整合使用 Providencia stuartii 对 Malachite Green 和 Crystal Violet 生物降解过程的光谱动力学评估

《Next Materials》：Integrate spectroscopic kinetic evaluation of Malachite Green and Crystal Violet biodegradation by Providencia stuartii

　　尼哈尔·兰詹·奈亚克（Nihar Ranjan Nayak）| 根沙亚姆·贝哈拉（Ghanshyam Behara）| 洛皮塔·马哈南德（Lopita Mahanand）| 帕亚尔·霍塔（Payal Hota）| 马赫斯韦塔·尼尔（Mahesweta Nial）| 莫苏米·比西（Mousumi Bisi）| 昆图琼加亚·迪普（Mrutyunjaya Deep）| 乔蒂什·兰詹·马吉（Jyotish Ranjan Majhi）| 利普恩·萨胡（Lipun Sahoo）| 哈尔希特·希尔（Harshit Shil）
印度科尼（Koni），CG 495009，古鲁加西达斯大学（Guru Ghasidas Vishwavidyalaya，一所中央大学）植物学系

**摘要**
含染料的纺织废水的排放对环境构成了重大挑战，因为合成染料（如孔雀石绿（Malachite Green，简称MG）和结晶紫（Crystal Violet，简称CV）具有持久性和毒性。本研究旨在从受污染的纺织废水中分离并评估高效的染料降解细菌。在分离得到的八个菌株中，Providencia stuartii DDB-02表现出最高的降解效率，在72小时内实现了MG和CV的100%脱色。紫外-可见光谱（UV–Vis）分析显示MG在24小时内降解率达92%，其吸收峰在618 nm和590 nm处降低；傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析表明染料分子发生了结构变化，表明发生了生物降解。该菌株在废水处理应用中显示出巨大潜力。然而，需要进一步的研究来鉴定其代谢产物并进行大规模验证，以确认其工业适用性。

**1. 引言**
全球纺织产业的快速扩张导致合成染料不断排放到自然生态系统中，造成了持续的环境污染和严重的生态危害[1]。每年全球制造近一百万吨合成染料，其中大量未使用或处理不当的染料直接排放到水环境中，对水生生物和人类具有毒性、致癌性、致突变性和肾毒性[2][3]。由于其高溶解度、稳定性和复杂的芳香结构，合成染料对自然降解具有很高的抵抗力，从而导致长期的环境污染[4]。本研究选择这些染料是因为它们在工业上的广泛应用、环境持久性以及明确的毒理效应，使其成为评估微生物降解效率的理想模型化合物。
孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）等三苯甲烷染料在纺织和水产养殖行业中广泛使用，因其高毒性、持久性和抗降解性而臭名昭著。据报道，MG会导致肝脏毒性、DNA损伤和呼吸系统疾病，而CV则具有细胞毒性、基因毒性和生态毒性。它们的持久性和生物累积性即使在低浓度下也极具危害性，由于致突变性和致畸性特性，对水生生物和人类健康构成严重风险[5][6]。已经采用多种物理化学方法（如吸附、膜过滤、混凝-絮凝、氧化和光催化）来去除染料[7]，但这些方法存在显著局限性，包括高运营成本、无法完全降解、产生二次污泥以及能耗高。这些局限性促使科学界关注生物修复技术，作为一种环保且经济有效的工业染料降解和解毒方法[8][9]。
微生物降解已成为去除顽固染料的最有前景的方法之一，因为它具有高效性、底物选择性和可持续性。包括假单胞菌（Pseudomonas）、芽孢杆菌（Bacillus）、普罗维登西亚菌（Providencia）、克雷伯氏菌（Klebsiella）和葡萄球菌（Staphylococcus）在内的多种细菌属已在环境和废水系统中被发现，它们具有代谢多样性，并能通过特化的酶系统降解偶氮染料和三苯甲烷染料[10][11]。如偶氮还原酶（azo reductases）、蓝藻蛋白酶（laccases）、过氧化物酶（peroxidases）和NADH依赖性还原酶（NADH-dependent reductases）等酶在厌氧和有氧条件下对染料还原、芳香键断裂及后续降解起着关键作用[12][13]。最近的研究强调了微生物菌群的重要性，其协同作用显著提高了降解效率和解毒效果。环境参数（如pH值、温度、盐度、电子供体和碳源）也强烈影响降解动力学和代谢活性。
尽管在微生物染料降解方面取得了进展，但关于能够在非优化条件下同时降解多种三苯甲烷染料的细菌菌株的研究仍有限。此外，针对具有双重降解能力的环境分离菌株及其详细光谱-动力学评估的研究也很缺乏。填补这些空白对于开发高效、可扩展和可持续的生物修复技术至关重要。因此，本研究旨在从受染料污染的工业废水中分离出一种具备高效降解孔雀石绿和结晶紫能力的强效Providencia stuartii菌株。本研究重点包括：(i) 细菌菌株的分离与鉴定；(ii) 生长和脱色参数的优化；(iii) 其染料降解效率的评估。这些发现有助于开发环保的微生物生物修复策略，用于处理含染料的工业废水。据我们所知，本研究是首批报道Providencia stuartii能够同时降解孔雀石绿和结晶紫的研究之一，并通过综合的光谱和动力学分析进行了验证。

**2. 材料与方法**
**2.1. 研究地点和样品采集**
废水样品是在奥里萨邦巴瓦尼帕特纳（Bhawanipatna）北部的帕拉马南德普尔（Paramanandpur）一处排水口无菌采集的（坐标：19°55′41″N；83°10′25″E）（图1）。该采样点是一个混合废水渠道，含有未经处理或部分处理的纺织废水。采集的废水量约为40毫升，放入无菌的50毫升螺旋盖试管中并标记好，然后冷藏运输到实验室（约4°C）。所有样品均在24小时内处理以保持微生物完整性。

**2.2. 细菌的分离与培养**
细菌的分离采用早期微生物生态学研究中描述的系列稀释技术[14]。将1毫升原始废水加入9毫升无菌蒸馏水中制备初始菌液，稀释至10^-6。从10^-3稀释液取50微升涂布在无菌营养琼脂培养基（Nutrient Agar Medium，简称NAM）上，并在37°C下培养24-72小时。通过重复划线获得纯化菌株，纯化菌株保存在4°C下，并命名为DDB-01至DDB-08。

**2.3. 形态学和生化特性**
根据标准微生物染色方案进行革兰氏染色[15][16]，所有菌株均鉴定为革兰氏阴性细菌。记录了菌落的形态特征（形状、边缘、色素沉着、隆起程度和表面质地）。生化特性评估包括过氧化氢酶（catalase）、氧化酶（oxidase）活性、柠檬酸利用能力（citrate utilisation）、三糖铁琼脂（Triple Sugar Iron Agar，简称TSI）试验、吲哚试验（indole test）和MacConkey培养反应（MacConkey growth response），以及基于Bergey标准的生物膜形成试验[17][18]。

**2.4. 染料降解实验**
使用两种工业染料——孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）评估细菌菌株的脱色效率。制备这两种染料的1%储备溶液，并在营养琼脂培养基（NAM）和营养肉汤（Nutrient Broth，简称NB）中稀释至适当的工作浓度。将含有染料的培养基用于选择性和评估染料降解菌株[19][20]。将细菌培养物接种在含有染料的琼脂平板上，并在37°C下无菌培养24-72小时。脱色情况通过颜色强度的降低及菌落周围透明区的形成来监测。所有实验重复三次，结果以平均值±标准偏差表示。

**2.5. 染料脱色效率的评估**
采用平板法和液体培养法评估染料脱色效率。在含有染料的营养琼脂平板上，具有染料降解能力的细菌菌株会在菌落周围形成透明区。使用标准尺测量这些透明区的直径。在液体培养中，使用紫外-可见光谱仪（UV–Visible spectrophotometer）定量分析脱色情况。定期（24、48和72小时）取样，离心去除生物质，并测量上清液的吸光度（618 nm和590 nm）。脱色百分比计算公式为：
**脱色百分比 = (A0 - At) / A0 × 100**
其中A0是初始染料溶液的吸光度，At是时间t时的吸光度。通过分析吸光度随时间的变化来确定脱色速率。

**2.6. 傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析**
通过FTIR分析生物降解前后染料分子的结构变化。在降解实验开始时（0小时）和72小时收集样品，并以8000 rpm离心10分钟去除生物质。收集上清液并干燥以获得用于分析的残渣。将干燥后的样品与光谱级溴化钾（KBr）混合，并在高压下压制成颗粒。使用Bruker Alpha II型傅里叶变换红外光谱仪（Bruker Alpha II, Germany）在4000–4000 cm^-1范围内记录光谱，分辨率为4 cm^-1。将未处理染料和降解后的样品的光谱进行比较，以识别功能基团的变化。

**2.7. 分子鉴定**
选择最有效的染料降解菌株进行分子特性分析。提取基因组DNA并进行16S rRNA基因测序。将获得的核苷酸序列提交至NCBI GenBank进行分类学确认和编号[21]。该菌株被鉴定为Providencia stuartii。

**2.8. 仪器设备**
细菌培养在BOD培养箱（Remi Instruments Ltd., India；型号：RQ-123）中于37°C下进行。离心步骤使用高速制冷离心机（Eppendorf, Germany；型号：5810 R）按需进行。紫外-可见光谱分析使用Shimadzu UV-1800型紫外-可见光谱仪（Shimadzu, Japan；波长范围：200–800 nm）进行。傅里叶变换红外光谱分析使用Bruker Alpha II型傅里叶变换红外光谱仪（Bruker, Germany）进行，以识别降解前后的功能基团变化。所有培养基制备和灭菌过程均在高压灭菌器（Equitron, India；型号：7430）中按照标准条件（121°C、15 psi、15–20分钟）完成。分析称重使用数字分析天平（Shimadzu, Japan；型号：AUX220）。

**3. 结果与讨论**
Providencia stuartii是一种属于肠杆菌科（Enterobacteriaceae）的革兰氏阴性兼性厌氧细菌，常见于土壤和废水中。该菌的环境菌株对异生物质压力具有显著的耐受性，并具有降解复杂芳香化合物的酶系统。本研究中的DDB-02菌株表现出强烈的生物膜形成能力和氧化还原活性，这与之前关于Providencia属参与污染物解毒的报道一致。这是首批报道Providencia stuartii能够同时降解孔雀石绿和结晶紫的研究之一，进一步扩展了该属在可持续染料废水治理中的生态和生物技术重要性。

**3.1. 染料降解细菌的分离与筛选**
从奥里萨邦巴瓦尼帕特纳的帕拉马南德普尔（Paramanandpur）采集的纺织废水中成功分离出8株形态迥异的细菌菌株（编号为DDB-01至DDB-08）。所有菌株均能在1%孔雀石绿（MG）和1%结晶紫（CV）存在的情况下生长，表明其对高浓度染料具有天然耐受性（图2、图3、图4、图5、图6）。在如此高的异生物质压力条件下仍能存活的细菌菌落表明其具备适应染料污染环境的潜力，并可用于生物修复[22]。

**图2. 提供菌株DDB-02降解孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）前后的紫外-可见光谱（UV–Vis absorption spectra）。72小时后，MG在618 nm处的特征吸收峰和CV在590 nm处的吸收峰显著降低或消失，证实了色素团的断裂和真正的生物降解，而非物理吸附。**

**图3. 提供菌株DDB-02降解孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）前后的傅里叶变换红外光谱（FTIR spectra）。芳香烃基团（CC，1590–1620 cm^-1）和C-N色素团（1350–1450 cm^-1）峰的显著减弱，以及870–920 cm^-1新峰的出现，证实了染料结构的酶促分解及其转化为毒性较低的代谢物。**

**图4. 提供菌株DDB-02降解孔雀石绿（MG）和结晶紫（CV）的一级动力学曲线（Pseudo-first-order kinetics plots）。ln(C0/Ct)与时间的关系呈线性，相关系数很高（MG为R2 > 0.97，CV为R2 > 0.94），证实了一级降解动力学。MG的半衰期较短，表明降解速率更快。降解曲线显示染料浓度随时间逐渐降低，证明微生物活性有效。计算出的速率常数表明Providencia stuartii在降解两种染料方面的效率。较高的速率常数反映了其强烈的酶活性和适应染料压力的能力。半衰期的缩短进一步支持了其在工业废水处理中的潜力。****Providencia stuartii DDB-02对染料生物降解影响的物理化学参数优化：**
(a) pH值的影响，在中性至微碱性条件（pH 7–8）下降解效果最佳；
(b) 温度的影响，最佳降解温度为35–37°C；
(c) 初始染料浓度的影响，证明在300 ppm浓度下仍能高效降解。数据代表三次独立实验的平均值（n=3）。

**图6.** 基于16S rRNA基因序列显示的染料降解细菌分离株DDB-02与其密切相关的细菌株的进化关系树。该树通过邻接法结合自助法分析（1000次重复）构建。分离株DDB-02与Providencia stuartii聚集在一起，确认了其分类学归属。分支节点处显示自助值（>50%），刻度条表示每个位点的核苷酸替换次数。

**3.2. 形态学和显微镜特征**
所有分离株在革兰氏染色后均呈现粉红色，证实其革兰氏阴性特性。菌落光滑至有光泽，形状从圆形到不规则，色素沉着从黄色、乳白色到奶白色不等，反映了表型多样性（表1）。这种形态异质性来源于从混合染料废液中分离出的细菌，这些细菌通常含有能够代谢芳香族异生物物质的多种耐压物种[23]。

**表1. 细菌分离株的表型和显微镜特征**
| 细菌 | 革兰氏反应 | 细胞形态 | 菌落形状 | 大小 | 表面 | 菌落颜色 | 透明度 | 隆起度 |
|------|---------|---------|---------|------|---------|--------|---------|---------|
| DDB-01 | 阴性 | 球形 | 圆形 | 中等 | 光滑 | 黄色 | 透明 | 凸起 |
| DDB-02 | 阴性 | 杆形 | 圆形 | 小 | 有光泽 | 乳白色 | 透明 | 平坦 |
| DDB-03 | 阴性 | 球形 | 不规则 | 中等 | 有光泽 | 白色 | 透明 | 平坦 |
| DDB-04 | 阴性 | 球形 | 圆形 | 中等 | 光滑 | 奶白色 | 透明 | 凸起 |
| DDB-05 | 阴性 | 杆形 | 圆形 | 小 | 光滑 | 乳白色 | 不透明 | 凸起 |
| DDB-06 | 阴性 | 球形 | 圆形 | 小 | 光滑 | 黄色 | 透明 | 平坦 |
| DDB-07 | 阴性 | 杆形 | 圆形 | 小 | 有光泽 | 白色 | 透明 | 凸起 |
| DDB-08 | 阴性 | 球形 | 不规则 | 大 | 光滑 | 乳白色 | 不透明 | 平坦 |

**3.3. 生化特性分析**
分离的细菌菌株经过一系列生化测试以确定其代谢能力和酶谱特征。DDB-01至DDB-08的分离株的比较生化特性总结在表2中。

**表2. 分离细菌的比较生化特性**
| 细菌 | 果胶酸酶 | 过氧化物酶 | 吲哚 | 生物膜形成 |
|------|---------|---------|--------|-----------|在降解过程中，紫外-可见光（UV–Vis）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析证实了发色团的丢失以及芳香环的断裂，这表明发生了矿化作用，而不仅仅是吸附[44]。这种化学转化是降低生态毒性的关键步骤，因为发色团的分解通常与较低的致突变性和氧化应激潜力相关。为了进一步评估环境风险，使用绿豆（Vigna radiata）种子进行了植物毒性测试，这些种子暴露于未经处理的染料溶液、降解后的代谢产物以及对照组中[45]。暴露于未经处理的MG和CV的种子表现出较低的发芽率（20-35%）、根长减少以及严重的变色现象。相比之下，经过微生物处理的样品显示出与对照组相当的发芽和生长模式，表明其植物毒性显著降低。这些发现表明，P. stuartii DDB-02的生物降解不仅能去除可见颜色，还能显著降低生态风险，使处理后的废水更安全，适合排放或再利用。然而，建议进行长期毒性研究，包括鱼类胚胎毒性测试、水生无脊椎动物实验以及微生物群落影响分析，以全面验证实际应用中的环境安全性。

3.13. 限制与未来展望
尽管Providencia stuartii DDB-02在实验室条件下表现出强烈的染料降解能力，但仍需认识到一些限制，以便准确解读现有研究的结果范围和适用性。所有实验都是在受控的批次培养中进行的。此外，本研究仅包含了有限数量的细菌菌株（n=8），可能无法完全反映纺织废水中存在的多种染料降解微生物的多样性。未来的研究应关注大规模的分离和筛选，以找到更高效且多样的菌株，因为这些菌株才能更全面地模拟实际工业废水的复杂性，其中变量因素如染料负荷的变化、竞争性微生物群落和可变的物理化学条件可能会影响降解效果。该菌株尚未在试点规模或连续流式生物反应器系统中得到验证，这限制了对其在实际废水处理条件下的应用潜力和可扩展性的直接评估。此外，本研究没有进行水生毒性和生态毒性评估，例如涉及藻类、大型溞（Daphnia magna）、鱼类胚胎或微生物群落变化的实验。这些评估对于在实地应用前确认代谢产物的环境安全性至关重要。目前尚未探索促进染料降解的遗传和酶机制，特别是壬二酰还原酶（azoreductase）、漆酶（laccase）、过氧化物酶（peroxidase）及氧化还原活性途径的作用。此外，本研究也没有进行直接的酶活性测定或分子层面的验证；因此，对壬二酰还原酶、漆酶和过氧化物酶等酶的参与仅基于间接证据和现有文献提出，这限制了对降解机制的深入理解以及针对性代谢改性的可能性。虽然DDB-02在体外展示了生物膜形成能力，但其生物膜稳定性、胞外多糖（EPS）组成以及在实际废水条件下的功能适应性尚未得到研究，对其在反应器中的长期表现仍存在不确定性。未来的研究应使用固定床、填充床、流化床或膜生物反应器系统来放大该过程，以评估其连续操作和长期降解动力学。需要利用液相色谱-质谱（LC–MS/MS）、气相色谱-质谱（GC–MS）或核磁共振（NMR）光谱进行全面的代谢物分析，以确认其完全矿化并排除有害中间产物的形成。缺乏代谢物鉴定限制了对降解途径及中间产物性质的整体理解。包含多层次的生态毒性评估，如植物毒性、藻类生长抑制、鱼类胚胎毒性和无脊椎动物生物测定，将有助于增强环境风险评估和监管认可度。为了深入理解降解机制，应应用全基因组测序、转录组学、蛋白质组学和酶活性测定等先进分子工具来识别关键代谢途径和调控网络。同时，评估动态高浓度工业废水中的基于生物膜的降解过程将提高开发具备抗逆性和高效率的生物处理系统的可行性。这些努力将推动P. stuartii DDB-02在工业规模上的可持续生物修复应用。

4. 结论
本研究旨在从纺织废水中分离并鉴定高效的染料降解细菌，并评估其对孔雀石绿（Malachite Green）和结晶紫（Crystal Violet）的生物降解潜力。结果表明，Providencia stuartii菌株DDB-02在72小时内实现了两种染料的完全脱色（100%），其中孔雀石绿的降解速度更快（24小时内降解92%）。紫外-可见光分析进一步证实了染料降解，618 nm（MG）和590 nm（CV）处的吸收峰显著降低。在未优化的实验室条件下，其性能超过了其他菌株及许多先前报道的物种。该菌株的革兰氏阴性、过氧化氢酶阳性以及生物膜形成特性可能有助于其在异生物质环境中的耐受性和酶的多功能性。将DDB-02鉴定为Providencia stuartii是首次报道该物种对三苯甲烷和碱性染料都具有双重降解能力的案例。其降解潜力归因于氧化还原酶（如壬二酰还原酶、过氧化物酶和漆酶），这些酶促进了发色团的分解并使其转化为更简单的化合物。这些发现表明P. stuartii DDB-02是染料废水处理的一种有前景的生物候选菌。这种方法为传统的物理化学处理方法提供了可持续的替代方案，减少了二次污染和运营成本，为开发可持续、成本效益高且可行的染料废水处理系统提供了基础。将此类微生物纳入现有的废水管理框架中，可以显著减轻纺织工业对环境的影响。未来的研究应关注染料降解的动力学建模、物理化学参数（pH值、温度和染料浓度）的优化以及试点规模反应器的验证。通过先进的光谱和基因组分析阐明完整的酶促和遗传途径，将进一步增强其在大规模工业生物修复中的适用性。

**作者贡献声明**
Mrutyunjaya Deep：正式分析、数据管理、概念化。
Mousumi Bisi：方法学、正式分析、数据管理、概念化。
Jyotish Ranjan Majhi：方法学、数据管理、概念化。
Ghanshyam Behara：验证、监督、调查。
Lopita Mahanand：可视化、方法学、数据管理、概念化。
Payal Hota：正式分析、数据管理、概念化。
Mahesweta Nial：可视化、验证、方法学。
Lipun Sahoo：写作-审阅与编辑、写作-初稿、监督、方法学、调查、概念化。
Nayak Nihar：写作-审阅与编辑、写作-初稿、数据管理、概念化。

**伦理与生物安全声明**
本研究涉及的细菌分离自工业废水样本，未涉及人类参与者、动物或临床材料。所有实验室实验均遵循机构生物安全指南进行。

**资助**
本研究未获得公共部门、商业机构或非营利组织提供的任何特定资助。