在感觉神经元中表达的瞬时受体电位黑素原3离子通道（Transient Receptor Potential Melastatin 3 ion channel）会介导小鼠骨关节炎的疼痛

《Osteoarthritis and Cartilage》：Transient Receptor Potential Melastatin 3 ion channel expressed in sensory neurons mediates osteoarthritis pain in mice

　　罗布森·达科斯塔|苏埃伦·佩雷拉|克莱夫·金特里|法比安娜·C·迪亚斯|比安卡·德·利马·阿尔梅达|玛戈特·毛勒|劳拉·I·普里米切鲁|利奥·莫雷拉|斯蒂芬妮·曼内巴赫|佩特拉·魏斯格贝尔|斯特凡·E·菲利普|大卫·A·安德森|斯图尔特·贝文
伦敦国王学院精神病学、心理学与神经科学研究所，森塞普尔疼痛与再生中心（SpaRC），英国伦敦SE1 1UL

**摘要**
**目的**
关节炎（OA）是一种以慢性疼痛为特征的退行性关节疾病。我们研究了在感觉神经元中表达的离子通道瞬时受体电位黑色素素3（TRPM3）是否介导了OA疼痛。

**方法**
我们使用基因改造小鼠、药物工具和行为评估来研究TRPM3在单钠碘乙酸（MIA）或部分内侧半月板切除术（PMM）引起的OA疼痛中的作用。全局Trpm3敲除（Trpm3-/-）和条件性删除感觉神经元（Advillin-Cre/Trpm3fl/fl）与对照组小鼠进行了比较。选择性TRPM3拮抗剂（奥诺尼汀和异索库拉尼汀）被测试其逆转已建立的疼痛的能力。进行了组织学分析以评估软骨损伤。

**结果**
全局Trpm3的删除在MIA（平均差异[MD] = –7.8，95% CI: -13.6至-2.1）和PMM（MD = -13.6，95% CI: -22.3至-4.9）模型中均防止了疼痛行为的发展，且未抑制软骨结构损伤。感觉神经元特异性的Trpm3删除在PMM小鼠中再现了这一效应（MD = -9.0，95% CI: -15.0至-3.1），表明了神经元的贡献。此外，用奥诺尼汀（MIA: MD = –2.8，95% CI: –4.4至–1.4；PMM: MD = –1.5，95% CI: –2.2至–0.7）或异索库拉尼汀（MIA: MD = –3.0，95% CI: –4.4至–1.6；PMM: MD = –1.5，95% CI: –2.2至–0.8）药物抑制TRPM3可逆转OA小鼠中已建立的机械性痛觉过敏。

**结论**
在感觉神经元中表达的TRPM3是小鼠OA疼痛的关键介导因子。选择性TRPM3拮抗剂能有效缓解已建立的疼痛，支持该通道作为与OA相关的慢性疼痛的潜在治疗靶点。

**引言**
关节炎（OA）是一种以关节软骨退化为特征的进行性关节疾病。在晚期阶段，它涉及钙化软骨的丧失、软骨下骨的变化和骨赘的形成[1] [2]。该疾病最常见于膝关节和髋关节，但也可能发生在其他关节部位。OA的发展归因于一系列环境和遗传因素，包括与年龄相关的微创伤积累、肥胖和关节创伤[2] [3]。
疼痛是OA的主要症状，通常局限于受影响的关节，但有时会由于中枢敏化而扩展到相邻组织，这被称为牵涉痛。管理OA疼痛具有挑战性，因为现有的药物干预对许多患者无效，并且常常伴有不良副作用[4]。OA疼痛会损害患者的生活质量，因此其有效且安全的缓解是一个未满足的医疗需求。尽管OA疼痛的病理机制尚不完全清楚，但有证据表明OA疼痛是由周围和中枢感觉神经元的敏化和激活引起的[5] [6]。关节组织被感觉神经密集支配，受影响关节产生的介质可以作用于并敏化感觉神经元[7] [8] [9] [10] [11]。瞬时受体电位（TRP）蛋白是一类能渗透阳离子的离子通道超家族，在全身具有重要的生理作用，作为分子传感器。几种TRP通道如TRPV1、TRPA1和TRPM8在感觉神经元中表达，并参与感觉转导和病理性疼痛信号传导[12]。TRPM3黑色素素3（TRPM3）在三叉神经（TG）和背根（DRG）神经节的感觉神经元中表达，在痛觉感知中起重要作用[13]。TRPM3可被孕酮硫酸盐（PS）激活[14]，这是一种内源性神经类固醇，已被用作研究不同细胞类型中该通道活性和表达的药物工具[13] [15] [16]。对分离的小鼠TG和DRG神经元的功能研究表明，PS处理可引起58%的DRG神经元和57%的TG神经元内的[Ca2+]i浓度增加。高比例的TRPM3表达神经元也表达TRPV1，将这些神经元归类为痛觉感受器[13]。
过去十年中的多项研究表明，TRPM3是潜在的疼痛缓解药物靶点。在体内激活TRPM3会在小鼠中诱发疼痛行为，而Trpm3缺陷小鼠（Trpm3-/-）对有害热刺激的行为反应减弱且不会发展出炎症性热痛觉过敏[13] [15] [16]。此外，我们发现选择性TRPM3拮抗剂奥诺尼汀能够逆转炎症小鼠模型中的已建立的热痛觉过敏[15]。与这些发现一致，多项研究表明TRPM3在各种临床前模型中发挥作用，从而强化了其作为疼痛缓解药物靶点的潜力[17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25]。因此，我们结合遗传和药物方法以及行为评估，在两种OA小鼠模型（单钠碘乙酸（MIA）注射和部分内侧半月板切除术（PMM）中研究了TRPM3对OA疼痛的贡献。

**方法**
**动物**
使用了8-12周大的成年野生型（WT）C57BL/6J（N=78）、WT C57BL/6N（N=67）和TRPM3缺陷（Trpm3?/?，C57BL/6N背景，N=68）小鼠。WT C57BL/6J和C57BL/6N小鼠分别来自CEMIB（巴西）和Charles River Laboratories（德国）。Trpm3?/?小鼠是通过靶向删除编码通道孔形成区域的外显子24生成的[15]。为了评估TRPM3在感觉神经元中的作用，通过将携带loxP侧翼TRpm3外显子24（孔区域）[26]的 mice 与 Advillin-Cre 转基因小鼠[27] 进行杂交来生成条件性敲除小鼠。这种策略产生了 AvilCre/?/Trpm3fl/fl 后代，繁殖对由 AvilCre?/?/Trpm3fl/fl 雄性和 Avil?/?/Trpm3fl/fl 雌性组成，以确保父系 Cre 的传递。由于 Advillin 启动子下的 Cre 重组酶表达对基线感觉行为没有影响[27] [28] [29]，因此 Avil?/?/Trpm3fl/fl 孪儿被用作对照组。基因型通过使用补充表S1中列出的引物对耳组织进行PCR确认。
所有程序均获得了伦敦国王学院（英国内政部许可证PF0C9D185）和里约热内卢联邦大学（协议A54/24-A24-24-014-21）的伦理审查委员会的批准，符合英国和巴西的法律。样本大小是根据伦理审查要求估算的，并得到了委员会的批准。动物实验遵循ARRIVE 2.0指南[30]（详见补充方法部分）。

**关节炎诱导**
OA通过化学方法（即通过关节内注射单钠碘乙酸（MIA）或手术方法（即部分内侧半月板切除术（PMM））在小鼠中诱导。所有程序均在3%异氟醚和100%氧气的麻醉下进行。对于MIA诱导的OA，通过左膝的髌韧带注射0.5 mg的MIA溶于10 μl的0.9%无菌盐水中[31]（图S1）。对于PMM，进行内侧髌旁切口和关节切开术，将内侧半月板从胫骨附着处分离并切除大约50%[32]（图S2）。

**行为评估**
使用机械性痛觉过敏、机械性痛觉过敏和寒冷敏感性测试来评估与疼痛相关的行为。机械性痛觉过敏使用von Frey方法[33]和校准的丝状物（0.02–2 g；从0.6 g开始）进行评估，并确定50%的爪子撤回阈值（PWT，g）[34] [35]。机械性痛觉过敏使用Ugo-Basile（意大利米兰）的镇痛仪和圆顶探头在背侧爪子上进行评估；PWTs（g）记录的截止值为150 g[32]。寒冷敏感性在10 °C的冷板上进行评估；同侧爪子撤回延迟（PWL，s）的记录截止值为30 s[36]。所有评估都在OA诱导后及指定的时间间隔内进行。

**关节组织学**
行为测试后，小鼠被安乐死并收集同侧和对侧膝盖（每组9-10个）。关节固定在4%的甲醛中，用Osteosoft?（Merck KGaA，德国）脱钙48小时，然后用磷酸盐缓冲液（0.1 M，pH 7.4）冲洗，并进行石蜡包埋。冠状切片（12 μm）用Safranin O/Fast Green染色并在DPX（VWR）中覆盖。使用数码相机获取明场图像。切片在评分前进行编码，并由三名不知道基因型和组的观察者独立评分。每个关节分析五个切片，每个象限（股骨髁的内侧/外侧、胫骨平台的内侧/外侧）的软骨损伤等级为0–6（0 = 正常）[37]。分数以每个关节的总分和最大分为报告；最终值为观察者的平均值。

**药理学研究**
进行药理学研究以评估TRPM3激活是否足以诱发关节痛觉以及其抑制是否可以逆转OA相关的痛觉过敏（图S3）。通过例如（10 μl）将激动剂PS [14]（0.2–1 mM）或CIM0216 [38]（50–200 μM）注射到天真小鼠的膝关节中来测试充分性。使用选择性TRPM3拮抗剂奥诺尼汀[39]和异索库拉尼汀[40]在MIA注射和PMM诱导后4周和14周进行抑制测试。奥诺尼汀通过腹腔给药（10 mg/kg [15]）或关节内给药（300 μM，10 μl），异索库拉尼汀通过腹腔给药（2 mg/kg [22]）或关节内给药（100 μM，10 μl）。关节内拮抗剂的浓度基于已发表的文献[39] [40]和初步数据（数据未显示）。化合物按照补充表S2中的描述溶解在载体中；所有溶液都在PBS中制备。在测试当天进行基线行为评估，动物接受载体或药物处理，并在处理后0.5小时至24小时评估机械性痛觉过敏（von Frey）。

**统计分析**
结果以六个到十个动物的平均值±标准差表示。使用参数线性模型（单因素和双因素方差分析，包括适当的重复测量方差分析）进行统计分析，然后进行Dunnett’s、Tukey’s或?ídák’s多重比较检验。通过检查残差图来评估模型的假设。分析使用GraphPad Prism软件（版本8.0.1）进行，P值< 0.05被认为具有统计学意义。详细信息见补充方法部分和补充表S3。

**结果**
**Trpm3-/-小鼠在MIA注射后不出现OA疼痛行为**
为了评估TRPM3在膝OA疼痛中的作用，雌性Trpm3?/?和WT小鼠接受了MIA注射。注射载体的WT（N=6♀）或Trpm3-/-（N=6♀）小鼠没有表现出疼痛行为，而注射MIA的WT小鼠（N=6♀）表现出明显的痛觉过敏（图1a–f）。WT注射MIA的小鼠还表现出明显的负重改变（图S4）。这些反应在Trpm3?/?小鼠中显著减少（N=6♀；图1a–f；图S4）。AUC分析确认Trpm3?/?小鼠在von Frey测试（图1b；平均差异[MD] = –7.8，95% CI: -13.6至-2.1）和爪子压力测试（图1d；MD = –758，95% CI: -1180至-337.1）中的撤回阈值较高，寒冷敏感性较低（图1f；MD = –112.1，95% CI: -253.5至-29.3）。同样，雄性Trpm3-/-小鼠也没有出现疼痛行为（图S5）。总体而言，这些结果表明TRPM3删除减弱了雌性和雄性小鼠中MIA诱导的疼痛样行为。

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**图1.** Trpm3-/-小鼠在关节内注射单钠碘乙酸后不出现OA疼痛相关行为。雌性Trpm3?/?和野生型（WT）小鼠通过不同的痛觉测试评估OA相关的疼痛行为。
(a) 机械性爪子撤回阈值（von Frey测试）。
(b) 图(a)的曲线下面积（AUC）。
(c) 机械性爪子撤回阈值（爪子压力测试）。
(d) 图(c)的AUC。
(e) 冷爪子撤回延迟（冷板测试）。
(f) 图(e)的AUC。
测量在 saline（对照）或单钠碘乙酸（MIA）注射前和之后定期进行。每个组代表六只动物的平均值，误差条表示SEM。
(a, c, e) 以时间为重复因素、组（基因型/处理）为组间因素的双因素重复测量方差分析，然后进行Dunnett的多重比较测试，比较同一组内的每个时间点与基线（第0天）。*P < 0.05 vs. 基线。
(b, d, f) 以基因型（WT vs Trpm3?/?）和处理（载体 vs MIA）为固定因素的双因素方差分析，然后进行Tukey的多重比较测试。*P < 0.05 vs. 注射载体的WT小鼠；#P < 0.05 vs. 注射MIA的WT小鼠。y轴不从零开始，以便在测量的生理范围内更好地可视化。

**Trpm3-/-小鼠在PMM后不出现OA疼痛行为**
为了测试TRPM3是否在膝OA的转化模型中参与疼痛，雌性（图2）和雄性（图3）Trpm3?/?和WT小鼠接受了PMM。假手术的WT（N=6♀；N=7♂）或Trpm3?/?（N=6♀；N=6♂）动物没有表现出感觉改变（图2a–f；3a–f）。在WT小鼠中，PMM诱导了强烈的疼痛行为（N=6♀；N=6♂），而Trpm3?/?小鼠（N=6♀；N=6♂）未能表现出过敏反应（图2a–f；3a–f）。AUC分析证实Trpm3?/?小鼠中不存在类似疼痛的行为。在雌性小鼠中，PMM后的von Frey阈值高于WT小鼠（图2b；MD = -13.6，95% CI: -22.3至-4.9），爪压测试（图2d；MD = -1073，95% CI: -1369至-776.7）和冷敏感性测试（图2f；MD = -150.1，95% CI: -199.8至-100.5）也显示了类似的模式。雄性小鼠中也观察到了类似的趋势，PMM后的von Frey阈值和爪压阈值更高（图3b；MD = -11.8，95% CI: -22.5至-1.1），并且Trpm3?/? PMM小鼠的冷过敏反应减弱（图3f；MD = -71.4，95% CI: -128.6至-14.2）。总之，这些发现表明TRPM3的缺失可以防止PMM模型中两种性别的OA疼痛行为的发展。每个组代表8-10只动物的平均值，误差条表示标准误（SEM）。(a, c, e, g, i, k) 采用双向重复测量方差分析（ANOVA），时间作为重复因素，处理作为组间因素，随后进行Tukey多重比较测试。*P < 0.05 vs. 时间0；#P < 0.05 vs. 相应时间点的空白处理组。(b, d, f, h, j, l) 采用普通单因素方差分析，处理作为固定因素，随后进行Dunnett多重比较测试，比较每种处理与空白处理的差异。#P < 0.05 vs. 空白处理。为了确定这些效应是否反映了关节内的局部作用，化合物被直接注射到关节内。在MIA模型（图6e, f；ononetin：MD = –2.0，95% CI: –3.6至–0.5，N=8♀；isosakuranetin：MD = –2.3，95% CI: –3.8至–0.8，N=8♀）和PMM模型（图6g, h；ononetin：MD = –1.9，95% CI: –3.0至–0.8，N=10♀；isosakuranetin：MD = –1.7，95% CI: –2.9至–0.6，N=10♀）中，注射到同侧膝关节显著提高了疼痛阈值。相比之下，对侧关节的注射没有效果（图6i - l）。这些结果共同表明，TRPM3的激活足以引起关节疼痛行为，其药理学抑制能够通过受影响关节内的局部机制产生强大但短暂的疼痛行为逆转。

讨论
骨关节炎（OA）是一种高度普遍且致残的疾病，其特征是进行性关节退化和持续性疼痛，目前的治疗方法对其控制效果不佳，这突显了对新治疗策略的迫切需求 [1]，[4]，[41]。在这里，我们确定了离子通道TRPM3是OA疼痛行为的关键驱动因素。通过使用互补的基因缺失和药理学阻断方法，我们发现TRPM3在两种不同的OA小鼠模型中促进了疼痛样行为的发展和持续存在，而不会改变潜在的软骨损伤。这种痛觉与软骨损伤的分离表明TRPM3主要调节感觉信号传导而非疾病进展。因此，用拮抗剂靶向TRPM3可能会提供症状缓解，而不会改变软骨结构。值得注意的是，在感觉神经元中选择性删除Trpm3可以消除与OA相关的疼痛行为，这牢固地将外周TRPM3信号传导定位为关节疼痛的关键决定因素，是止痛干预的有希望的目标。此外，全局或神经元TRPM3的删除并未影响基线的机械或冷敏感性，这强调了其在OA中的病理特异性和治疗潜力。
先前的研究将TRPM3与热、炎症和神经病理性疼痛模型联系起来 [13]，[15]，[17]，[18]，[22]，[25]。我们扩展了这些发现，证明TRPM3也驱动与关节退化相关的深层组织疼痛。在炎症模型中，TRPM3敲除的小鼠在CFA诱导的足部炎症 [13]，[15] 或卡拉胶注射 [22] 后不会发展出热敏感性。机制上，如白细胞介素-1β (IL-1β) 和肿瘤坏死因子-α (TNFα) 等炎症介质在感觉神经元中增强了TRPM3的活性 [17]，并且炎症上调了TRPM3 mRNA 并增强了支配炎症组织的感觉神经元的功能反应 [25]。虽然这些研究主要将TRPM3与热敏感性联系起来，但我们在OA中的数据揭示了其更广泛的作用：TRPM3的缺失预防了机械性痛觉过敏、机械性痛觉超敏和冷敏感性。在两种OA模型中，这种效应在雌性和雄性中都明显存在，且没有性别差异，表明TRPM3对OA疼痛行为的贡献与性别无关。这与偏头痛不同，在偏头痛中TRPM3的激活在女性中引发更强的痛觉放电 [20]，表明TRPM3的调节作用具有性别依赖性。
TRPM3还与神经病理性疼痛有关，在神经病理性疼痛中，基因删除可以防止神经损伤和化疗引起的神经病变。值得注意的是，遭受慢性压迫损伤 (CCI) 的TRPM3敲除小鼠表现出正常的机械和冷敏感性发展，但热敏感性显著降低，表明在神经病理性状态下TRPM3的作用具有特异性 [22]。在奥沙利铂引起的神经病变中，TRPM3缺失被报道可以减少冷敏感性和机械敏感性的发展 [18]。与这些行为发现一致，TRPM3缺失还影响了CCI手术或奥沙利铂治疗后的DRG中的促痛觉信号转导，表明改变初级传入神经的信号传导可能有助于观察到的疼痛表型 [18]，[22]。这些发现表明，TRPM3在特定背景下对不同的慢性疼痛类型都有贡献。
TRPM3在体内的许多细胞和组织中都有表达 [42]，包括滑膜细胞 [43]。因此，功能性的TRPM3消除可能会影响与OA相关的结构变化的发展。我们的组织学分析重点关注软骨结构损伤而非滑膜病理变化，结果显示TRPM3的缺失并未改变MIA或PMM诱导的OA中的软骨退化，尽管它抑制了OA疼痛样行为。由于这些分析在疾病相对晚期进行，此时这些模型中的滑膜炎症变化通常已经减少 [2]，因此没有进行专门的滑膜病理定量评估。这种疼痛与软骨退化之间的分离反映了OA的临床观察结果，即疼痛严重程度往往与放射学或组织学关节损伤的程度无关，这表明外周痛觉信号传导可以独立于疾病进展进行调节 [44]，[45]，[46]。其他表达痛觉受体的离子通道也表现出类似的模式；例如，系统性的TRPV1药理学抑制可以减少小鼠的OA疼痛行为而不改变关节结构 [47]，钠通道Nav1.7也显示出疼痛与关节病理之间的类似分离 [48]。从机制上看，这些发现支持TRPM3主要作用于OA的感觉成分，而不是直接影响驱动软骨分解的代谢过程。TRPM3在外周感觉神经元和中枢神经系统中广泛表达，因此全局Trpm3的缺失可能涉及超出感觉传入神经以外的部位。这促使我们研究这些效应是否特异性地由感觉神经元中的TRPM3介导。
使用缺乏DRG神经元中Trpm3表达的条件性敲除小鼠，我们发现感觉神经元特异性缺失完全预防了PMM模型中OA疼痛样行为的发展，尽管这些小鼠在OA诱导前表现出正常的感官阈值。钙成像确认了对TRPM3激动剂PS的几乎完全丧失反应，qPCR显示DRG中的Trpm3 mRNA显著减少，验证了删除的效率。这些结果表明，外周感觉神经元中的TRPM3对于驱动OA疼痛行为是必要的。与我们的发现一致，化学遗传学抑制NaV1.8?神经元 [49] 以及感觉神经元特异性删除NaV1.7 [48] 在OA模型中也实现了强烈的镇痛效果。因此，神经元TRPM3的特异性需求使其成为OA镇痛的一个特别有吸引力和选择性的目标，具有与疾病修饰疗法结合的潜力 [50]。
在确定感觉神经元中的TRPM3对OA疼痛行为是必需的之后，我们接下来研究了药理学抑制是否能在疼痛已经建立后提供治疗益处。全身性和局部给予选择性的TRPM3拮抗剂ononetin和isosakuranetin在MIA和PMM诱导的OA中产生了强烈但短暂且可逆的镇痛效果。快速的缓解开始和短暂的持续时间与外周感觉神经元的急性抑制一致，而不是炎症或软骨损伤的改变。值得注意的是，仅给予受影响关节（而不是对侧关节）就能逆转敏感性，这突出了其局部、外周的作用部位。这些结果与先前的研究一致，表明TRPM3阻断可以减弱炎症和神经病理性疼痛模型中的疼痛样行为 [15]，[18]，[22]。此外，与某些TRPV1抑制剂不同，TRPM3拮抗剂至今尚未被报道会引起高热或其他系统不良反应 [40]，这可能代表了额外的转化优势。最后，与这些发现一致，直接激活TRPM3在天真关节中使用激动剂PS或CIM0216足以引起强烈的机械性痛觉过敏，表明TRPM3激活本身就可以驱动关节痛觉。从转化角度来看，强局部效力和外周选择性的结合使TRPM3拮抗剂——特别是在缓释局部制剂中——成为有前途的OA疼痛治疗候选药物，同时最小化全身暴露。

总之，来自遗传学（全局和感觉神经元特异性TRPM3缺失）和药理学（TRPM3拮抗剂）方法在OA模型中的一致证据强调了针对TRPM3在OA疼痛中的转化意义。值得注意的是，局部TRPM3拮抗剂所实现的强大且局部的镇痛效果突显了一个有前景的治疗途径：局部选择性阻断TRPM3以缓解关节疼痛，而不会产生全身副作用。我们的研究还有进一步探索的空间，因为我们没有检查TRPM3是否影响外周疼痛途径中的痛觉受体兴奋性或其他分子变化。虽然已有报道TRPM3在关节支配的感觉传入神经元中表达 [17]，但本研究并未直接检查它们在膝关节组织中的解剖分布。未来的研究应解决这些细胞机制，并开发TRPM3拮抗剂的缓释制剂以延长疼痛缓解效果。最终，TRPM3成为OA中有价值的症状目标，其局部抑制可以与疾病修饰药物结合使用，以实现有效的镇痛和关节保护。
这项工作得到了Arthritis UK（21543）、Medical Research Council UK（MR/L010747/1）对SB、DAA的资助；CAPES – 巴西（财务代码001；对R.d.C.和F.C.D.的奖学金）；German Research Foundation（CRC 530）和Saarland University（HOMFOR）对S.E.P.的资助；FAPERJ – 巴西（E-26/211.469/2021和E-26/201.319/2022）、CNPq/INCT - 巴西（465430/2014-7）以及Royal Society UK Newton International Fellowship（NF170371）对R.d.C.的资助。

作者贡献声明
RC：概念化和设计、研究、数据分析、监督、资金获取、原始草稿撰写。
SP、CG、FCD、BLA、MM、LIP、LM、SM和PW：研究、数据分析。
SEP、DAA和SB：概念化和设计、监督、资金获取、文章修订。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。