CHD8基因纯合突变增强自闭症谱系障碍表型并削弱性别差异

《Molecular Psychiatry》：Homozygous CHD8 mutation intensifies ASD phenotypes and attenuates sex differences

　　

摘要 CHD8（chromodomain helicase DNA-binding protein 8）是一种染色质重塑因子，与自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）和多种神经发育障碍相关，然而，杂合子Chd8突变小鼠系通常仅表现出轻微的ASD相关表型，其作用尚不清楚。由于Chd8的完全敲除会导致胚胎致死，研究人员利用杂交（C57BL6/J × 129/Sv）遗传背景，构建了携带人类CHD8-Asn2373LysfsX2突变、能够存活的纯合子Chd8突变小鼠。与杂合子（Chd8+/N2373K）小鼠相比，纯合子（Chd8N2373K/N2373K）小鼠表现出更显著的多种表型，包括增加的ASD相关行为、脑体积增大、脑血容量/脑血流降低、脑节律异常、突触传递减弱以及ASD相关的转录组变化。值得注意的是，在纯背景上，Chd8+/N2373K小鼠主要表现为雄性行为缺陷，而在杂交背景上的纯合突变体则表现出更显著的雌性表型，提示遗传背景与突变强度的相互作用。在同一种杂交背景上，对Chd8+/N2373K和Chd8N2373K/N2373K小鼠的脑体积、脑血流、神经元放电、突触传递和转录组进行的直接比较揭示，存在一种随发育阶段和脑区变化、依赖于基因剂量的、对性别二态性表型的削弱作用。转录组分析进一步表明，与突触功能、RNA剪接和线粒体活性相关的通路在介导雄性与雌性之间的保护性和易感性差异中起作用。因此，Chd8纯合突变不仅加剧了ASD相关特征，还能削弱典型的性别特异性严重程度模式，揭示了ASD中突变强度与性别二态性之间的一种新联系。

研究背景与目的

自闭症谱系障碍是一种复杂的神经发育障碍，具有显著的性别差异，男性发病率远高于女性。CHD8基因编码一种染色质重塑因子，是ASD的高风险基因之一，在约0.2-0.4%的ASD病例中发生突变。既往研究利用杂合子Chd8突变小鼠模型模拟了ASD的某些特征，但表型往往较温和，且无法观察到更接近临床严重表型（如核心重复刻板行为）的显著变化。这主要是因为Chd8的完全敲除在纯系小鼠中会导致胚胎致死，阻碍了研究者评估更强突变对表型的影响，以及探索突变强度与ASD中普遍存在的性别差异之间关系的研究。为了克服这一限制，并检验“雌性保护效应”（Female Protective Effect, FPE）假说——即雌性需要更高的遗传负荷才会表现出ASD表型，本研究旨在通过改变遗传背景构建可存活的纯合子Chd8突变小鼠，系统比较杂合与纯合突变对ASD相关表型严重程度和性别二态性的影响。

研究方法概述

本研究发表在国际期刊《Molecular Psychiatry》上。研究人员利用一种源自患者、可导致蛋白质截短的人类CHD8基因框移突变（Asn2373LysfsX2），构建了基因敲入小鼠模型。关键的技术突破在于将小鼠的遗传背景从纯系C57BL6/J转换为杂交（C57BL6/J × 129/Sv）背景，从而成功挽救了纯合子（Chd8^{N2373K/N2373K}）小鼠的胚胎致死性，获得了可进行表型分析的存活个体。在此基础上，研究对野生型、杂合子（Chd8^+/N2373K）和纯合子（Chd8^{N2373K/N2373K}）的雄性和雌性小鼠进行了多层次、多维度的系统性分析。主要技术方法包括：1）行为学测试，评估运动、焦虑、重复行为（如理毛）和社会互动；2）磁共振成像，分析全脑及特定脑区的解剖体积；3）功能磁共振成像，结合短暂缺氧刺激，测量静息态脑血容量和脑血流；4）在体多通道电生理记录，使用Neuropixels探针在麻醉和清醒状态下监测多个脑区（皮层、海马、丘脑）的神经元放电频率和局部场电位节律；5）脑片膜片钳技术，记录海马、前额叶皮层和纹状体神经元的自发及微小兴奋性/抑制性突触后电流；6）转录组学分析，对三个发育时间点（P0, P25, P56）的全脑以及成年期三个关键脑区（海马、皮层、纹状体）进行RNA测序，并进行了差异表达基因分析和基因集富集分析。

研究结果

1. 生成可存活的纯合子Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠

在杂交遗传背景下，纯合突变小鼠的孟德尔比例恢复正常，证明遗传背景转换有效克服了胚胎致死。分子水平验证显示，纯合子小鼠脑内Chd8 mRNA水平降至野生型的40-50%，CHD8蛋白水平降至约20%，表明截短蛋白不稳定并被降解。

2. Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠的性别二态性行为缺陷

在杂交背景下，杂合子小鼠未表现出显著行为异常。而纯合子小鼠则表现出更强的ASD相关行为缺陷，且雌性表型尤为突出。具体表现为：雌性纯合子小鼠在旷场实验中活动减少、表现出焦虑样行为、在熟悉环境（Laboras笼）中理毛行为显著增加，并在直接社交互动测试中表现出异常增强的社交行为。雄性纯合子小鼠仅在Laboras理毛行为上显示出与雌性类似的显著增加。这表明纯合突变引发了更强的核心ASD样行为（如重复理毛），并削弱了先前在纯背景杂合子小鼠中观察到的雄性主导的表型模式。

3. Chd8^+/N2373K和Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠的脑体积

杂合子小鼠脑体积变化不显著。纯合子小鼠多个脑区体积显著增加，表现出更明显的巨头畸形（Macrocephaly），且存在性别差异：雄性和雌性在皮层和海马区体积均增加，但在脑干和后脑区，雄性呈增加趋势，雌性则呈降低趋势。

4. Chd8^+/N2373K和Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠的脑血容量和脑血流

杂合子雄性和雌性脑血容量变化趋势不同（雄性略降，雌性混合）。而纯合子雄性和雌性则在不同的脑区表现出相似的脑血容量和脑血流降低。这种在纯合子中两性趋于一致的降低模式，提示更强的突变削弱了脑血流方面的性别二态性。

5. Chd8^+/N2373K和Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠的神经元放电和脑节律

在麻醉状态下，杂合子和纯合子雄性小鼠在海马齿状回和丘脑的神经元放电频率均显著增加，而雌性小鼠无此变化，显示这是一种雄性特异性的电生理改变，且不受突变剂量的进一步加剧。局部场电位功率分析显示，纯合子小鼠在两性中均呈现降低趋势，与杂合子小鼠的变化趋势不同。

6. Chd8^+/N2373K和Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠的突触传递

在杂交背景下，杂合子和纯合子小鼠的海马CA1区锥体神经元的基础兴奋性和抑制性突触传递（mEPSC, mIPSC, sEPSC, sIPSC）均未发生显著改变。这与之前在纯背景上观察到的雌性特异性抑制性突触传递增强不同，提示遗传背景强烈影响突触表型的表达。

7. Chd8^+/N2373K和Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠的转录组变化

转录组分析揭示了发育阶段和脑区特异性的基因剂量效应。1）基因剂量增强表型：纯合突变导致更多差异表达基因和更强的ASD样转录组特征（即与ASD患者脑转录组变化更相似）。2）基因剂量削弱性别二态性：在P25和P56，杂合子雌性小鼠全脑转录组呈现独特的“反向-ASD”模式（即与ASD患者变化相反），这可能是一种保护性特征；而在纯合子雌性中，这种模式转变为与雄性更相似的ASD样模式。这种转变在P56的纹状体中尤为明显。这表明更强的突变剂量削弱了转录组水平的性别差异。

8. 与Chd8^+/N2373K和Chd8^{N2373K/N2373K}小鼠转录组变化相关的生物学功能

基因集富集分析发现，P25杂合子雌性小鼠特有突触相关基因上调和剪接/线粒体相关基因下调，这可能与其保护性表型相关。而在P56纯合子雌性小鼠中，这些变化（特别是剪接和线粒体相关基因集）发生了反转（变为上调）。这些相反的生物学通路变化可能与杂合子雌性的保护表型和纯合子雌性的易感表型有关。

讨论与结论

本研究通过构建可存活的纯合子Chd8突变小鼠模型，首次系统揭示了CHD8突变强度在调节ASD相关表型严重程度和性别二态性中的关键作用。主要结论如下：首先，增强的Chd8突变（纯合）能更可靠地诱导出核心ASD样行为（如重复理毛），为CHD8在ASD病因学中的角色提供了更直接的因果证据。其次，增加突变强度可减弱甚至消除在多个神经生物学层面（包括行为、脑血流、脑节律、转录组）观察到的性别二态性。具体表现为，在杂合子中显著的性别差异，在纯合子中趋于一致或出现雌性表型反超的现象。这一发现为“雌性保护效应”假说提供了来自动物模型的直接神经生物学证据：雌性可能拥有某些保护性机制（如特定的转录组特征），使其能耐受一定程度的遗传损伤；但当突变负荷超过某个阈值时，这些保护机制被压倒，导致雌性出现与雄性相当甚至更严重的表型缺陷。最后，遗传背景被发现是调节Chd8突变表型表达（特别是行为学和突触表型）的关键因素，这强调了在利用动物模型研究复杂神经精神疾病时，考虑遗传背景多样性的重要性。总之，本研究揭示了突变强度与性别二态性在ASD中的新型关联，强调了在理解ASD性别偏见和开发干预策略时，综合考虑遗传剂量、性别和遗传背景互作的重要性。