《Journal of Medical Virology》：Causative Human Papillomavirus (HPV) Genotypes of Anal Cancers in Australian Cisgender Women
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肛门癌由致癌性人乳头状瘤病毒（HPV）的持续感染引起，在普通人群中罕见。然而，某些群体如感染HIV的男男性行为者（MSM）风险更高，关于该疾病病因学和发病机制的研究主要集中在这一群体。其他高风险群体，如既往患有妇科HPV相关疾病史的女性，则被忽视。虽然单个肛门
肛门癌由致癌性人乳头状瘤病毒（HPV）的持续感染引起，在普通人群中罕见。然而，某些群体如感染HIV的男男性行为者（MSM）风险更高，关于该疾病病因学和发病机制的研究主要集中在这一群体。其他高风险群体，如既往患有妇科HPV相关疾病史的女性，则被忽视。虽然单个肛门癌病灶通常仅含一种HPV基因型，但在肛门拭子中常检测到多种基因型，使得归因变得复杂。确定致病基因型对于评估HPV疫苗接种计划的影响至关重要。本研究采用激光捕获显微切割（LCM）技术鉴定女性肛门鳞状细胞癌（ASCC）病灶特异性的HPV基因型。研究人员从肛门癌预后研究网络——基线研究（ACORN）中选取了35例女性肛门癌样本，排除5例后，剩余30例顺性别女性标本用于分析。p16免疫染色证实存在高危HPV感染；使用HPV SPF10-LiPA25试剂盒进行HPV基因分型，确定了每种癌症的致病基因型。诊断时的中位年龄为58.5岁（IQR 48–72）。所有标本均含有单一HPV基因型：93.3%为HPV16，3.3%为HPV18，3.3%为HPV31。据研究人员所知，这是首个使用LCM对女性肛门癌活检组织进行致病HPV基因型归因的研究。所有标本均检测出单一基因型，且几乎所有癌症均由HPV16引起。本样本中的所有病例均可能通过九价预防性疫苗预防，97%可通过四价疫苗预防。
论文解读：激光捕获显微切割技术揭示澳大利亚女性肛门癌的HPV致病基因型
研究背景与立项依据
肛门癌的全球发病率持续上升。尽管在普通人群中属于罕见癌症，但特定人群如男男性行为者（MSM）、HIV感染者、既往有HPV相关生殖器疾病（如外阴、阴道或宫颈癌前病变）史的女性以及实体器官移植受者面临的风险显著增高。由于HIV阳性的MSM患肛门癌的风险最高，因此该群体的病因学和发病机制研究占据了主导地位，而女性群体尤其是有妇科病史的女性则相对被忽视。最常见的组织学类型是肛门鳞状细胞癌（ASCC），其发生与致癌性HPV的持续感染密切相关。准确识别病灶内存在的HPV基因型对于评估预防和/或治疗性HPV疫苗的影响至关重要。虽然单个肛门病灶仅含一种HPV基因型，但在肛门拭子和全组织切片中常检测到多种基因型，加之邻近临床正常组织、低级别鳞状上皮内病变（LSIL）和高级别鳞状上皮内病变（HSIL）中可能存在的HPV，使得癌症本身的基因型鉴定极具挑战性。激光捕获显微切割（LCM）技术允许在显微镜直视下获取单细胞或细胞群。利用LCM结合灵敏的基因分型检测，可以确定个体病灶的HPV基因型，从而进行因果归因。此前虽有研究检测宫颈和肛门高级别病变的HPV基因型，但仅有的一项针对肛门癌标本使用LCM的研究是在男性群体中进行的，尚无关于女性病灶特异性HPV基因型的报道。鉴于此，研究人员旨在利用LCM技术表征澳大利亚新南威尔士州诊断为肛门癌的女性患者癌变病灶内存在的HPV基因型。
关键技术方法概述
研究人员从圣文森特医院悉尼分院（SVH）的肛门癌预后研究网络——基线研究（ACORN）中收集样本。通过检索SVH SydPath病理数据库，纳入2009年8月至2018年8月期间确诊的女性肛门癌病例。采用三明治切片法处理存档的组织蜡块，连续切取9张切片。其中第1张和第9张行苏木精-伊红（H&E）染色以确认诊断；第2张行p16免疫组化染色及Gills No. 2苏木精复染，经组织病理学家审核以评估p16阳性并标注待切割的病灶区域；第3张置于ARCTURUS聚乙烯萘酯（PEN）膜玻片上进行后续的LCM操作。使用Veritas 704激光捕获显微切割系统对病变细胞进行切割捕获，提取DNA后，采用PicoPure DNA提取试剂盒纯化，并通过定量PCR检测人β-珠蛋白基因以确保DNA质量。最终使用RHA kit HPV SPF10-LiPA25等试剂盒进行HPV基因分型。
研究结果
3.1 参与者特征
最初确定的35例病例中，3例（9%）因组织学复查无法确诊为肛门癌而被排除，1例因活检组织不足无法分析，另有1例为跨性别女性出于去识别化考虑被剔除，最终纳入30例顺性别女性病例进行分析。诊断时的中位年龄为58.5岁（IQR 48–72）。大多数参与者出生于澳大利亚，HIV状态未知。吸烟和饮酒数据稀疏，仅少数病例有记录。两名参与者既往有宫颈上皮内瘤变（CIN）史。由于变量数据不完整，未进行基因型关联分析。
3.2 组织学分类
22例（73%）活检样本组织学特征提示为肛内起源，8例（27%）为肛周起源。所有30份标本p16检测均呈阳性。H&E染色用于评估细胞形态，p16免疫组化染色用于识别可能由HPV相关恶性肿瘤引起的细胞周期调节紊乱区域。
3.3 LCM和β-珠蛋白扩增
研究人员利用LCM从绿色标注的SCC区域分离癌细胞。对所有样本的H&E染色切片标注的癌变区域进行LCM操作。所有样本β-珠蛋白扩增均为阳性，表明DNA完整性和样本质量良好。
3.4 HPV基因型检测
所有标本（100%）均检测到HPV DNA，且每个病灶仅发现一种HPV基因型。28例（93%）为HPV16，1例（3%）为HPV31，1例（3%）为HPV18。
讨论与结论
在对30例女性ASCC样本的研究中，100%的活检标本检测出高危HPV（HRHPV），且每份活检仅含一种HPV基因型。HPV16在93%的病例中被鉴定出来，其余为HPV18和HPV31。据研究人员所知，这是首个使用LCM对女性肛门癌活检组织进行致病HPV基因型归因的研究。所有肛门癌病例均可能通过九价预防性HPV疫苗预防，97%可通过四价疫苗预防。这些结果强调了使用准确诊断的高质量组织学材料以确保可靠HPV检测的重要性。此前旨在鉴定肛门癌标本中致病HPV基因型的研究多检测肿瘤组织的全组织切片，常报告检测到多种HPV基因型（11%-29%），而本研究及既往少数几项使用LCM的研究均发现每个组织标本仅关联一种HPV基因型，这证实了LCM通过消除周围细胞HPV型别的污染，实现了对癌变病灶内特定HPV型的精准鉴定。尽管本研究样本量有限且缺乏详细的风险因素数据，但结果一致表明，在LCM分离的癌细胞中可检测到单一的HRHPV感染，这为评估HPV疫苗对肛门癌的预防潜力提供了直接的分子流行病学证据。该研究成果已发表于《Journal of Medical Virology》。
