长链非编码RNA调控长春花中单萜吲哚生物碱的生物合成

《Plant Physiology and Biochemistry》：Long non-coding RNAs regulate monoterpene indole alkaloid biosynthesis in Catharanthus roseus

　　

摘要 尽管植物中长链非编码RNA (Long non-coding RNAs, lncRNAs) 的鉴定日益增多，但它们在次生代谢中的作用仍未得到充分探索，特别是在药用植物和芳香植物中。本研究探讨了lncRNAs在长春花 (Catharanthus roseus) 单萜吲哚生物碱 (Monoterpene indole alkaloid, MIA) 生物合成途径中的调控作用，该植物以生产抗癌化合物长春碱 (vinblastine) 和长春新碱 (vincristine) 而闻名。研究人员采用系统生物学方法鉴定了与MIA积累相关的候选lncRNAs，并通过瞬时过表达进行了验证。在候选lncRNA中，Crlnc440与MIA生物合成呈负相关。其在长春花叶片中的瞬时过表达导致文多灵 (vindoline, 23%)、长春碱 (33%)、脱水长春碱 (anhydrovinblastine, 27.7%) 和蛇根碱 (serpentine, 18%) 的显著减少，并伴随关键MIA生物合成基因 (D4H、DAT、PRX1和 SS) 以及主调控因子 MPK6的下调。相反，Crlnc343和 Crlnc1096与MIA生物合成呈正相关。Crlnc343的过表达导致长春碱 (142%)、脱水长春碱 (175%) 和长春质碱 (catharanthine, 64.5%) 的显著增加。类似地，Crlnc1096的过表达提升了长春碱 (151%)、脱水长春碱 (35%) 和长春质碱 (30%) 的水平。所有三个lncRNAs均表现出器官特异性表达模式，且通过转录组数据分析，研究人员确定了它们在茉莉酸甲酯处理条件下的差异表达。这项研究表明lncRNAs在调控次生代谢中具有多样化的作用，并强调了它们作为代谢工程有前途的靶点，以增强具有药理学价值的生物碱的生产潜力。

研究背景与目的

长链非编码RNA (lncRNAs) 是一类长度超过200个核苷酸、编码潜力有限的RNA分子，在真核生物转录组中占很大比例，并在多种生物学过程中发挥重要的调控功能。然而，尽管lncRNAs在植物中的鉴定日益增多，其在次生代谢，特别是在药用植物和芳香植物的特异性代谢产物合成中的调控作用仍知之甚少。长春花 (Catharanthus roseus) 是生产具有重要临床价值的抗癌药物长春碱和长春新碱的唯一植物来源，其合成途径为单萜吲哚生物碱 (MIA) 生物合成途径。尽管过去三十年，MIA的生物合成途径（包含超过31个酶促步骤）及相关转录因子的调控网络已被大量阐明，但lncRNAs是否及如何参与调控这一重要代谢途径，特别是在长春花中，仍属空白领域。为了探究lncRNAs在次生代谢产物生物合成中的潜在功能，本研究旨在鉴定并实验验证长春花MIA生物合成途径中具有调控功能的lncRNAs。该研究基于一种假设：由于植物激素信号通路与次生代谢产物生物合成存在共享的分子机制，茉莉酸甲酯处理实验（包括代谢物水平和相关基因表达的变化）的数据可用于识别与MIA生物合成相关的lncRNAs。

本研究由Farzaneh Aram、Ahmad Tahmasebi、Alireza Seifi和Seyed Hassan Marashi合作完成，并发表于期刊《Plant Physiology and Biochemistry》。该工作不仅为理解植物次生代谢的复杂调控网络增添了新的维度，也为通过代谢工程手段提高长春碱等珍贵生物碱的产量提供了新的潜在靶点，具有重要的基础研究和应用价值。

关键技术方法

本研究主要采用了几种关键的计算与实验技术方法。首先，lncRNA鉴定与关联分析：研究人员从公共数据库（如Medicinal Plant Genomic Resources，登录号SRP005953）获取长春花的转录组和代谢组数据。通过一系列严格的过滤标准（如长度>200 nt，与蛋白质数据库比对排除编码潜能，利用Coding Potential Calculator和Coding-Non-Coding Index评估）鉴定出候选lncRNAs。接着，使用加权基因共表达网络分析 (WGCNA) 方法构建基因模块，并评估这些模块与MIA代谢物水平的相关性，以筛选出与目标代谢物显著关联的lncRNA模块。同时，通过分析茉莉酸甲酯处理与未处理样品之间的差异表达，进一步筛选出受激素调控的lncRNAs。最后，基于皮尔逊相关系数 (|r| > 0.8, p < 0.01) 预测候选lncRNAs的潜在靶基因，并进行基因本体 (Gene Ontology, GO) 富集分析。其次，功能验证：通过农杆菌介导的瞬时过表达技术，在长春花叶片中过表达筛选出的候选lncRNAs (Crlnc440、Crlnc343和 Crlnc1096)，并以空载体 (Empty vector, EV) 作为对照。最后，表型与分子检测：利用超高效液相色谱-串联质谱 (UPLC-MS/MS) 技术定量分析过表达叶片中多种MIA的含量变化，并通过实时荧光定量PCR (RT-qPCR) 检测相关MIA生物合成基因的表达水平，以验证lncRNAs的调控功能。

研究结果

3.1. 与MIA生物合成途径相关lncRNAs的鉴定

研究人员基于公共转录组数据，通过严格过滤，从86,726个转录本中鉴定出4,303个潜在的lncRNAs。通过WGCNA分析，构建了7个lncRNA模块。其中，模块2与多种MIA（如长春质碱、文多灵、蛇根碱和阿吗碱）的水平存在显著关联。对模块2靶基因的GO分析显示，它们在细胞过程、代谢过程、有机物质代谢过程、氮化合物代谢过程和对非生物刺激的响应等方面显著富集。此外，通过比较茉莉酸甲酯处理和对照样本，研究人员鉴定出70个差异表达的lncRNAs。最终，综合考量与MIA的共表达、在激素处理下的差异表达以及与已知MIA途径基因的高度相关性 (|r| > 0.8)，研究人员筛选出三个候选lncRNA (Crlnc440、Crlnc343和 Crlnc1096) 进行后续功能验证。

3.2. 三个选定的CrlncRNAs调控MIA生物合成

通过RT-qPCR确认了三个候选lncRNAs在长春花叶片中的成功瞬时过表达。代谢物分析显示：

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  Crlnc440 的过表达导致文多灵、长春碱、蛇根碱和脱水长春碱的含量分别显著降低23%、33%、18%和27.7%。
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  Crlnc1096 的过表达导致长春碱、脱水长春碱和长春质碱分别显著增加151%、35%和31%，同时蛇根碱减少10%。
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  Crlnc343 的过表达导致长春碱、脱水长春碱和长春质碱分别显著增加143%、175%和64.5%，同时蛇根碱和马钱酸分别减少17.4%和26%。

3.3. CrlncRNAs调控长春花中MIA生物合成基因的表达丰度

为探究lncRNAs调控代谢物积累的分子机制，研究人员检测了相关MIA生物合成基因的表达水平。结果表明：

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  Crlnc440 的过表达导致关键MIA生物合成与调控基因 MPK6、D4H、DAT、PRX1和 SS的转录水平显著下降，其中DAT和D4H下降幅度最大（分别约19倍和21倍），而光响应转录因子GATA1的表达增加了2.7倍。这些基因的下调与相应代谢物的减少相一致。
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  Crlnc1096 的过表达导致参与长春质碱合成的HL1基因表达显著上调，这可能是长春质碱含量升高的原因之一。而Crlnc1096和Crlnc343的过表达对PRX1、SS和D4H的表达水平无显著影响。

3.4. CrlncRNAs的表达模式

表达谱分析显示，三个lncRNAs在长春花不同器官中均呈现器官特异性表达模式。其中，Crlnc440在花中表达最高，在根中最低，与典型的低表达lncRNA不同，其表达水平相对较高。Crlnc1096同样在花中表达最高。Crlnc343则在根中表达最高，在茎中几乎检测不到。在花中，高表达的Crlnc440与低水平的文多灵积累呈负相关。

3.5. Crlnc440、Crlnc343和 Crlnc1096在长春花中的保守性

序列保守性分析表明，尽管大多数lncRNAs序列保守性较低，但Crlnc440在夹竹桃科 (Apocynaceae) 的另外两个成员（小蔓长春花 (Vinca minor) 和欧洲夹竹桃 (Nerium oleander)）中均能检测到完整的扩增片段，且序列相似性为100%。而Crlnc343和 Crlnc1096在测试物种中未检测到保守序列。

讨论与结论

本研究的发现表明lncRNAs是MIA生物合成调控网络中的一个新层次。研究人员在讨论中构建了lncRNAs调控MIA途径的示意图，并对结果进行了深入分析。

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  Crlnc440作为MIA生物合成的负调控因子：其过表达导致多种下游MIA积累减少，并伴随关键生物合成基因 (D4H、DAT、PRX1、SS) 和上游主调控因子 MPK6的下调。这种影响可能通过影响染色质状态或与调控蛋白相互作用实现，特别是考虑到MIA途径晚期步骤在特定细胞类型（如异细胞，idioblasts）中受到严格的表观遗传和染色质水平调控。值得注意的是，Crlnc440的表达与文多灵积累在器官水平呈负相关，且在夹竹桃科中具有罕见的100%序列保守性，暗示其可能在该途径中扮演重要的核心调控角色。
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  Crlnc343和 Crlnc1096作为MIA生物合成的正调控因子：两者过表达均显著增加了长春碱、脱水长春碱和长春质碱的产量，同时减少了竞争性分支产物蛇根碱的积累。这种促进作用可能与上调长春质碱合成基因 HL1（针对Crlnc1096）以及将代谢通量从蛇根碱分支转向长春碱分支有关。它们为通过代谢工程提高长春碱产量提供了有前景的新靶点。

总之，研究人员在论文的“结论”部分总结道：这项研究首次证实了长链非编码RNA参与长春花中单萜吲哚生物碱的生物合成。研究人员鉴定并功能表征了三个具有相反作用的lncRNAs：Crlnc440作为一个负调控因子，可能通过影响MPK6来抑制多个晚期途径基因；Crlnc343和 Crlnc1096则作为正调控因子，通过上调长春质碱分支和抑制竞争性的蛇根碱途径来增强长春碱的生产。这些lncRNAs的器官特异性表达模式、Crlnc440在夹竹桃科中显著的序列保守性，以及通过调控这些lncRNAs实现的显著代谢改变，共同证明了它们在MIA生物合成调控架构中的重要性。这些发现不仅扩展了人们对植物次生代谢复杂调控网络的理解，而且为通过代谢工程提高具有药理学价值的抗癌生物碱的产量提供了有前景的新靶点。