卡拉胶-橘皮复合物水凝胶用于修复全层皮肤缺损

《Materials & Design》：Carrageenan-tangerine peel composite hydrogel for full-thickness skin defect repair

　　王琦|乔建设|罗星|顾红|戴子如
北海南湾大学食品工程学院，中国钦州535011

**摘要**
由严重烧伤或创伤引起的全层皮肤缺损仍然是一个主要的临床挑战，因为这些损伤会阻碍皮肤自我修复并增加感染风险。在这项研究中，我们开发了一种基于卡拉胶和橘皮的生物活性复合水凝胶，作为安全且无需交联剂的伤口敷料。卡拉胶提供了稳定的三维网络结构，而橘皮则赋予了水凝胶抗菌性能。与单独使用卡拉胶相比，这种复合水凝胶表现出更强的机械强度、更均匀的多孔结构以及更好的稳定性。体外实验表明其具有优异的生物相容性，并显著促进了成纤维细胞的增殖和黏附。此外，该水凝胶对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有有效的抗菌活性。体内研究进一步证实，该水凝胶能够显著加速伤口愈合、促进胶原沉积并促进全层皮肤缺损处的上皮再生。本研究提出了一种简单而有效的制造多功能水凝胶的策略，突显了它们在伤口愈合和皮肤组织工程中的巨大潜力。

**1. 引言**
皮肤由表皮、基底膜和真皮组成，在维持生理稳态方面起着关键作用[1], [2], [3], [4]。全层皮肤缺损通常由严重烧伤或创伤引起，会导致再生能力的完全丧失，并常常伴随感染和广泛的组织损伤，从而带来重大的临床难题[5], [6], [7]。全球每年有数百万患者遭受烧伤和慢性伤口的困扰，这对医疗系统造成了巨大负担，也凸显了开发有效治疗策略的紧迫性[8], [9], [10]（图1）。

**图1. 用于修复全层皮肤缺损的绿色卡拉胶-橘皮水凝胶示意图**
皮肤移植策略，包括自体移植和异体移植，已被用于治疗全层皮肤缺损。自体微移植相对简单且成本效益高；然而，其临床效果常常受到血管生成不足、瘢痕形成以及由于伤口床条件差和缺血-再灌注损伤导致的移植失败的限制[11]。异体移植则存在供体短缺、疾病传播和免疫排斥的风险[12], [13], [14]。因此，人们开发了使用组织工程支架材料来促进组织再生的方法。

水凝胶具有高水分保持能力、优异的生物相容性和可生物降解性，被探索作为模仿天然皮肤组织结构和功能的人工皮肤替代品。多种材料，包括多糖、胶原蛋白、明胶和合成聚合物，已被用于构建组织工程支架水凝胶。然而，许多这些材料不容易形成稳定的水凝胶，通常需要引入化学交联剂。魏等人开发了一种由明胶甲基丙烯酸酯和巯基化壳聚糖组成的光交联双网络水凝胶，用于伤口愈合[15]。何等人通过光聚合和单宁酸交联的两步工艺制备了鞣酸增强的甲基丙烯酸壳聚糖/甲基丙烯酸丝素蛋白水凝胶，赋予其更好的黏附性和抗氧化性[16]。然而，残留的交联剂可能带来安全风险，限制了其在临床上的应用。

卡拉胶是从红藻中提取的天然多糖[17], [18]，由于其可生物降解性、无毒性和出色的凝胶形成能力而受到广泛关注[19], [20], [21]。因此，组织工程支架已成为皮肤再生的有前景的替代方案[22]。同时，富含黄酮类和酚类化合物的橘皮具有显著的抗菌和抗炎特性[23], [24], [25], [26], [23], [24]。将这些生物活性成分整合到水凝胶系统中，为提高其结构和功能性能提供了有前景的策略。

在这项研究中，我们开发了一种基于卡拉胶和橘皮的复合水凝胶（CNTP）作为无需交联剂的伤口敷料。橘皮的加入不仅改善了水凝胶的机械性能，还赋予了其内在的抗菌和生物活性。CNTP水凝胶表现出优异的生物相容性，促进了成纤维细胞的增殖，并展示了有效的抗菌活性。此外，体内实验证实了其能够加速伤口愈合、增强胶原沉积并促进组织再生。这些发现表明，CNTP水凝胶为开发安全、多功能的水凝胶支架用于皮肤修复和组织工程提供了一种简单而有效的策略。

**2. 实验**
**2.1. 试剂**
卡拉胶（CN，CAS：9000-07-1；分子量：220,000 Da；纯度：≥98%；钙0-3.5%，钠0-2%，钾0-11%；凝胶强度：1300 g/cm3，pH值7-10；卡尔·费歇尔水分含量0%-12%；外观（C107615）：白色至黄色或浅棕色晶体或粉末；20–200 mPa·s）和透明质酸（CAS：9004-61-9）购自上海Aladdin生化科技有限公司；橘皮（TP）购自钦州市永辉超市；其他所有试剂均为分析级。

**2.2. 植入物的制备**
- **卡拉胶植入物的制备**
将不同浓度（5, 10, 15, 20, 25 mg/mL）的卡拉胶加入10 mL离心管中，在80°C下加热直至完全溶解，然后在室温下静置1小时以观察各浓度下的水凝胶形成情况。
- **橘皮的处理**
称取200克干燥的橘皮（TP），放入真空干燥机去除水分。将干燥后的材料在超细粉碎机中处理5分钟。所得粉末依次通过60目和300目筛网，收集通过300目筛网的部分并储存以备后续使用。
- **卡拉胶-橘皮（CNTP）植入物的制备**
将25 mg/mL浓度的卡拉胶溶液加入10 mL离心管中，在80°C下加热直至完全溶解。随后加入0、5、10、15、25 mg的橘皮粉末。将混合物在室温下静置1小时。

**2.3. 物理化学性质表征**
- **卡拉胶植入物的物理化学性质表征**
使用安东帕尔流变仪（Anton Paar, Austria）在25°C恒温下进行流变实验。将不同浓度的卡拉胶水凝胶和透明质酸样品精确放置在一个直径为15 mm的平行板中心。设置流变仪的剪切频率为1%，测量储存模量G’（Pa）和损耗模量G’’（Pa），同时测定黏度。
通过差示扫描量热法（DSC，Mettler-Toledo, Switzerland）评估卡拉胶植入物的热稳定性。称取5 mg的冻干卡拉胶和透明质酸，分别放入铝坩埚中。在氮气保护下以5°C/分钟的速率加热，温度范围为25°C–120°C。
使用傅里叶变换红外光谱（PerkinElmer, USA）分析卡拉胶植入物的结构。将卡拉胶和透明质酸放置在样品台上，扫描波数范围为500–4000 cm?1。
- **CNTP植入物的物理化学性质表征**
将CN和CNTP水凝胶装入1 mL注射器中，挤出成预定形状并拍照以评估其成型性能。通过膨胀测试评估植入物的膨胀率。记录CN和CNTP植入物的初始重量，将其浸入3 mL水中，分别在4、8、12和24小时测量质量，计算各时间点的膨胀率。膨胀率 = (wt - w0) / w0 × 100%，其中w0是干燥水凝胶的初始重量，wt是给定时间膨胀后水凝胶的重量。
通过降解实验评估植入物的耐久性。首先使用真空冷冻干燥机对CN和CNTP植入物进行冷冻干燥。将约5 mg的冻干样品在含有1 M HCl的生理缓冲液中培养4、7、14和21天。培养后，用水洗涤样品并进行离心处理，然后计算降解率。降解率 = (w1 - w2) / w1 × 100%，其中w1是水凝胶的初始干重量，w2是特定时间点后的剩余重量。
使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析卡拉胶植入物的结构。将CN和CNTP植入物切成5 mm高的圆柱体，放置在样品台上并用红外光谱进行分析。

- **抗菌活性**
将100 μL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬浮液（浓度为1×10?–1×10? CFU/mL）均匀涂抹在琼脂板上。将样品（CN和CNTP）轻轻放置在琼脂表面，并在37°C下培养12–24小时以评估抗菌活性。
- **细胞活力和相容性**
- **细胞培养**
人类包皮成纤维细胞-1（HFF-1）细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养基中培养，置于37°C、5%二氧化碳环境中。使用倒置显微镜监测细胞形态和生长情况。当细胞达到约90%的融合度时，用于后续实验。
- **细胞毒性试验**
首先将CNTP植入物浸入高糖DMEM中以获得提取液。然后使用0.25%胰蛋白酶处理HFF-1细胞，并以每孔1×10?细胞的密度接种到96孔板中。在CO?培养箱中培养24小时后，用不同浓度的提取液（0.01、0.05、0.1、0.25和0.5 mg/mL）处理细胞，再培养24小时。随后向每孔加入10 μL CCK-8试剂，并在37°C下培养1–3小时。使用微孔板读数器测量450 nm处的吸光度，计算细胞活力。
- **细胞增殖试验**
用胰蛋白酶处理细胞，并以每孔2×10?细胞的密度接种到96孔板中。在37°C下培养24小时后，向相应孔中加入0.5 mg/mL的CNTP溶液，继续培养1、3和5小时。在不同时间点测量吸光度，并计算细胞增殖率。细胞增殖率 = (At - A0) / A0 × 100%，其中A0是初始时间点的吸光度，At是相应时间点的吸光度。
- **钙黄蛋白-碘化丙啶（CA/PI）染色**
将HFF-1细胞以每孔5×10?细胞的密度接种到激光共聚焦显微镜培养皿中，并在37°C下培养24小时。随后向培养基、CN和CNTP溶液中添加相应成分，培养1和3小时。使用激光共聚焦显微镜（Olympus FV300, Olympus Corporation, Britain）观察和成像细胞形态和分布。

- **斑马鱼活性表征**
- **斑马鱼毒性**
选择状态良好的野生型AB品系斑马鱼幼鱼（受精后3天），每孔放入一条鱼。设置对照组和植入组（浓度分别为0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL）。在不伤害幼鱼的情况下，吸出96孔板中的培养基，并迅速向每孔加入100 μL相应组的溶液。在黑暗条件下培养5天，每天观察幼鱼的存活率和畸形情况（BX63, Olympus Corporation, Britain）。
- **斑马鱼尾鳍修复效果评估**
选择状态良好的野生型AB品系斑马鱼幼鱼（受精后3天），用三氯甲酸麻醉约3秒。按照相同方法去除尾鳍后面的部分，然后将斑马鱼迅速放回E3培养基中。将斑马鱼分为三组：对照组（无尾鳍，3天大的斑马鱼）、模型对照组（有尾鳍，3天大的斑马鱼）和植入组（有尾鳍，3天大的斑马鱼和0.5 mg/mL浓度的植入物溶液）。将斑马鱼随机分配到24孔板中，每孔一条鱼。小心吸出培养基，并迅速向每孔加入1 mL测试物质溶液（对照组除外）。在黑暗条件下将板子置于28°C下培养96小时，每24小时更换一次测试物质溶液。在0、1、3天时用三氯甲酸麻醉斑马鱼，并在显微镜下观察和拍摄照片。
- **小鼠体内的活性评估**
所有动物实验均遵循兰州大学化学与工程学院伦理委员会批准的方案（编号G09, 20,220,711）。从兰州兽医研究所购买了45只雄性昆明小鼠，并提供标准实验室饲料。在麻醉后，所有45只小鼠背部的真皮和表皮被手术切除，形成了直径为15毫米的全层缺损。这45只小鼠随后被随机分为三组（空白组、对照组和样本组），每组15只小鼠。未处理的组（空白组）作为阴性对照。对照组使用了CN水凝胶作为阳性对照。样本组使用了CNTP水凝胶。CN和CNTP被涂抹在伤口上，并在不同的时间间隔（0天、4天、7天、10天和14天）对每组的缺损区域进行拍照。有3只小鼠被安乐死。收集伤口部位，浸泡在4%的福尔马林溶液中，然后用H&E和Masson三色染色法进行染色。组织学图像是在直立显微镜（Olympus BX63，Olympus Corporation，英国）下获得的。

2.8. 统计分析
数据分析使用SPSS Statistics 25软件进行，结果以平均值±标准差的形式呈现。随后，数据经过单因素方差分析（ANOVA），然后使用Duncan多重范围检验进行事后分析。统计显著性阈值设定为P<0.05。除非另有说明，所有实验都重复三次进行。

3. 结果与讨论
3.1. CN植入物的表征
在5mg/mL时，卡拉胶未能形成稳定的水凝胶，而在≥10mg/mL时形成了稳定的凝胶（图1A），表明其凝胶化行为依赖于浓度。流变分析（图1B）显示，储能模量（G'）和损耗模量（G''）都随着卡拉胶浓度的增加而增加，且G'始终超过G''，证实形成了主要是弹性的网络。值得注意的是，随着浓度从5mg/mL增加到25mg/mL，G'从约0.01Pa增加到约246Pa，显示出机械强度的增强。水凝胶的粘度也随着卡拉胶浓度的增加而总体上升（图1C），尽管在中间浓度处观察到一些波动。粘度从5mg/mL时的20.7Pa·s增加到25mg/mL时的34302.2Pa·s。这些结果表明，更高的卡拉胶浓度促进了更强的分子间相互作用和更密集的三维网络的形成，从而增强了水凝胶的机械强度和结构稳定性。

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图1. CN植入物的物理化学表征：(A) 含有不同的浓度CN的小瓶的倒置图像；(B) 不同浓度CN的流变特性；(C) 不同浓度CN的粘度；(D) FTIR光谱；(E) DSC热图；(F) CN植入物的注射性能。

基于卡拉胶的植入物的化学结构通过FTIR光谱进行了表征（图1D）。透明质酸（HA）的光谱在3280–3400 cm?1处显示出特征性吸收带，对应于O-H伸缩振动，在2900 cm?1处为C-H伸缩，在1600–1650 cm?1处为C=O伸缩振动。对于卡拉胶（CN），典型的峰出现在1220–1260 cm?1，对应于硫酸盐基团的S=O伸缩；在930 cm?1处，对应于C-O-C伸缩；在845 cm?1处，对应于C-O-S伸缩；在1040–1070 cm?1处，与糖苷C-O-C伸缩相关。重要的是，这些特征峰在复合植入物的光谱中基本保持不变，表明在制备过程中HA和CN的主要功能基团保持完整。没有观察到显著的峰移位或消失，表明植入物的形成主要基于物理相互作用而不是化学键的断裂。这种结构完整性有助于保持卡拉胶的固有性质，并有助于形成具有理想凝胶形成能力的稳定网络结构。

通过差示扫描量热法（DSC）评估了组分的热稳定性（图1E）。透明质酸的热变性温度为90.6°C，而卡拉胶的热变性温度为97.0°C。这些结果表明，卡拉胶的热稳定性略优于透明质酸，且两种材料都表现出良好的耐热性。

水凝胶被挤出到注射器中以评估其可塑性（图1F）。CN水凝胶成功被塑造成各种形状，包括熊猫、鱼和蝴蝶，显示出优异的可塑性和挤出性能。

3.2. CNTP植入物的物理化学表征
加入柑橘皮（TP）显著增强了水凝胶的机械性能。流变分析（图2A）显示G'显著增加（从约2.4 kPa增加到约7.6 kPa），表明网络刚度得到增强。这种增强可以归因于TP衍生的多酚与卡拉胶链之间的氢键和次级相互作用，导致交联密度的增加。

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图2. CNTP植入物的物理化学表征：(A) 不同浓度下CNTP的储能模量（G'）和损耗模量（G''）；(B) 不同浓度下CNTP的粘度；(C) FTIR光谱；(D) 膨胀行为；(E) 在生理缓冲液中的降解；(F) 在HCl溶液中的降解；(G) 注射性能；(H) 扫描电子显微镜（SEM）图像。

通过流变测量评估了TP浓度对CNTP植入物粘度的影响（图2B）。随着TP浓度的增加，植入物的粘度逐渐增加到39,120, 56,910, 68,900, 79,790, 111,400, 和124,400 mPa·s。这一趋势表明，TP的加入有助于增强水凝胶网络。粘度的增加可能归因于系统内分子间相互作用的增强，如氢键和物理缠结。

FTIR光谱用于研究卡拉胶（CN）和柑橘皮（TP）之间的相互作用（图2C）。CN植入物显示出典型的特征峰，包括硫酸酯基团的S=O伸缩振动在1220–1260 cm?1，C-O-C伸缩在930 cm?1（对应于3,6-无水-D-半乳糖残基），C-O-S伸缩在845 cm?1（归因于D-半乳糖-4-硫酸盐），以及糖苷C-O-C伸缩在1040–1070 cm?1范围内。此外，3400 cm?1附近的宽吸收带和2900 cm?1附近的峰分别对应于O-H和C-H伸缩振动。加入TP后，CNTP植入物保留了卡拉胶的主要特征峰，表明其主要骨架结构保持完整。同时，在1600–1650 cm?1和1500–1600 cm?1出现了新的或增强的吸收带，这可能源自TP中的多酚和黄酮类化合物。这些结果表明，TP成功地结合到了CN基质中，复合系统主要通过物理相互作用稳定，而不是形成新的共价键。

通过膨胀实验评估了植入物的膨胀情况（图2D）。CN植入物在4小时、8小时、12小时和24小时的膨胀率分别为131%、132%、134%和131%，表明膨胀行为略有波动但总体稳定。相比之下，CNTP植入物在同一时间点的膨胀率分别为108%、109%、107%和108%，始终低于CN植入物。这些结果表明，加入柑橘皮减少了植入物的吸水率和膨胀能力，可能是由于形成了更紧凑的内部网络结构。

通过降解实验评估了植入物的耐用性（图2E, F）。在生理缓冲液中，CN植入物在4天、7天、14天和21天的降解率分别为21.0%、28.7%、66.7%和74.7%，而CNTP植入物的降解率分别为20.7%、38.0%、44.7%和64.0%（图2E）。在酸性条件下，CN植入物在同一时间点的降解率分别为26.0%、34.0%、39.3%和43.3%，而CNTP植入物的降解率分别为27.3%、28.0%、28.6%和37.3%。这些结果表明，CN植入物在生理条件下快速降解，特别是在7天到14天之间，而CNTP植入物在早期表现出更高的稳定性，在后期降解速度较慢（图2F）。在酸性条件下，两种植入物的降解速度都比在生理条件下慢，其中CNTP植入物的降解稳定性更强。这表明加入柑橘皮增强了植入物的耐酸性和整体结构完整性。

CNTP植入物被挤出成各种形状以评估其可塑性。结果表明，CNTP水凝胶具有良好的可塑性，可以被塑造成蝴蝶等形状（图2G）。使用扫描电子显微镜（SEM）对水凝胶的形态进行了表征（图2H）。CN的SEM图像显示了一个随机排列的纤维网络，孔径大小不均匀。相比之下，CNTP显示了一个有序的多孔网络，平均孔径为198±10 μm。这些结果表明，加入柑橘皮促进了均匀有序的多孔结构的形成，增强了水凝胶的结构稳定性和潜在的功能性能。

CNTP水凝胶的形成主要由物理交联机制控制。冷却时，卡拉胶链发生从线圈到螺旋的转变，随后是螺旋聚集，形成三维网络结构。这一过程主要由卡拉胶链上的硫酸盐基团相关的氢键和静电相互作用驱动。此外，加入柑橘皮提供了多酚和黄酮等生物活性化合物，这些化合物可以通过氢键和疏水相互作用与卡拉胶进一步相互作用。这些相互作用增强了水凝胶网络的结构完整性和稳定性。观察到的储能模量（G'）的增加，以及FTIR峰位的移动和O-H伸缩的增强，进一步支持了物理交联网络的形成。

3.3. 卡拉胶-柑橘皮植入物的抗菌性能表征
为了评估水凝胶的广谱抗菌活性，使用纸片扩散法测试了两种临床相关的病原体——革兰氏阴性大肠杆菌（E. coli）和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌（S. aureus）。纯卡拉胶（CN）是一种缺乏内在抗菌活性且容易受到微生物污染的多糖，对这两种菌株均未产生明显的抑制圈。相比之下，CNTP水凝胶对这两种微生物都产生了清晰的抑制圈，显示出有效的抗菌活性（图3A）。定量分析进一步显示，CNTP水凝胶对大肠杆菌的抑制率约为52%（图3B），对金黄色葡萄球菌的抑制率约为44%（图3C），证实了其显著的抗菌效果。值得注意的是，虽然对金黄色葡萄球菌的抑制圈略大于对大肠杆菌的抑制圈，但对大肠杆菌的更高抑制率可能归因于膜通透性和对活性化合物的敏感性差异。金黄色葡萄球菌较大的抑制圈可能是由于革兰氏阳性细菌细胞壁中肽聚糖含量较高，这使得其与柑橘皮中的多酚、黄酮等生物活性成分相互作用，从而破坏了膜完整性。这些发现表明，CNTP水凝胶对革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌都表现出有效的抑制活性，突显了其作为抗菌功能支架的潜力。

3.4. 卡拉胶-柑橘皮植入物的细胞活性表征
使用细胞毒性试验评估了水凝胶的生物相容性（图4A）。CN和CNTP组在所有测试浓度下的细胞存活率都高于100%，表明没有细胞毒性效应。值得注意的是，CNTP在相应浓度下的细胞存活率略高于CN，表明其细胞相容性有所提高。

使用细胞增殖试验评估了植入物的生物活性（图4B）。与CN组（24–72小时时为102–103%）相比，CNTP组显示出增强的增殖（104–110%），表明加入柑橘皮促进了成纤维细胞的生长。进一步使用CA/PI染色评估了植入物的生物活性（图4C）。在培养24小时和72小时后，HFF-1细胞在空白对照组、CN组和CNTP组中保持高存活率。与空白组相比，CN水凝胶促进了成纤维细胞的增殖；此外，CNTP显著增加了相对于单独使用CN时的存活细胞数量。这些结果表明，CNTP为成纤维细胞的生长提供了更好的微环境，表现出优异的生物相容性和促进细胞增殖的能力。

为了评估细胞-基质相互作用，进行了免疫荧光染色以检查成纤维细胞肌动蛋白骨架的形态（图4D）。与对照组相比，培养在水凝胶中的细胞显示出更细长和纺锤形的形态，以及更发达的肌动蛋白纤维。特别是CNTP组显示出增强的细胞扩散和细胞骨架延伸，表明细胞-材料相互作用得到改善。

3.5.### 花斑鱼对CNTP植入物的活性评估

为了评估水凝胶的毒性，将斑马鱼暴露于不同浓度的水凝胶溶液中，并在1天、2天和3天内进行观察（图5A）。没有观察到任何组的死亡或畸形现象，这表明该水凝胶对斑马鱼的毒性可以忽略不计，进一步证实了其出色的生物相容性。

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**图5. CNTP植入物在斑马鱼中的生物相容性和生物活性：**
- （A）1天、2天和3天时的斑马鱼毒性；
- （B）1天、3天和5天时的斑马鱼尾鳍再生情况。

通过斑马鱼尾鳍再生实验进一步评估了水凝胶的生物相容性和生物活性（图5B）。将斑马鱼培养在水凝胶溶液中，在1天、3天和5天内均未观察到死亡或畸形现象。尾鳍再生率随时间逐渐增加，表明该水凝胶促进了斑马鱼尾鳍的修复，进一步证明了其生物活性潜力。

### 3.6 CNTP植入物的体内活性评估

在小鼠中建立了全厚度皮肤伤口模型，以评估植入物的愈合效果（图6）。通过完全去除表皮和真皮来制造直径约15毫米的圆形皮肤缺损。CNTP植入物作为实验组，未处理的伤口作为空白对照组。在2周的时间内监测伤口愈合情况。整个研究过程中，接受CNTP处理的伤口面积比空白组和对照组都小，到第14天时几乎完全闭合（图6A）。定量分析证实，CNTP组伤口面积显著减小，表明其愈合效率得到了提升（图6B）。

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**图6. CNTP植入物在全厚度皮肤缺损模型中的体内伤口愈合效果：**
- （A）伤口部位的代表性图像；
- （B）不同时间点（0天、7天和14天）对照组、CN组和CNTP组的伤口面积定量分析；
- （C）0天、7天和14天时伤口组织的苏木精-伊红（H&E）染色结果；
- （D）Masson三色染色结果。

使用H&E染色方法评估了水凝胶的皮肤愈合能力。第2周时，H&E染色图像显示空白组的伤口部位有大量的肉芽组织，但缺乏皮肤附属结构，而对照组则表现出更多的皮肤附属结构（图6C）。值得注意的是，CNTP组观察到了更多的类似皮肤附属结构的结构，表明组织再生和结构重塑得到增强。这种改善的愈合效果可能与柑橘皮中的生物活性化合物有关，这些化合物具有抗炎特性。然而，需要进一步的研究来确认这一机制，特别是涉及特定炎症标志物的研究。

Masson三色染色结果显示，第2周时对照组几乎没有再生胶原纤维，而CNTP组观察到更多的胶原沉积（图6D）。此外，CNTP组的真皮厚度显著增加，胶原纤维也更多。这些结果表明CNTP能够促进全厚度伤口愈合，并提供优异的真皮替代效果。

### 柑橘皮（TP）作为复合水凝胶中的关键生物活性成分

柑橘皮（TP）是该复合水凝胶的重要组成部分。TP富含黄酮类化合物、酚酸和精油，这些成分具有抗氧化、抗菌和抗炎作用。TP衍生的多酚中的大量羟基基团可以与卡拉胶分子链形成氢键，从而增加交联密度和更紧密的网络结构。这种相互作用不仅增强了水凝胶的机械强度和稳定性，还可能实现生物活性化合物的持续释放。多酚可以清除活性氧（ROS），从而减轻氧化应激，为细胞存活创造有利的环境。此外，它们可以通过抑制促炎细胞因子来调节炎症反应，这对于预防慢性炎症至关重要。此外，据报道TP还能促进成纤维细胞的增殖和细胞骨架的组织化，这对于细胞外基质的沉积和组织重塑至关重要。这些综合效应可能解释了CNTP水凝胶系统中观察到的细胞黏附性增强、细胞增殖加快以及伤口愈合加速的现象。

### 结论

本研究成功开发了一种由卡拉胶/柑橘皮（CNTP）组成的复合水凝胶植入物，作为一种潜在的全厚度皮肤修复生物材料。CNTP植入物表现出良好的物理化学性质，包括相对较高的储存模量、合适的黏度、良好的注射性能、更密集的多孔网络结构，以及稳定的膨胀行为和可降解性。生物学评估表明，CNTP植入物具有有效的抗菌活性。体外实验进一步证实了其出色的生物相容性，表现为成纤维细胞增殖和黏附性的增强。体内研究表明，CNTP植入物在斑马鱼和小鼠模型中均促进了伤口闭合和组织再生，表明其良好的生物相容性和促愈能力。总体而言，CNTP植入物是一种有前景的天然多糖基水凝胶系统，适用于皮肤组织修复。未来的研究应重点关注生物活性成分的释放机制、长期降解行为的评估及其临床应用的潜力。

### 作者声明

本手稿的撰写得到了所有作者的共同贡献。所有作者均已批准最终版本的手稿。

#### 作者贡献声明
- 王琦：撰写——初稿、方法论设计、研究构思；
- 邱建富：监督、软件使用、数据分析；
- 罗星：数据可视化与分析；
- 顾宏：资源协调、数据分析；
- 戴子茹：撰写审查与编辑、结果验证、监督、资金申请。

### 资助

本研究得到了国家自然科学基金区域科学基金项目（项目批准号：32560895）和本科生创新与创业培训计划S202511607180的支持。