利拉鲁肽在三维炎症性骨关节炎球状模型及人类软骨细胞支架模型中的抗炎与促骨合成作用

《Osteoarthritis and Cartilage》：Anti-Inflammatory and Anabolic Effects of Liraglutide on 3D Inflammatory Osteoarthritic Spheroid and Scaffold Models of Human Chondrocytes

　　艾达·西夫特奇（Eda Ciftci）| 索菲·C·埃伯莱因（Sophie C. Eberlein）| 西比尔·格拉德（Sibylle Grad）| 马乌罗·阿利尼（Mauro Alini）| 弗朗西斯·贝伦鲍姆（Francis Berenbaum）| 姜志（Zhen Li）
达沃斯研究所，瑞士达沃斯广场7270号

**摘要**
**目的**
骨关节炎（OA）是一种与年龄相关的常见关节疾病，其特征是低度炎症和进行性软骨退化。利拉鲁肽（Liraglutide）是一种胰高血糖素样肽-1受体激动剂，已被批准用于治疗糖尿病和肥胖症，在临床前OA模型中表现出抗炎和软骨保护作用，但在人类3D软骨细胞系统中的效果尚不明确。

**方法**
将人类关节软骨细胞培养成3D球形团块或接种到多孔聚氨酯支架中。使用白细胞介素-1β（IL-1β，1 ng/mL）诱导类似OA的炎症，随后进行利拉鲁肽处理。支架结构在生理循环机械负载条件下培养（每天1小时，持续7天）。通过生化、分子和组织学分析来评估炎症介质、合成基因表达和细胞外基质特征。

**结果**
在球形团块培养中，与IL-1β处理的对照组相比，利拉鲁肽在14天时降低了IL-8水平（0.5 μM浓度下为877.8 ± 155.3 ng，而对照组为3127.0 ± 1140.5 ng），IL-6的降低幅度较小（0.5 μM浓度下为863.6 ± 63.1 ng，对照组为1055.0 ± 74.4 ng）。利拉鲁肽在较低浓度下增加了ACAN的表达（0.5 μM浓度下为1.297 ± 0.820倍，对照组为0.260 ± 0.323倍），而在较高浓度下（14天时）PRG4的表达更高（0.713 ± 0.07倍，对照组为0.338 ± 0.11倍）。在机械负载下的支架培养中，利拉鲁肽减少了早期阶段的IL-8蛋白释放（0.5 μM浓度下为3.782 ± 1.505倍，对照组为10.44 ± 6.524倍），并调节了ACAN的表达（0.5 μM浓度下为1.09 ± 0.84倍，对照组为0.45 ± 0.13倍）。组织学分析表明，在利拉鲁肽处理条件下，蛋白多糖和II型胶原丰富的基质得以保留。

**结论**
生理机械负载对于建立基于支架的人类OA模型至关重要。利拉鲁肽以依赖特定环境和供体的方式调节人类3D软骨细胞系统中的炎症和基质相关反应，这支持其在进行OA治疗转化研究中的相关性。

**引言**
骨关节炎（OA）是最常见的与年龄相关的慢性关节疾病之一，显著降低了老年人的生活质量，并给全球经济带来了日益严重的负担。它影响了近三分之一的65岁以上人群，女性患病率更高。OA的特征是关节软骨的进行性退化、滑膜炎症和软骨下骨重塑，慢性低度炎症被认为是疾病发生和进展的核心驱动因素。目前非手术治疗主要提供症状缓解，无法阻止或逆转结构病变。
胰高血糖素样肽-1（GLP-1）是一种参与葡萄糖代谢和调节炎症通路的激素。除了其代谢作用外，基于GLP-1的疗法还对多个组织具有保护作用，包括肝脏、大脑、肾脏、肺部、血管和骨骼，主要是通过抑制炎症细胞因子的产生和免疫细胞浸润实现的。GLP-1受体（GLP-1R）在胰腺和胰腺外组织中表达，包括软骨、滑膜和骨骼，表明其对关节稳态有潜在作用。因此，像利拉鲁肽和semaglutide这样的GLP-1受体激动剂（GLP-1RAs）被广泛用于2型糖尿病和肥胖症的治疗，并与心血管、血管、脂质、骨骼和软骨相关的影响相关。
临床研究表明，GLP-1RAs可减轻膝关节炎疼痛并改善关节功能，部分益处归因于体重减轻。在上海队列研究中，接受GLP-1RA治疗的膝关节炎糖尿病患者表现出较少的软骨退化和对手术干预的需求。虽然这些研究侧重于全身给药，但关节内给药可能通过靶向多个关节组织中的GLP-1R产生直接针对关节的效果。支持这一概念的是，在小鼠OA模型中，关节内利拉鲁肽减少了炎症、软骨退化和疼痛。然而，GLP-1RAs对三维OA相关系统中的人类软骨细胞的直接影响仍不够清楚。鉴于机械刺激对软骨稳态至关重要，本研究在生理相关条件下，研究了利拉鲁肽在人类3D体外OA模型中的效果，包括软骨细胞球形团块和机械负载支架培养，重点关注炎症和基质相关反应。

**材料与方法**
**试剂和利拉鲁肽制备**
除非另有说明，试剂均从Sigma购买。DMEM-LG购自Gibco（#31600-083）。重组人IL-1β购自Peprotech（#200-01B）。利拉鲁肽（Victoza?，诺和诺德公司；#EMEA/H/C/001026）以6 mg/mL的浓度储存，用0.9% NaCl稀释后加入培养基中。

**人类软骨细胞的分离**
人类关节软骨来自在达沃斯医院和伯尔尼Inselspital接受髋关节或膝关节置换手术的患者，根据瑞士人类研究法无需伦理批准（因数据匿名）。供体信息见表1。软骨在37°C下使用胶原酶II（450 U/mL）消化22小时。细胞在添加了10%青霉素/链霉素（FBS）、1%青霉素/链霉素（P/S）、1%非必需氨基酸（NEAA）、1 ng/mL重组转化生长因子β1（TGF-β1）和5 ng/mL成纤维细胞生长因子2（FGF-2）的DMEM-LG中扩增。所有实验均使用约80%汇合度的第1代软骨细胞。

**表1. 包含的患者的 demographics 特征。**
| 供体编号 | 性别 | 年龄 | 来自部位 | 用于研究类型 |
|--------|------|------|------|-------|
| 1 | 女性 | 78 | 股骨头 | 支架研究 |
| 2 | 男性 | 64 | 膝关节 | 支架研究 |
| 3 | 男性 | 72 | 膝关节 | 支架研究 |
| 4 | 男性 | 80 | 股骨头 | 支架研究 |
| 5 | 女性 | 61 | 股骨头 | 团块研究 |
| 6 | 男性 | 68 | 股骨头 | 团块研究 |
| 7 | 男性 | 72 | 股骨头 | 团块研究 |

**实验设计**
**团块培养研究（图1）**：将第1代软骨细胞（0.25 × 10?细胞/团块）接种到V型底孔96孔板中，使用软骨生成培养基（DMEM-LG，1% P/S，1% ITS+ Premix，1% NEAA，50 μg/mL抗坏血酸（AA），10 ng/mL TGF-β1，0.1 μM地塞米松），然后离心形成团块。经过7天的软骨形成后，在四种条件下培养：对照组、IL-1β（1 ng/mL）、IL-1β + 利拉鲁肽（0.5 μM）或IL-1β + 利拉鲁肽（10 μM）。利拉鲁肽浓度基于先前的马软骨细胞研究选择，这些研究显示其具有抗炎作用且无细胞毒性。培养基每2-3天更换一次，持续至第14天。在0天、1天和14天收集团块进行后续分析。使用Cell Titer-Blue assay（补充方法SM1）在2D软骨细胞培养中评估细胞毒性，结果表明利拉鲁肽浓度高达10 μM时不影响细胞活力（补充结果SR1，补充图SF1）。

**支架研究（图1）**：将第1代细胞（5 × 10?）封装到多孔聚氨酯（PU）支架（8 mm × 4 mm）中，使用由17 mg/mL纤维蛋白原和0.5 U/mL凝血酶组成的纤维蛋白凝胶基质。支架的制造和聚合物组成如前所述。支架在软骨生成培养基中培养7天，然后在六种条件下在软骨促进培养基中培养7天：对照组、仅加载、加载 + IL-1β、加载 + IL-1β + 利拉鲁肽（0.01 μM）或加载 + IL-1β + 利拉鲁肽（0.1 μM）。选择较低的利拉鲁肽剂量以接近临床相关浓度[ClinicalTrials.gov: NCT05419856]。应用联合动态压缩（10–20%应变，1 Hz）和振荡剪切（±25°，1 Hz）进行生理机械负载[24]。在0天和7天收集支架。

**细胞因子释放定量**
使用ELISA（R&D Systems）根据制造商说明测量条件培养基中的IL-6和IL-8浓度。

**基因表达分析**
组织匀浆后使用TRI Reagent分离总RNA。通过1-溴-3-氯丙烷进行相分离，然后用异丙醇和高盐溶液沉淀RNA。使用Superscript Vilo cDNA Synthesis Kit（Thermo Fisher）从0.4 μg RNA合成cDNA，并在QuantStudio? 7 Real-Time PCR系统（Applied Biosystems）上进行RT-qPCR。使用2?ΔΔCT方法计算基因表达。引物和探针序列列于表2。

**表2. RT-qPCR中使用的寡核苷酸引物和探针的序列和来源。**

**表2. RT-qPCR中使用的寡核苷酸引物和探针的序列和来源。**
| 基因 | 引物 | 探针 |
|------------|------------------|------------|
| Aggrecan (ACAN) | Forward Primer (5’→3’) | TGG GCA AGA ACA CCA TGA TG |
| | Reverse Primer (5’→3’) | CGG ATA TGA GGC AGC AGT TTC |
| | Probe (5’FAM/3’TAMRA) | AGG GCA CCT GGA AAA CAA CCC AGC |
| | | | |
| Proteoglycan 4 (PRG4) | Forward Primer (5’→3’) | ACG CTG AAC GAT ACC AAA TG |
| | Reverse Primer (5’→3’) | TGC TAT ACC TTT ACT CTT TAT GT |
| | Probe (5’FAM/3’TAMRA) | CCG GAA TGG AAA CGT GAA TCA GAA |
| | | | |
| Interleukin 6 (IL-6) | N/A | |
| | Hs00174131_m1 | |
| Interleukin 8 (IL-8) | N/A | |

**DNA含量测定和细胞数量定量**
使用Hoechst 33258测定法（补充方法SM2）估算团块和支架中的DNA含量。

**组织学和免疫组化**
将团块和支架固定、石蜡包埋、切片，并用Toluidine Blue染色。还进行了aggrecan、II型胶原和caspase-3的免疫组化。细胞核用hematoxylin复染。染色详细方案见补充方法SM3。使用ImageJ软件进行半定量分析。对于团块切片，通过测量Toluidine Blue、aggrecan和caspase-3染色区域与总团块面积的比率来计算阳性染色区域的百分比。在支架切片中，量化Toluidine Blue、aggrecan、II型胶原和caspase-3的染色强度，并以任意单位（a.u.）显示。

**统计分析**
使用GraphPad Prism 10进行统计分析。使用Shapiro–Wilk检验检测数据的正态性，对于正态分布的数据使用单因素ANOVA，对于非正态分布的数据使用Kruskal–Wallis检验。结果以平均值和95%置信区间（CI）表示。

**结果**
**利拉鲁肽对人类软骨细胞团块OA模型的影响**
IL-1β刺激导致团块中IL-6和IL-8的分泌显著高于对照组。对于IL-6（图2A），IL-1β处理的团块在时间推移中表现出细胞因子分泌的逐渐增加，平均水平分别为第1天235.4±67.0 ng，第7天778.9±61.5 ng，第14天1055.0±74.4 ng，而对照组在所有时间点的IL-6水平均较低（分别为0±0 ng，8.4±8.1 ng，25.3±28.4 ng）。利拉鲁肽对IL-6的降低作用温和且不稳定。在0.5 μM浓度下，第1天IL-6水平为158.4±49.9 ng，在10 μM浓度下为181.8±73.4 ng。在第7天，0.5 μM利拉鲁肽的作用更为明显（636.9±71.9 ng），而在10 μM浓度下的效果不太明显（727.4±34.7 ng）。在第14天，利拉鲁肽处理的团块中IL-6分泌量相对于IL-1β组在两种浓度下均降低（0.5 μM浓度下为863.6±63.1 ng；10 μM浓度下为932.4±59.6 ng）。IL-1β刺激导致IL-8的释放增加（图2B），与对照组相比，平均IL-8水平分别为第1天374.4±63.1 ng，第7天2026.0±861.0 ng，第14天3127.0±1140.5 ng，而对照组水平始终较低（分别为0±0 ng，7.1±8.7 ng，23.3±13.9 ng）。利拉鲁肽处理在两种浓度下都降低了IL-8的分泌。从第1天开始就观察到降低作用（0.5 μM浓度下为176.1±47.0 ng；10 μM浓度下为172.1±73.9 ng），在第7天更加明显（0.5 μM浓度下为970.9±406.3 ng；10 μM浓度下为899.7±329.2 ng），在第14天最为显著（0.5 μM浓度下为877.8±155.3 ng；10 μM浓度下为1353.0±519.2 ng）。总体而言，利拉鲁肽对IL-8的抑制作用比对IL-6分泌的作用更强。

**图2. 利拉鲁肽减少IL-1β诱导的炎症并支持合成基因表达。** 人类关节软骨细胞被培养成3D球形团块，并在存在或不存在利拉鲁肽（0.5或10 μM）的情况下用IL-1β（1 ng/mL）刺激。图中显示了14天培养期间（A）IL-6和（B）IL-8的累积蛋白释放量。（C）第1天和第14天的ACAN和PRG4相对基因表达，均以第0天为基准进行标准化。来自3名生物供体的数据以平均值±95%置信区间显示，p值显示在括号上方。对于IL-6和IL-8的释放，每位供体有3次技术重复实验；对于基因表达，每位供体有2次技术重复实验。在转录水平上，IL-1β的刺激减少了ACAN和PRG4的表达（图2C）。对于ACAN，IL-1β处理的细胞团在所有时间点的表达水平都低于对照组，第1天的表达值为0.237±0.223倍，第14天的表达值为0.260±0.323倍，而对照组水平保持较高（分别为1.072±0.247倍和1.819±0.600倍）。0.5 μM的利拉鲁肽相对于IL-1β组增加了ACAN的表达，第1天的表达值为1.354±0.580倍，第14天的表达值为1.297±0.820倍。相比之下，10 μM的利拉鲁肽对ACAN表达没有影响（第1天为0.362±0.200倍；第14天为0.050±0.020倍）。对于PRG4，利拉鲁肽的效果取决于时间和剂量。IL-1β的刺激减少了PRG4的表达。第1天，PRG4的表达水平在对照组为1.072±0.247倍，在IL-1β刺激后为0.237±0.221倍。利拉鲁肽处理在第1天没有显著改变PRG4的表达，0.5 μM时的平均值为1.354±0.581倍，10 μM时的平均值为0.362±0.201倍。第14天，IL-1β组的PRG4表达仍然降低（0.338±0.11倍），而对照组为1.503±1.551倍。10 μM的利拉鲁肽处理相对于IL-1β组增加了PRG4的表达（0.713±0.07倍）。与对照组相比，Toluidine Blue染色显示IL-1β处理后蛋白多糖阳性区域减少（图3A，3B）。蛋白多糖染色区域在对照组第1天为68.73±8.37%，第14天为68.04±3.96%，而在IL-1β刺激后分别降至33.18±4.785%和41.31±3.365%。利拉鲁肽处理保持了蛋白多糖染色，0.5 μM和10 μM时的平均染色区域分别为67.05±6.74%和60.33±4.00%，与对照组观察到的水平相当。Aggrecan免疫染色显示了类似的趋势（图3A，3C）。IL-1β显著减少了ACAN阳性区域（第1天为11.75±0.36%，对照组为26.13%；第14天为16.09±2.35%，对照组为20.29%）。与IL-1β组相比，利拉鲁肽处理在第1天保持了aggrecan沉积（0.5 μM为16.71±2.93%，10 μM为15.78±0.71%），并在第14天将ACAN阳性区域恢复到与对照组相当的水平（0.5 μM为14.61±5.88%，10 μM为17.16±3.13%）。IL-1β刺激和利拉鲁肽联合处理没有影响细胞培养物中的细胞活力或细胞数量（补充结果SR2，补充图SF2A）。第14天的Caspase-3免疫组化显示IL-1β刺激后凋亡活性增加（66.28±5.29%），而对照组为32.34±4.73%。这种增加在两种浓度的利拉鲁肽处理下都减弱了（0.5 μM为53.16±3.27%；10 μM为40.60±6.63%），表明相对于IL-1β组凋亡活性较低（图3A，3D）。

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图3. 细胞团切片的组织学和免疫组化染色。人类关节软骨细胞细胞团在存在或不存在利拉鲁肽（0.5或10 μM）的情况下用IL-1β（1 ng/mL）处理。（A）Toluidine Blue染色、aggrecan和caspase-3免疫染色的代表性图像。（B）第1天和第14天的Toluidine Blue染色区域和（C）ACAN阳性染色区域的半定量。（D）第14天的caspase-3阳性染色区域的半定量。刻度尺 = 200 μm。数据来自3名生物供体（每位供体2次技术重复实验），以平均值±95%置信区间显示，p值显示在括号上方。

利拉鲁肽对机械负荷下人类软骨细胞支架OA模型的影响
为了评估机械刺激在炎症性OA模型建立中的作用，支架在负荷或无负荷条件下暴露于IL-1β。结果表明，机械刺激是建立稳定炎症-增生型OA样表型的关键因素（补充结果SR3，补充图SF3）。

IL-6和IL-8蛋白的释放量归一化到治疗第0天的值。在机械负荷下，IL-1β在支架培养物中诱导了强烈的炎症反应，其特征是IL-6和IL-8的分泌增加。对于IL-6（图4A），IL-1β在所有时间点显著增加了细胞因子的释放。在早期阶段（第1-3天），负荷对照组的平均IL-6水平为3.656±1.889倍，IL-1β刺激后为10.710±9.211倍。IL-6的分泌在第4-5天（对照组0.254±0.196倍对比IL-1β 1.763±0.817倍）和第6-7天（对照组0.202±0.159倍对比IL-1β 1.398±0.634倍）持续升高，表明在机械负荷下炎症激活持续。利拉鲁肽处理没有减弱IL-6的分泌。IL-1β显著增加了所有时间窗口内IL-8的释放（图4B）。在第1-3天，IL-8的水平从负荷对照组的2.829±1.447倍增加到IL-1β刺激后的10.44±6.524倍。IL-8的分泌在第4-5天（3.679±2.178倍）和第6-7天（3.12±1.796倍）在IL-1β处理的支架中持续升高。利拉鲁肽以供体和浓度依赖的方式减弱了IL-8的分泌。在第1-3天，0.01 μM的利拉鲁肽（3.782±1.505倍）相对于IL-1β组减少了IL-8的释放。在较晚的时间窗口（第4-5天和第6-7天），利拉鲁肽处理后也有IL-8释放减少的趋势。然而，这种效应主要是由供体4驱动的。

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图4. 在机械负荷下的支架培养物中的细胞因子释放和基因表达。人类关节软骨细胞在聚氨酯支架中培养，并在存在或不存在利拉鲁肽（0.01或0.1 μM）的情况下用IL-1β（1 ng/mL）刺激。（A）测量7天内的IL-6和（B）IL-8释放量，归一化到第0天。（C）第7天的IL6、IL8和ACAN的基因表达，分别显示为个体供体（左侧面板）和综合分析（右侧面板），归一化到第0天。数据来自4名生物供体，以平均值±95%置信区间显示，p值显示在括号上方。对于细胞因子分析，每位供体有3次技术重复实验；对于基因表达，每位供体有2次技术重复实验。

在基因表达水平上，IL-1β刺激在机械负荷下显著增加了IL-6和IL-8的表达，利拉鲁肽相关的减少幅度较小且依赖于供体，在供体2、3和4中更为明显（图4C，上部面板）。具体来说，IL-1β使IL-6的表达相对于负荷对照组增加了约13.4倍（IL-1β：20.68±23.92对比对照组：1.54±2.05）。利拉鲁肽将IL-6的表达相对于IL-1β减少了约0.17倍（0.01 μM为3.59±3.31倍），以及约0.85倍（0.1 μM为17.56±20.24倍）。同样，IL-1β使IL-8的表达相对于对照组增加了约16.4倍（IL-1β：14.86±15.79对比对照组：0.91±1.00）。利拉鲁肽将IL-8的表达相对于IL-1β减少了约0.63倍（0.01 μM为9.34±9.92倍）和约0.57倍（0.1 μM为8.43±8.69）。相比之下，IL-1β降低了ACAN的表达相对于对照组（约0.58倍；IL-1β：0.45±0.13对比对照组：0.78±0.29）。这种抑制部分被0.1 μM的利拉鲁肽逆转（1.09±0.84），它使ACAN的表达相对于IL-1β单独使用时增加了约2.40倍，这种效应主要由供体1、2和4驱动（图4C，下部面板）。

组织学分析显示，在IL-1β刺激后，机械负荷下的支架培养物中的细胞外基质沉积减少。Toluidine Blue染色强度在IL-1β处理的支架中低于负荷对照组，染色强度分别为204.1±12.2 a.u.和162.5±14.4 a.u.。利拉鲁肽处理保持了蛋白多糖染色。在0.01 μM和0.1 μM的利拉鲁肽下，Toluidine Blue染色强度分别为191.5±4.7 a.u.和193.9±13.6 a.u.，与对照组水平相当，并且高于IL-1β组（图5A，5B）。IL-1β刺激减少了机械负荷支架中的ACAN阳性染色强度（156.7±31.0 a.u.对比对照组222.3±11.8 a.u.）。利拉鲁肽处理相对于IL-1β组增加了ACAN阳性染色强度，在0.01 μM时达到221.6±17.2 a.u.，在0.1 μM时为194.6±7.2 a.u.（图5A，5C）。同样，IL-1β刺激后II型胶原阳性染色强度减少，并部分由利拉鲁肽处理恢复，在0.01 μM时为212.1 ± 30.2 a.u.，在0.1 μM时为227.7 ± 11.45 a.u.。IL-1β刺激和利拉鲁肽处理没有影响支架培养物中的细胞活力或细胞数量（补充图SF2B）。在机械负荷下的支架中，caspase-3免疫组化显示IL-1β刺激后凋亡活性增加（238.8±10.3 a.u.对比对照组145.3±12.8 a.u.）。利拉鲁肽处理在0.01 μM（212.8±9.8 a.u.）和0.1 μM（195.5±13.45 a.u.）降低了caspase-3阳性染色，与IL-1β组相比（图5A，5D）。

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图5. 在机械负荷下的支架培养物的组织学和免疫组化分析。人类关节软骨细胞在聚氨酯支架中培养，并在存在或不存在利拉鲁肽（0.01或0.1 μM）的情况下用IL-1β（1 ng/mL）刺激。（A）Toluidine Blue染色、aggrecan免疫组化、II型胶原免疫组化和caspase-3免疫组化的代表性图像。（B）Toluidine Blue染色强度的半定量，（C）aggrecan和II型胶原染色强度，以及（D）caspase-3染色强度的半定量。刻度尺 = 100 μm。数据来自4名生物供体（每位供体2次技术重复实验），以平均值±95%置信区间显示，p值显示在括号上方。

讨论
在这项研究中，我们调查了GLP-1RA利拉鲁肽在3D人类OA模型中的效果。在细胞团模型中，IL-1β诱导了类似炎症性的OA条件，而利拉鲁肽减弱了IL-6/IL-8的分泌，促进了合成基因表达，并保持了细胞外基质。同时，基于支架的模型结合了生理性的循环机械负荷，以更接近体内的生物力学环境。在这些条件下，IL-1β引发了强烈的炎症反应，而利拉鲁肽减弱了IL-8的分泌，部分恢复了ACAN的表达，并依赖于供体，在基质中保持了aggrecan和II型胶原的沉积。这些发现表明，利拉鲁肽在不同的3D OA系统中具有双重抗炎和合成作用，并且在生物力学相关的负荷条件下保持了其软骨保护作用。

先前的研究一致报告了GLP-1RA的抗炎和软骨保护作用，主要是在单层软骨细胞培养或动物模型中。在体内，Que等人证明了利拉鲁肽通过激活PKA/CREB通路减少了大鼠OA模型中的炎症介质产生和软骨退化[6]，而Meurot等人描述了利拉鲁肽在体内和体外环境中的镇痛、抗炎和抗降解作用[5]。同样，Zhang等人报告说利拉鲁肽抑制了AGE刺激的人类原代软骨细胞中的RAGE介导的炎症，同时保持了aggrecan和胶原II[25]。体外研究进一步支持了这一类别效应，因为dulaglutide被证明可以减少IL-6/IL-8的产生，并防止NF-κB/ROS驱动的软骨基质降解[26]，而GLP-1R激活在TNF-α刺激的人类软骨细胞中保持了aggrecan[27]。尽管这些研究提供了GLP-1RA抗炎和基质保护作用的令人信服的证据，但它们主要依赖于简化的培养系统或动物模型，这些模型没有包括关节环境的3D结构或生物力学线索。本研究通过证明利拉鲁肽在3D系统中培养的人类软骨细胞中保持了其抗炎和合成作用，包括在生理机械负荷条件下，从而加强了GLP-1RA在OA中的转化相关性。最近关于semaglutide的研究也表明其在软骨细胞中的代谢效应，包括在炎症条件下从糖酵解向氧化磷酸化的转变[28]。虽然这里没有进行评估，但我们对利拉鲁肽对软骨保护和合成作用的研究结果可能与这些代谢变化有关。观察到的PRG4的诱导尤其值得注意，因为这种润滑蛋白在软骨表面完整性和关节润滑中起着关键作用，但之前尚未直接与GLP-1R信号传导联系起来[29, 30]。从概念上讲，这些发现与Meurot等人的观点一致，即GLP-1/GLP-1R调节可能在OA中发挥超出症状缓解的疾病修饰作用[8]，也与Berenbaum的观点一致，即GLP-1RA可以独立于体重减轻直接调节关节组织[19]。重要的是，我们的结果还突出了个体间的差异作为一个关键的转化考虑因素。在机械负荷下，低浓度的利拉鲁肽在供体2、3和4中减弱了IL-6和IL-8的反应，而在较高浓度时部分恢复了供体1、2和4中的ACAN表达抑制。这种供体依赖的响应表明，利拉鲁肽的抗炎和合成作用可能通过部分不同的或解偶联的分子途径实现。这种异质性强调了未来研究的必要性，这些研究旨在识别预测性生物标志物，并对可能从基于GLP-1RA的疗法中获益最大的患者群体进行分层。此外，DNA定量结果显示，IL-1β和利拉鲁肽在颗粒或支架模型中均不影响细胞活力或细胞数量，这支持了观察到的保持基质效果和转录变化并非由细胞活力改变所驱动的结论。在颗粒和支架模型中进行的Caspase-3染色表明，IL-1β诱导了细胞凋亡，而利拉鲁肽则与IL-1β组相比抑制了细胞凋亡。这与先前的观察结果一致，即利拉鲁肽激活GLP-1R可以保护软骨细胞免受IL-1β诱导的凋亡，并调节OA软骨模型中的凋亡调节因子，如切割的caspase-3、Bax和Bcl-2，进一步支持了利拉鲁肽在OA病理生理学中的抗凋亡作用。机械负荷被证实是放大基于支架的构造中的OA样炎症和肥大反应的关键因素。在生理相关浓度下，负荷下的IL-1β刺激导致IL-6和IL-8的显著释放，而非负荷的构造则显示出最小的细胞因子反应。基因表达分析也反映了这些发现，IL-6、IL-8和COL10仅在负荷条件下上调，强调了机械应力在驱动炎症和肥大重塑中的作用。重要的是，IL-1β的浓度为1 ng/mL，这一浓度更接近生理水平，而不是体外常用的超生理剂量（例如10 ng/mL）。已有研究表明，机械负荷对炎症软骨的影响因实验系统、负荷参数、炎症环境和细胞类型而异。Fu等人表明，循环机械负荷可以抑制一氧化氮（NO）和前列腺素E2（PGE2）的释放，并防止用10 ng/mL IL-1β刺激的牛软骨细胞和软骨组织的降解[33]。类似地，Torzilli等人报告称，循环压缩负荷可以减少暴露于10 ng/mL IL-1α的牛软骨中的基质降解，表明生理负荷具有抗分解作用[34]。相比之下，Fang等人总结的证据表明，异常或过度的机械负荷可能会激活IL-1β/NF-κB信号通路，并促进OA的进展[35]。这些研究共同显示了机械应力的双重作用：在某些微环境下它具有保护软骨的作用，而在其他情况下则会促进OA的发展。我们的发现进一步扩展了这一概念，表明低剂量的IL-1β单独不足以在支架培养中引发强烈的炎症或肥大反应，而其与循环负荷的结合可以协同放大IL-6、IL-8和COL10的表达，从而在体外建立了一个生理相关的炎症-肥大表型。我们研究的另一个优点是使用了低葡萄糖培养基，这种培养基更接近生理葡萄糖浓度，比常用的高葡萄糖配方更真实地反映了生理情况，这可能进一步增强了该模型的转化相关性[35]。颗粒和支架系统中利拉鲁肽剂量反应的差异进一步突出了GLP-1受体信号传导的情境依赖性。在颗粒培养中，较低的利拉鲁肽剂量促进了ACAN基因的表达，而在支架培养中，较高的剂量部分恢复了ACAN的表达。这可能是由于两种模型之间的关键差异：首先，颗粒和支架平台在微环境和生物力学背景上存在显著差异；其次，两种模型中的利拉鲁肽浓度范围有意不同（颗粒：0.5-10 μM；支架：0.01-0.1 μM），以反映先前的体外研究和更符合转化实际情况的范围。这些不同的浓度可能以不同的效力激活GLP-1R信号传导，并可能引入非线性的剂量-反应行为。另一方面，10 μM的高剂量在颗粒模型中导致了ACAN的表达下降，同时促进了PRG4的表达。基因表达分析的时间分辨率是一个重要的考虑因素。ACAN和PRG4对利拉鲁肽的反应可能存在不同的动力学，即较高浓度可能会暂时抑制或延迟ACAN的表达恢复，而PRG4的上调则出现在不同的阶段。此外，ACAN和PRG4通过部分不同的信号通路进行调节，在软骨细胞外基质中发挥不同的功能作用。这些差异可能导致GLP-1R激活时的浓度依赖性和非线性转录反应。值得注意的是，ACAN基因表达与聚集蛋白水平之间存在明显差异。一个关键因素是转录调控与细胞外基质蛋白积累之间的时间延迟。虽然ACAN mRNA反映了采样时的短暂和动态转录反应，但通过组织学检测到的聚集蛋白代表了合成、分泌和随时间累积的基质保留的结果。因此，转录水平的短期或剂量依赖性差异可能不会立即转化为蛋白质丰度的比例差异，尤其是在基质保留较高的3D颗粒和支架系统中。尽管在不同利拉鲁肽剂量下观察到了相似的聚集蛋白阳性染色水平，但这可能是由于ACAN mRNA水平的差异所致。尽管颗粒和支架系统能够捕捉到软骨细胞生物学和生物力学的关键方面，但它们并未完全再现关节的多细胞复杂性，包括滑膜和软骨下骨的贡献。更先进的共培养或类器官芯片方法可能克服这些限制。另一个限制是培养基未能完全复制滑液?生化组成，未来可以通过向培养基中添加透明质酸或使用市售的模拟滑液的配方来解决这一问题。此外，还需要在其他相关情境下评估该药物的效果，例如疾病的早期阶段、来自表层或深层软骨区域的软骨细胞，以及衰老细胞群体，以进一步明确GLP-1RA疗法的转化潜力。OA在女性中的发病率较高，尽管本研究包括了两种性别，但其样本量不足以评估性别特异性反应；因此，不能排除利拉鲁肽存在性别依赖性反应的可能性。总之，这项研究表明，利拉鲁肽在人类OA的3D模型中具有抗炎和合成作用，并在机械相关条件下保持了软骨基质成分的完整性，支持进一步研究GLP-1RA作为OA疾病修饰治疗候选物的潜力。作者贡献：EC、SG、MA、FB和ZL负责研究的构思和设计；EC负责实验实施、数据分析及文章撰写；SCE负责人类组织样本的收集；MA、FB和ZL负责资金获取；所有作者共同参与了文章的严格审稿和最终批准；ZL对整个工作的完整性负责。利益冲突/资金情况：该项目获得了Eurostars-2联合计划的资助，以及欧盟Horizon 2020研究和创新计划的共同资助。支持这项工作的资助机构按参与国家字母顺序排列为：法国：BPI France；德国：项目管理机构（DLR），代表联邦教育和研究部（BMBF）；荷兰：荷兰企业机构（RVO）；瑞士：Innosuisse（瑞士创新机构）。