选系统使用孔径为10–30 μm的微孔芯片物理分离单细胞。通过AI识别高分泌细胞后，使用玻璃毛细管进行非破坏性回收，细胞存活率超过90％。该平台可以在3小时内完成分选，替代了传统的几周过程，特别适合抗体开发和癌症研究。4. 单细胞滴封装技术在药物探索中的应用单细胞滴封装技术的出现为药物探索提供了革命性的突破工具[181]。其核心优势在于可以独立操作和高效分析微米级滴中的单细胞、药物分子或载体。这种能力揭示了被群体平均值掩盖的关键信息。以下将系统地阐述这项技术在整体药物研究中的广泛应用。4.1. 药物靶点发现药物靶点是存在于人类或病原体中的疾病特异性分子[182]。发现新的有效靶点是现代药物研究和开发的核心任务，重点在于识别与疾病发展密切相关的分子途径和关键调节因子[183]、[184]、[185]。传统的靶点发现方法主要依赖于群体水平的组学分析，如基因组学[186]、蛋白质组学[187]或转录组学[188]。这种方法往往掩盖了细胞异质性，导致在少数关键细胞亚群中缺乏潜在的表达或调节靶点[189]。单细胞技术的兴起为准确识别疾病相关靶点提供了新途径。例如，Ramsk?ld等人开发的Smart-Seq技术通过进行循环肿瘤细胞的单细胞转录组测序，直接识别了在罕见肿瘤细胞中特异性表达的膜蛋白候选靶点[190]。这项技术不仅克服了传统群体水平分析中细胞异质性的掩盖问题，还为循环肿瘤细胞的个性化治疗策略的进一步发展提供了可靠的基础。在肿瘤和免疫治疗领域，单细胞水平的靶点发现正逐渐成为研究热点[191]。尽管最初在靶点识别中应用了单细胞测序等技术，但在通量和集成方面仍存在挑战。为了解决这一核心问题，单细胞滴微流控技术提供了一个新的技术平台。利用其高通量、低样本消耗、优异的密封性能和独立反应单元的优势，该技术能够高效地将单个细胞与条形码系统一起封装在纳升级别的滴中[192]、[193]。这使得能够在复杂组织样本中对数千到数万个细胞进行并行、高分辨率的转录组分析。这不仅使我们能够以前所未有的清晰度绘制组织细胞图谱，并精确识别导致罕见疾病的细胞，还允许深入分析细胞间通信网络[194]。因此，它为发现新型的可药用分子靶点开辟了一条突破性的途径[195]。基于这一技术平台，研究人员可以高效地识别出使用传统方法难以捕获的大型细胞群体中的罕见疾病致病亚群。例如，Klein等人首次构建了一个名为“in Drop”的高通量单细胞滴液转录组测序平台[196]（图9a）。在这项研究中，一个微流控装置将单个细胞、裂解液、逆转录试剂以及携带条形码引物的水凝胶微球封装在纳米升规模的水包油滴液中，形成独立的反应单元。在逆转录过程中，每个滴液中的mRNA会被标记上唯一的细胞条形码，从而在随后的混合测序中精确追踪每个转录本的细胞来源。该研究成功验证了in Drop的高通量、高细胞捕获效率和低技术噪声等优点。通过分析小鼠胚胎干细胞及其分化过程，它系统地揭示了以前难以捉摸的罕见细胞亚群，为识别特定于罕见细胞的靶点奠定了方法学基础。同样，Maciosko等人的“Drop-seq”技术对大约44,000个来自小鼠视网膜的单细胞进行了大规模分析[38]。通过无监督聚类，他们识别出包含所有已知神经元和胶质细胞类型的39个细胞群体，并进一步细分了多个罕见亚型（图9b）。这项研究充分展示了单细胞滴液微流控技术在系统解析细胞类型特异性分子标记方面的强大能力，为在复杂疾病组织中识别有治疗前景的靶点提供了全面的细胞映射支持。下载：下载高分辨率图像（458KB）下载：下载全尺寸图像图9. 单细胞滴液封装技术在药物靶点发现中的应用。(a) 基于滴液微流控的单细胞转录组测序（in Drop）的工作流程图[196]。(b) 基于滴液微流控的单细胞转录组测序（Drop-seq）的工作流程图[38]。(c) 利用单细胞RNA测序分析人类胶质瘤免疫微环境的研究示意图[197]。在肿瘤免疫疗法中，Abdelfattah等人使用单细胞RNA测序对201,986个人类胶质瘤和免疫细胞进行了系统分析，揭示了胶质瘤微环境中免疫细胞的显著空间和分子异质性[197]（图9c）。研究团队识别出九种不同的髓系细胞亚型，其中五种与患者预后显著相关，表明它们在疾病进展中起关键作用。进一步分析表明，S100A4在免疫抑制性T细胞和髓系细胞中高度表达，使其成为潜在的免疫治疗靶点。通过在小鼠模型中敲除S100A4，研究人员证实它可以重塑肿瘤免疫微环境，增强T细胞的浸润和激活，并显著延长生存期。这项研究提供了胶质瘤免疫微环境的图谱，展示了单细胞滴液微流控技术在解决肿瘤异质性和识别治疗靶点方面的能力，并为开发针对“免疫冷肿瘤”的治疗策略提供了理论和实验基础。

4.2. 高通量药物筛选
高通量筛选（HTS）是识别先导化合物的主要前提[20]、[198]、[199]。然而，传统的筛选方法（如基于96孔板的方法）将细胞群体视为均质整体，从而忽略了关键少数亚群对药物的特异性反应[200]。这种平均分析导致忽视了潜在的有效药物，并未能准确揭示药物的作用机制或药物耐药的起源[201]。因此，迫切需要能够在单细胞分辨率下进行筛选的新技术。单细胞分析技术的出现为解决细胞异质性问题提供了强大的工具。其中，滴液微流控技术通过高通量、精确控制微环境和低试剂消耗等优点重新塑造了单细胞药物筛选的范式[112]、[202]。该技术结合了微观流体的精确操控和高通量滴液生成，可以将单个细胞、药物分子或化合物包裹在均匀的滴液中。通过将每个滴液转化为独立的微反应器，实现了数千个单细胞的并行且无干扰的药理学测试。在基础的单细胞毒性筛选中，滴液微流控技术显示出其在早期癌症治疗中新药开发中的理想平台潜力。例如，Brouzes等人[202]提出了一个集成滴液微流控平台，以评估药物库对U937细胞的细胞毒性效应（图10a）。在这项研究中，他们首先构建了一个光学编码的药物库，不同的药物浓度对应独特的荧光标记。随后，在微流控芯片中，一个药物滴液与包含单个U937细胞的滴液准确融合，并孵育24小时以充分发挥药物作用。然后，这些滴液被重新注入分析芯片并与含有细胞活性荧光染料的滴液融合。经过短暂孵育后，通过分析芯片和药物编码的读数测量每个滴液的荧光信号，从而揭示了单细胞对药物的异质反应。该平台凭借高通量滴液操作、模块化设计和精确的单细胞封装成为单细胞药物筛选的优秀平台。下载：下载高分辨率图像（327KB）下载：下载全尺寸图像图10. 单细胞滴液封装技术在药物筛选中的应用。(a) 使用滴液微流控进行单细胞筛选的工作流程[202]。(b) CP-seq技术利用滴液微流控在单细胞水平上实现高通量组合药物筛选和转录组分析[203]。(c) 该集成滴液微流控平台（CelliGO）基于单细胞抗体活性实现高通量筛选和测序[204]。Gao等人使用光刻技术制备了可控的PEG水凝胶微结构[205]。在同一微通道中，分别将单个HepG2细胞和A549细胞封装在单独的圆柱形和矩形胶凝室中。给予不同的抗癌药物后，通过GSH / ROS双荧光探针并行读取每种细胞表型的药物耐药性差异。这种方法验证了“隔室化-单细胞给药-多参数分析”策略的可行性和高通量潜力。与单一药物筛选相比，联合药物治疗在通过同时干预多个致病途径来提高疗效和延缓药物耐药性方面展现出巨大潜力。滴液微流控技术还为单细胞水平的组合药物筛选提供了强大的支持平台。例如，Shen等人开发了一个微流控芯片，集成了多浓度梯度生成器和单细胞捕获阵列，以评估两种抗癌药物5-氟尿嘧啶和顺铂在单细胞水平上的协同效应[206]。结果显示，5-氟尿嘧啶和顺铂的组合对HepG2细胞显示出显著的协同杀伤效应，其效果优于单一药物。这项研究首次揭示了药物的协同效应和剂量依赖性，并发现体积小、变形大的细胞具有更强的药物耐药性。该平台为研究肿瘤异质性、优化组合方案和筛选有效的抗癌药物组合提供了新的可靠技术手段。然而，组合药物筛选面临流量和检测维度的双重挑战。为应对这一问题，研究人员进一步将滴液微流控技术与单细胞测序技术相结合，深入分析药物的作用机制。例如，Xie等人开发了“组合扰动测序（CP-seq）”技术[203]（图10b）。该技术使用微孔芯片实现滴液的随机配对。首先，将不同药物和预先标记有独特寡核苷酸条形码的单细胞封装在滴液中，然后在微孔阵列中随机配对并融合成含有两种药物滴液和一个细胞滴液的混合物，从而在单次实验中处理数千种药物组合。随后的单细胞RNA测序可以同时分析细胞的整个转录组反应及其接收的具体药物组合。因此，以单细胞分辨率深入揭示了组合药物的协同机制和细胞异质性反应。该方法突破了传统筛选在流量和检测维度上的限制，为高效组合疗法的系统发现和优化提供了新的技术平台。值得注意的是，滴液微流控技术不仅限于小分子药物的应用，还解决了传统单克隆抗体筛选的关键问题，在治疗性抗体的开发中具有特殊的应用价值[174]、[207]、[208]。例如，Shembekar等人开发了一个基于滴液微流控的高通量筛选平台[209]。该平台可以直接筛选特异性结合完整肿瘤细胞上受体的抗体。该平台通过创新的两种颜色荧光标准化方法实现超灵敏的定量检测，每次检测仅需33 fg的IgG。该系统在高通量筛选方面表现出色，能够将罕见和靶点特异性分泌抗体的细胞富集220倍。这是通过每次实验处理超过100万个滴液实现的，相当于筛选多达80,000个克隆。同时，该技术不依赖于细胞增殖，为直接从患者初级血浆细胞中快速发现治疗性抗体（如肿瘤特异性抗原）开辟了新的途径。此外，Gérard等人开发了一个名为CelliGO的高通量滴液微流控平台[204]（图10c）。该平台结合了单个抗体分泌细胞的功能筛选和配对VH-VL测序。利用荧光重新定位检测，它能够高通量筛选分泌IgG的初级细胞的结合活性，针对可溶性抗原（如破伤风类毒素）和膜抗原（如TSPAN8）。带有唯一条形码的水凝胶珠的单细胞逆转录实现了抗体表型和基因型之间的精确关联。研究证实，从免疫小鼠中鉴定出的大多数重组抗体（93%）结合可溶性抗原，而一小部分（14%）识别膜抗原。该平台成功实现了人类记忆B细胞库的分析。它不仅为抗体筛选和测序提供了一种高效、多功能的策略，还为深入理解体液免疫反应和发现治疗性抗体提供了强大的工具。

4.3. 靶向药物递送系统开发
高效准确的药物递送系统是现代药物研究和开发的核心，其有效性直接决定了药物的生物利用度和治疗预后[210]、[211]。然而，传统的纳米递送载体（如脂质体或纳米颗粒）仍面临技术限制，如靶向性不足[212]、药物负载效率低[213]以及批次间的差异性[214]，这些限制严重限制了它们的临床转化前景。近年来，单细胞滴液微流控技术的兴起为解决这些挑战提供了变革性的方法。该技术通过将反应系统分割成数百万个纳升级的升级滴液来实现。这不仅实现了药物载体的高通量和单分散合成，还能够在单细胞水平上进行功能筛选[215]、[216]。每个滴液可以被视为一个独立的微反应器，从而能够在单细胞水平上准确评估载体的递送效率和生物学效应，大大加速了高性能药物递送平台的开发[217]、[218]。在载体构建和筛选方面，滴液微流控技术因其出色的控制释放合成和高通量筛选能力而带来了革命性的突破。通过控制滴液中的合成反应，该技术不仅能够制备具有优异单分散性的脂质体和聚合物纳米颗粒，还能在同一平台上快速筛选药物负载效率和释放动力学[215]、[216]。例如，Chen等人使用并行微流控混合装置实现了数百个siRNA脂质纳米颗粒（LNP）的快速可控合成[219]。他们的研究发现，传统的体外脂质复合物筛选模型会产生高达90%的假阴性率。基于这种微流控技术构建的高质量LNP能够在体外筛选时更准确地预测体内效果，并成功鉴定出七种在动物体内实现高效基因沉默（>90%）的新脂质材料。这充分展示了该技术在合理设计载体方面的巨大潜力。此外，单细胞滴液封装技术的高精度和高通量也为构建更复杂的体外肿瘤模型（如类器官[220]、[221]）提供了技术支持。这使得能够在组织水平上评估靶向递送系统。在解决靶向这一核心问题方面，滴液微流控技术也展现出了强大的能力。Pridgen等人使用集成微流控系统快速合成了带有不同配体的纳米颗粒库（图11a）[222]。通过体外筛选，高效地确定了一种能够特异性识别癌细胞表面标记物的最佳配方，并在动物实验中验证了其显著的肿瘤靶向性和有效性。更为突破性的是Chintapula等人开发的DASH技术，这是一种基于液滴辅助的挤出微流控平台（图11b），用于构建复杂的靶向载体[223]。该技术通过在狭窄通道中产生高剪切力，可控地促进外泌体（EV）与脂质纳米粒子（LNP）的膜融合，从而有效地制备出兼具天然靶向性和合成载体药物装载能力的EV-LNP混合体。这一过程不仅以最小的破坏程度实现了超过65%的高效融合率，还最大程度地保留了EV膜上的功能性靶向蛋白，并成功构建了装载了药物（Ulixertinib）的EV-LNP混合体。通过单细胞水平分析，与单独的LNP或EV相比，这些混合体在黑色素瘤模型中显示出显著增强的靶向性和杀伤效果。这项工作为高效构建具有复杂功能的下一代靶向递送载体提供了一个强大且可扩展的平台。

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图11. 单细胞液滴封装技术在药物递送系统中的应用。
(a) 用于生成细胞外囊泡-脂质纳米粒子（EV-LNP）混合体的液滴挤出微流控平台示意图，用于靶向药物递送[222]。
(b) 用于纳米粒子（NPs）组合合成的微流控平台示意图[223]。
(c) 基于微流控的多维度、可控肿瘤球体构建策略示意图[224]。

在成功构建并优化了载体后，单细胞液滴微流控技术的应用范围进一步扩展到下游分析，在临床前研究和个性化治疗领域展现出巨大潜力。在临床前筛选层面，该技术能够构建出更接近人体环境的复杂模型。例如，Hou等人开发的 multidimensional可控肿瘤球体构建平台[224]可以精确调控球体大小、细胞组成和微环境（图11c），为高通量、高重复性的药物筛选和肿瘤生物学研究提供了理想工具。此外，这项技术直接推动了个性化治疗策略的发展。Guo等人报道的可编程光控微胶囊系统[225]是微流控技术向下游递送应用的杰出典范，该系统能够对外部光刺激做出响应，实现空间-时间和剂量可控的药物释放。结合磁导航功能，为肿瘤的介入精准化疗提供了新解决方案。这两项研究共同表明，液滴微流控技术正从构建工具演变为集成解决方案，通过集成模型构建、药物筛选和精准治疗，在癌症研究和个性化医学领域展现出颠覆性潜力。

5. 结论与未来展望
本文系统回顾了单细胞液滴封装技术在药物发现中的核心原理、方法及应用案例。该技术凭借其在单细胞、药物分子及微尺度载体上的高通量处理能力和低交叉污染控制能力，能够生成均匀的液滴微反应器。结合被动/主动封装策略，它突破了泊松分布的限制，实现了单细胞的精准封装和多参数分选。其优势在于揭示细胞异质性，在目标识别、高通量药物筛选和精准递送系统开发方面展现了独特优势，能够识别罕见耐药亚群、评估单细胞效能并指导个性化给药。然而，从实验室研究到成熟应用，该技术仍面临以下五个挑战：
(i) 在封装和检测效率方面，单细胞进入液滴的过程仍受泊松分布或主动控制精度的限制，难以稳定达到理想的单细胞封装率；同时，下游检测方法在通量、灵敏度和多参数并行检测能力方面存在明显不足。
(ii) 在材料生物学方面，常用封装材料（如液滴或水凝胶）的物理化学性质相对简单，难以模拟体内复杂的细胞外基质微环境，这限制了长期培养与功能分析之间的生理相关性。
(iii) 在标准化和可重复性方面，不同实验室在芯片设计、流体参数、细胞来源及操作程序方面的差异导致研究结果的可比性较差，阻碍了技术的重复验证。
(iv) 在临床转化方面，现有平台大多仍处于基础研究阶段，GMP生产、动物模型验证与实际药物开发过程之间存在明显脱节。
(v) 在数据分析方面，单细胞分析产生的海量数据缺乏高效且可解释的人工智能分析模型，尤其是在准确识别罕见亚群和药物反应预测方面，现有算法能力仍有限。

鉴于上述挑战，未来的研究应聚焦以下方向：
(1) 集成自动化平台和多模式单细胞检测。为提高封装和检测效率，应优先发展基于机器视觉和实时反馈控制的智能主动封装系统，结合高频微阀、声波或介电泳技术，实现单细胞的高效捕获，将单细胞封装率提升至95%以上。同时，开发集成多色荧光、拉曼光谱或质谱检测模块，实现高通量、多参数并行检测，提高信息获取的维度与灵敏度[226]。已开发出“样品输入即结果输出”的集成微流控系统，将细胞封装、药物处理、检测和分选集成在同一芯片上，减少人工干预和样本损失，提升实验通量和重复性[134]。
(2) 智能响应型封装材料。设计多功能复合水凝胶材料，整合天然细胞外基质成分（如胶原蛋白、透明质酸、层粘连蛋白）和合成聚合物，构建可控的物理化学微环境[227]；通过引入动态交联、应力响应和酶降解等智能特性，构建更接近生理状态的单细胞微环境，改善长期培养与功能分析之间的生理相关性[140]。
(3) 标准化构建和平台通用化。推动芯片设计、流体参数、细胞处理及数据格式的统一行业标准，开发模块化、可互换的微流控平台和商业试剂盒；鼓励跨实验室的基准测试和参考样本共享，促进技术协议的系统优化及结果的可重复验证。
(4) 人工智能驱动分析。利用深度学习模型自动识别液滴中的细胞形态、荧光信号和罕见亚群，并建立药物反应预测框架，加速从海量单细胞数据中提取药物靶标信息[228],[229],[230]。
(5) 临床转化和综合验证。推动微流控芯片的GMP合规制造，实现从单细胞封装到药物反应检测的全流程整合；构建了人肿瘤异种移植模型或类器官共封装平台，直接在微流控芯片上进行动物模型验证和疗效评估，缩短基础研究与临床应用之间的距离[231]。

总之，尽管当前的单细胞液滴封装技术仍面临工程学和生物学的双重挑战，但随着微流控、材料科学和人工智能的深度融合，这项技术正从“单细胞分离工具”演变为“全链条药物发现引擎”，有望真正实现个性化药物开发的范式转变。