一种新型的痘病毒-螯合物结合物的制备方法，以及将其抗菌活性与含有氨基团的痘病毒系统进行比较的研究

《Polymer Chemistry》：A novel approach to POx–chelate conjugates and a comparison of their antibacterial activity with POx systems containing amino groups

　　马塞利娜·博契内克（Marcelina Bochenek）、芭芭拉·门德雷克（Barbara Mendrek）、阿格涅什卡·科瓦尔丘克（Agnieszka Kowalczuk）、卡罗利娜·奥尔绍夫斯卡（Karolina Olszowska）、卢卡什·谢隆（?ukasz Sieroń）、卡塔里娜·加沃龙（Katarzyna Gawron）和娜塔莉亚·奥莱斯科-托布斯（Natalia Oleszko-Torbus）
波兰科学院姆·居里-斯克沃多夫斯凯聚合物与碳材料中心
地址：M. Curie-Sk?odowskiej 34, 41-819 Zabrze, 波兰
电子邮箱：[e-mail]

本研究介绍了一种新型的合成策略，用于制备基于聚（2-噁唑啉）（POx）的抗细菌共辄物，并将其与螯合剂结合。通过微波辅助的阳离子开环聚合（CROP）方法，成功合成了2-乙基-2-噁唑啉与2-[N-Boc-5-氨基戊基]-2-噁唑啉的明确定义的随机共聚物。脱保护后，该共聚物与二乙烯三胺五乙酸（DTPA）进行了共辄。这项工作展示了一种简化且高效的生产抗细菌POx共辄物的方法，其中氨基团在聚合后直接与螯合剂偶联，无需在聚合后对聚合物进行任何修饰即可生成取代基上的氨基团。对共辄POx及其氨基修饰前体进行了全面的表征，包括结构分析和物理化学性质测定。同时评估了初步的抗细菌活性和细胞毒性，采用了细菌膜测定和显微成像技术。两种体系均对常见的革兰氏阴性菌株大肠杆菌（E. coli）表现出活性，但作用机制不同：共辄物可能通过阳离子螯合作用发挥抗细菌作用，而其氨基修饰前体则通过阳离子聚合物介导的相互作用发挥作用。重要的是，这两种聚合物均与人成纤维细胞具有良好的相容性。总体而言，本研究为设计聚合物抗菌剂提供了一个多功能平台，为未来的生物医学应用提供了可调的离子螯合功能。

**引言**
如今，传染病已成为全球性的公共卫生问题，主要原因是微生物具有高效的传播和繁殖能力。它们的存在对医疗系统造成影响，带来了社会和经济负担，因此需要开发和测试新型抗菌系统。近年来，人们对具有抗菌性能的聚合物越来越感兴趣，其中聚（2-噁唑啉）（POx）尤其受到关注。POx是通过2-噁唑啉的活性阳离子开环聚合（CROP）合成的，这种方法可以精确控制聚合物的摩尔质量、结构和狭窄的分布性。这种受控制的“活性”聚合行为已在各种条件和单体/引发剂体系下得到验证，产出了低多分散性的明确定义的POx。这些聚合物在先进生物活性材料的设计中显示出巨大潜力，因为它们具有优异的生物相容性、低免疫原性以及易于化学修饰的特点，从而可以精确调节其性质。通常，POx基体系的抗菌活性与其结构中引入的氨基团有关，这些氨基团可以与细菌细胞膜相互作用并导致其破坏。胺功能化的POx的抗菌活性主要源于其阳离子性质，这种性质会破坏细菌膜，类似于抗菌肽的作用机制。质子化的氨基或铵基团会与带负电荷的细菌膜结合，使其不稳定并增加膜的通透性。虽然这种机制是阳离子POx的主要作用方式，但其他基于POx的体系 also 通过其他途径发挥抗菌效果，如靶向DNA、干扰细菌代谢或调节细菌信号通路等。我们之前开发了一种含有螯合基团的新型POx基体系，并证实了其抗菌活性。这些发现表明，抗菌效应可能源于共轭螯合剂结合二价阳离子（Ca2+和Mg2+）的能力，这些阳离子在稳定细菌细胞膜中起着关键作用。这揭示了一种通过离子螯合作用在POx体系中实现抗菌效果的新方法。为了获得POx–螯合体系，采用了两种共辄策略：一种是通过N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）酯活化的偶联方式，另一种是使用三嗪类偶联剂进行反应。这些方法要求POx中存在氨基团，这些氨基团是在聚合后通过硫醇点击化学引入的。在本研究中，我们展示了通过Boc保护的单体进行CROP聚合，随后脱保护并直接偶联螯合剂得到的新型POx–螯合体系，从而避免了聚合后的修饰需求。合成了2-乙基-2-噁唑啉（EtOx）与2-[N-Boc-5-氨基戊基]-2-噁唑啉（PentNHBocOx）的明确定义的随机共聚物，命名为POx–Boc。脱保护后得到了氨基功能化的共聚物POx–NH2，并确认了Boc基团的完全去除，并精确测定了其绝对摩尔质量。共聚物单体的选择基于结构和功能考虑：EtOx的加入确保了所得共聚物良好的水溶性，而PentNHBocOx的引入则使氨基团位于远离聚合物主链的位置，便于后续功能发挥。随机共聚物微结构的采用有助于将功能单体单元均匀分布在整个聚合物链中，减少局部密度和空间障碍，从而提高共辄反应的效率。此外，这种单体比例的选择限制了氨基团的总量，以尽量减少潜在的细胞毒性并保持偶联过程中的水溶性。随后，将二乙烯三胺五乙酸（DTPA）螯合剂连接到共聚物上，得到了POx–DTPA体系。所选螯合剂因其优异的金属离子结合性能而被选中。确认了完全的共辄（所有氨基团被DTPA取代）和离子结合能力。重要的是，评估了所得POx–DTPA共辄剂对模型大肠杆菌菌株的抗菌活性，并与其未经修饰的前体进行了比较。本研究展示了一种简化的抗细菌POx–螯合体系合成方法，并为设计金属离子捕获聚合物抗菌剂提供了新的见解。

**实验材料**
使用的试剂包括：
甲基4-硝基苯磺酸盐（99%，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、正丙胺（>99%，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、三氟乙酸（TFA，99%，Alfa Aesar，美国马萨诸塞州哈弗希尔）、二氯甲烷（DCM，99.5%，Pure Land Chemical，中国上海）、甲醇（用于HPLC的梯度级，ChemSolve，美国马萨诸塞州特克斯伯里）、乙醇（用于HPLC的99.8%，POCH S.A.，波兰格利维采）、CaH2（95%，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、二乙烯三胺五乙酸（DTPA，>99%，Carl Roth GmbH，德国卡尔斯鲁厄）、4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基吗啉鎓氯化物（DMTMM，97%，Acros Organics，比利时海尔）、NaOH（纯度用于分析，Stanlab Sp. z o.o.，波兰卢布林）、MgCl2·6H2O（纯度，POCH S.A.，波兰格利维采）、艾罗铬黑T（Loba Chemie，印度孟买）、LiBr（99%，Alfa Aesar，美国马萨诸塞州哈弗希尔）、NaNO3（99%，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、铵缓冲液（pH 10，TarChem Sp. z o.o.，波兰塔尔诺夫斯基戈里）、CaCl2（95%，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）和氨 Purpurate（murexide，超纯，Loba Chemie，印度孟买）。PentNHBocOx（>97%，Polymer Source，加拿大魁北克省多瓦尔）在减压（1 × 10?? mbar）下使用高真空泵（NEXT Turbomolecular Pumping Station，配备nEXT85H涡轮分子泵和nXDS6i背压泵，Edwards Ltd，英国克劳利）干燥8小时，并在氩气氛围中储存。EtOx（>99%，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）在减压下蒸馏，用CaH2干燥后再次蒸馏。EtO的纯度通过气相色谱（Shimadzu Nexis GC 2030，日本京都）分析，该色谱仪配备有两个色谱柱：一个装有FID和BID-2030检测器（30 m × 0.32 mm ID；0.25 μm，Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）和另一个装有SH-I-17检测器（30 m × 0.32 mm ID；0.50 μm，Shimadzu Corporation，日本京都）。乙腈（ACN，>99%，Merck KGaA，德国达尔姆施塔特）按先前描述的方法制备。N,N-二甲基甲酰胺（DMF，用于HPLC，POCH S.A., 波兰格利维采）在使用前进行了蒸馏。

**生物试剂**
使用的生物试剂包括：Luria–Bertani（LB）培养基（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、Mueller–Hinton（MH）培养基（Sigma-Aldrich）、Dulbecco改良的Eagle培养基（DMEM，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、1-苯基萘胺（NPN，Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）、台盼蓝（PAN Biotech，德国艾登巴赫）和Triton X-100（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯），以及大肠杆菌TOP10菌株。原代真皮成纤维细胞（PDFs）购自美国类型培养 kolec tion（ATCC，编号PCS-201-010?）。

**POx–Boc的合成**
POx–Boc的合成在微波反应器（Anton Paar Monowave 400，奥地利格拉茨）中于140 °C下进行。共聚反应的进展通过核磁共振（1H NMR）监测。将甲基4-硝基苯磺酸盐溶于乙腈中，放入装有磁力搅拌器的微波瓶中。在氩气氛围下，同时加入EtOx和PentNHBocOx进行一锅反应。2小时后，用正丙胺终止反应。通过1H NMR确认完全转化后，通过蒸发挥除乙腈、甲醇溶解、透析（1 kDa Spectra/Por?膜）和减压干燥来提纯共聚物。提纯后的共聚物被命名为POx–Boc，并通过1H NMR确定其化学组成。

**POx–Boc的脱保护**
将Boc保护的共聚物溶于DCM中，然后按1:1（v/v）的比例加入TFA，其中TFA的量比聚合物中的Boc基团过量1.5 mol%。在室温（RT）下搅拌反应1小时后，蒸发TFA和DCM。含有三氟乙酸根离子（名为POx–NH3+TFA?）的盐形式的聚合物用于与DTPA的共辄反应。为了去除TFA阴离子，将POx–NH3+TFA?溶于甲醇中，并用Amberlyst A-21离子交换树脂（Thermo Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）处理。然后蒸发甲醇，共聚物通过水（1 kDa Spectra/Por?膜）透析并进行冻干。含有氨基团的共聚物（POx–NH2）用于细胞毒性和抗菌活性研究。

**POx–NH3+TFA与螯合剂DTPA的共辄**
将大约80当量的DTPA（每摩尔聚合物中的氨基团）溶于水中（浓度约为1 g/mL），加入NaOH（5 mol/L）直至溶液pH达到8.5。将大约5当量的DMTMM（每摩尔聚合物中的氨基团）溶于水中（浓度约为0.05 g/mL），然后加入水中的DTPA溶液中并搅拌。接着向混合物中加入POx–NH3+TFA–的水溶液（浓度约为0.05 g/mL）。反应溶液在室温下搅拌过夜，然后转移至1 kDa Spectra/Por?膜上并用水透析。通过冷冻干燥回收聚合物，并将其命名为POx–DTPA。

**测量方法**
**核磁共振（NMR）**：使用Bruker Ultrashield光谱仪（Bruker，美国马萨诸塞州比勒里卡）在600 MHz下记录溶解在CDCl3或D2O中的样品的1H和13C NMR谱。
**尺寸排阻色谱与多角度激光散射（SEC-MALLS）**：使用在DMF中运行的系统测定共聚物的摩尔质量和分散系数（?）。系统配备多角度光散射检测器（DAWN HELEOS II，Wyatt Technologies，美国加利福尼亚州圣巴巴拉；λ = 663.8 nm）和折射率检测器（Dn-2010 RI，WGE Dr Bures，德国杜伦；λ = 620 nm）。流动相为含5 mmol/L LiBr的DMF，流速为1 mL/min。系统配备GRAM柱（100 ?、1000 ?和3000 ?）和 guard柱（Polymer Standards Service，德国）。测量在45 °C下进行，所有溶液在注入前均通过PTFE膜（0.2 μm）过滤。数据采集和分析使用ASTRA 7软件（Wyatt Technologies，美国加利福尼亚州圣巴巴拉）完成。
**折射率增量（dn/dc）的测定**：计算含有Boc基团的共聚物的折射率增量（dn/dc）以确定其绝对摩尔质量。

**其他测量方法**
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**相关公式**：
- wPEtOx 表示共聚物中2-乙基-2-噁唑啉的重量比例；
- wPBocOx 表示2-[N-Boc-5-氨基戊基]-2-噁唑啉的重量比例；
- 是2-乙基-2-噁唑啉均聚物的折射率增量，值为0.083 mL/g；
- 是2-[N-Boc-5-氨基戊基]-2-噁唑啉均聚物的折射率增量，独立测得，值为0.068 mL/g；
- 共聚物脱保护后的折射率增量（dn/dc）通过以下公式计算：

（公式具体内容在原始文本中未提供，因此未翻译。）共轭物的螯合Mg2+离子的能力通过使用eriochrome black T探针进行了分析。首先将42 POx–DTPA溶解在水中（浓度为5 mg/mL，pH约为5），然后加入MgCl2·6H2O（其量与共轭物中的DTPA等摩尔）。溶液搅拌24小时后，向其中加入1 mL铵缓冲液和0.15 mL eriochrome black T溶液（溶解在甲醇中，浓度为5 mg/mL）。观察到溶液颜色从透明变为紫色。通过滴定法在murexide指示剂存在下研究了其捕获Ca离子的能力。首先将共轭物溶解在水中（浓度为5 mg/mL，pH约为5），然后加入CaCl2（其量与共轭物中的DTPA等摩尔）。溶液再次搅拌24小时，之后加入0.15 mL NaOH（浓度为5 mol/L）和0.15 mL murexide溶液（溶剂为水：乙醇，比例为1:1，浓度为2.5 mg/mL）。观察到溶液颜色从透明变为浅紫色。

扫描电子显微镜和能量分散X射线光谱分析（SEM-EDX）：使用扫描电子显微镜（SEM）结合能量分散X射线光谱（EDX）在5000倍放大倍数下观察了复合离子的存在并绘制了样品表面的图谱。样品制备在清洗和脱脂的硅片上（Cemat Silicon S.A.，波兰比德戈什奇；硅片表面涂有3 nm厚的SiO2层），具体步骤如下：将POx–DTPA溶解在水中，然后加入CaCl2或MgCl2·6H2O（其量与共轭物中的DTPA等摩尔），混合物搅拌24小时后通过1 kDa Spectra/Por?膜进行透析。将50 μL的样品滴在硅片上，空气干燥12小时，然后在减压条件下完全干燥。

大肠杆菌形态的SEM分析：使用Quanta 250 FEG型扫描电子显微镜（Thermo Fisher Scientific，美国沃尔瑟姆）在低真空模式下进行大肠杆菌形态分析，束流加速电压为5 kV。将以下溶液各3 μL滴在硅片上：（i）LB培养基中的大肠杆菌（浓度为10^8 CFU/mL）；（ii）含有大肠杆菌（浓度为10^8 CFU/mL）的POx–DTPA溶液（浓度为1 mg/mL），在室温下孵育2小时；（iii）含有大肠杆菌（浓度为10^8 CFU/mL）的POx–NH2溶液（浓度为1 mg/mL），在室温下孵育2小时。样品在层流罩中静置过夜干燥后，先用5 nm厚的金层进行溅射镀膜（溅射时间：10秒，溅射电流：60 mA）。SEM图像的放大倍数范围为5000×至40,000×。

抗菌活性测定：通过NPN（浓度为20 μM，溶解在PBS中）评估外膜（OM）的通透性，将含有大肠杆菌（OD600 = 0.5）的样品与POx–NH2、POx–DTPA-Ca或POx–DTPA（浓度为1 mg/mL）一起孵育，随后使用Victor X5平板读数仪（PerkinElmer，美国沃尔瑟姆）在355/460 nm波长下进行荧光测量。POx–DTPA-Ca的制备方法如下：先将POx–DTPA溶解在水中，然后加入CaCl2（其量与共轭物中的DTPA等摩尔），混合物搅拌24小时后通过1 kDa Spectra/Por?膜进行透析并冻干。对于内膜（IM）通透性测定，将大肠杆菌悬浮液分别与POx–NH2或POx–DTPA（浓度为1 mg/mL）处理，然后用trypan blue（浓度为0.4%）染色，并使用BD FACSAria仪器（BD Biosciences，美国圣何塞）通过流式细胞术进行分析（PE通道）。Triton X-100（浓度为0.01%）作为阳性对照。三个独立生物学重复实验的结果证实了NPN和流式细胞术测定中观察到的趋势。

最小抑制浓度（MIC）的测定：使用大肠杆菌通过微量稀释法测定了POx–DTPA、POx–DTPA-Ca和POx–NH2的MIC。首先制备新鲜的MH肉汤，将细菌接种物调整至光密度（OD600）为0.5（约相当于1 × 10^8 CFU/mL），然后稀释至1 × 10^6 CFU/mL。将聚合物在肉汤中连续二次倍增稀释后加入到无菌96孔微孔板中，每孔含有100 μL聚合物溶液和100 μL细菌接种物，最终体积为200 μL/孔。同时设置生长对照（仅含肉汤）和无菌对照（仅含肉汤）。将平板置于37°C下孵育24小时。MIC定义为完全抑制细菌生长的最低共轭物浓度，通过OD600值或肉眼观察浊度来确定。所有测试均在三个独立的生物学实验中进行，每个实验重复三次。MIC值报告为三次实验的平均值。

细胞毒性研究：将PDFs以每孔5 × 10^4个细胞的密度接种到24孔板中，培养条件为DMEM培养基（含有10% FBS、1% l-谷氨酰胺、1000 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素和250 μg/mL两性霉素B），并在37°C、5% CO2氛围下培养24小时。随后加入POx–NH2或POx–DTPA（浓度分别为0.1 mg/mL和1 mg/mL），继续培养24、48和72小时。使用10% Alamar Blue溶液在每个时间点评估细胞活力。未处理的细胞作为对照。每次培养后，用200 μL Alamar Blue溶液替换培养基，然后在37°C下孵育1小时。孵育后，将100 μL培养基转移到96孔板中，并使用VICTOR? Multilabel Plate Reader（PerkinElmer，美国沃尔瑟姆）在1秒曝光时间下测定细胞活力。

共聚物前体（POx–Boc）的合成与表征及其脱保护：根据图1所示方案，使用微波辅助CROP方法（以甲基4-硝基苯磺酸为起始剂，以正丙胺为终止剂）合成了PentNHBocOx和EtOx，所得共聚物命名为POx–Boc。POx–Boc的表征结果见表1。样品是在硅片上制备的，使用了POx–DTPA（10 mg/mL的水溶液）与Ca2+和Mg2+离子以与DTPA单元等摩尔量结合的复合物。样品孵育24小时后，先在空气中晾干，然后在减压条件下进一步干燥。在光谱的碳区（0.27–0.28 keV）以及结构中存在的氧区（0.53 keV）和氮区（0.39–0.40 keV）观察到信号强度显著增加。来自Si（1.75 keV）的信号归因于用于样品制备的硅片。我们的结果证实了Ca和Mg离子与结合物的结合，这通过这些离子的特征能量值峰值得到证明：钙的峰值为3.69–3.80 keV，镁的峰值为1.19–1.38 keV。在未与金属离子结合的对照POx–DTPA的EDX曲线中没有观察到这些峰值。图6B中的EDX映射结果显示了通过其特征X射线信号批准的Ca和Mg离子的表面覆盖情况。观察到钙和镁离子在分析样品表面的均匀分布。获取了元素图以可视化这些离子的空间定位，从而了解结合物层内的排列方式。这种分析有助于定性评估元素分散情况，并可作为进一步定量评估的基础。

为了比较POx–DTPA和POx–NH2的抗菌活性和体外细胞毒性，进行了一系列微生物实验来评估它们破坏大肠杆菌模型细胞的内膜（IM）和外膜（OM）的能力。这些实验包括对膜通透性和完整性的评估，以研究两种结合物之间作用机制的潜在差异。这种双膜方法提供了对所测试化合物抗菌效果和膜靶向能力的更全面理解。由于POx–NH2和POx–DTPA的功能基团数量相同，因此可以直接比较它们的活性。此外，还测试了饱和了模型钙离子的POx–DTPA（POx–DTPA-Ca）对大肠杆菌的活性。在第一阶段，使用肉汤微量稀释法确定了POx–DTPA、POx–DTPA-Ca和POx–NH2对大肠杆菌的最小抑制浓度（MIC）。MIC被定义为完全抑制测试微生物可见生长的最低 antimicrobial 剂浓度。POx–DTPA的MIC值为0.15 mg/mL，而POx–DTPA-Ca的MIC值为1.25 mg/mL。这表明钙饱和后抗菌活性显著降低，支持了金属离子螯合作用在POx–DTPA作用机制中的作用。文献报告指出，基于POx的阳离子抗菌系统的MIC值通常在几百分之一毫克/毫升到几毫克/毫升之间，具体取决于聚合物结构和作用方式。在这种情况下，我们新的螯合系统POx–DTPA对大肠杆菌的MIC值为0.15 mg/mL，处于基于POx的抗菌系统的活性范围内。POx–NH2的MIC值为1 mg/mL，表明需要更高浓度才能产生致死效果。

为了评估POx–DTPA和POx–NH2破坏内膜完整性的能力，进行了锥虫蓝排除实验。将大肠杆菌培养物与测试聚合物（每种1 mg/mL）共培养，然后用染料染色。锥虫蓝的吸收量反映了膜损伤的程度，并通过流式细胞术进行量化。未处理的细胞作为阴性对照，而Triton X-100（一种已知的膜破坏剂）用作内膜破坏的阳性对照。结果显示在荧光直方图中（图7）。

为了评估POx–DTPA和POx–NH2对细菌外膜的潜在损伤，将大肠杆菌培养物与测试聚合物（每种1 mg/mL）在LB培养基中共培养，并在NPN染料存在下进行荧光强度测量。NPN是一种疏水性荧光探针，在水环境或完整的细菌细胞中几乎不发光。然而，在外膜破坏后，NPN能够分配到富含磷脂的周质空间中，导致荧光显著增加。这种方法广泛用于评估细菌外膜的完整性并检测膜通透性增强剂。图8展示了POx–DTPA和POx–NH2处理后大肠杆菌的荧光强度。与未处理的对照组相比，POx–DTPA或POx–NH2处理的大肠杆菌细胞的荧光强度明显向Triton X-100处理的细菌的荧光特征值偏移，表明膜完整性丧失，特别是表明内膜通透性增加。两种聚合物处理的样品观察到的相似荧光模式表明，POx–DTPA和POx–NH2以类似程度诱导内膜通透性。这些发现与这两种结合物能够促进原本不能穿透膜的锥虫蓝染料进入细胞质的能力一致，反映了膜屏障功能的受损。

为了评估POx–DTPA和POx–NH2对细菌外膜的潜在损伤，将大肠杆菌培养物与测试聚合物（每种1 mg/mL）在LB培养基中共培养，并在NPN染料存在下进行荧光强度测量。NPN是一种疏水性荧光探针，在水环境或完整的细菌细胞中几乎不发光。然而，在外膜破坏后，NPN能够进入富含磷脂的周质空间，导致荧光显著增加。这种方法广泛用于评估细菌外膜的完整性并检测膜通透性增强剂。图8展示了POx–DTPA和POx–NH2处理后大肠杆菌的相对荧光单位（RFUs）。与未处理的对照组相比，POx–DTPA或POx–NH2处理的大肠杆菌细胞的荧光强度增加，表明外膜被破坏。相比之下，预先饱和了钙离子的POx–DTPA的荧光强度与对照组相当，表明它没有引起外膜破坏。值得注意的是，POx–DTPA的荧光强度略高于POx–NH2。这些发现表明，POx–DTPA和POx–NH2都有能力破坏细菌膜的完整性，从而促进疏水性分子（如疏水性染料）的吸收。两种共聚物处理细胞之间的荧光强度差异可能表明存在不同的作用机制，可能与DTPA部分的螯合特性有关。具体来说，POx–DTPA结合物可能通过结合二价阳离子（Ca2+和Mg2+）发挥其破坏作用，这些阳离子对稳定革兰氏阴性菌的外膜脂多糖（LPS）层起着关键作用。NPN实验间接证实了这一机制，其中饱和了钙的POx–DTPA没有表现出抗菌活性。相比之下，缺乏螯合基团的POx–NH2可能主要通过静电相互作用或与膜成分的氢键与膜相互作用，从而导致不同的膜扰动机制。理解这些差异对于定制针对抗菌应用的聚合物结合物至关重要，因为膜相互作用方式影响疗效和特异性。进一步的研究，包括膜生物物理分析，将有助于阐明POx–DTPA诱导的增强通透性的精确分子相互作用。

为了进一步研究测试聚合物的抗菌活性，进行了扫描电子显微镜（SEM）分析。将大肠杆菌培养物与POx–DTPA或POx–NH2（每种1 mg/mL）共培养2小时。然后收集样品，将其涂在固体基底上，空气中晾干，再使用SEM成像。如图9A所示，暴露于聚合物溶液之前可见密集的细菌菌落。与POx–DTPA或POx–NH2共培养后，没有检测到完整的细菌细胞（图9B和C），只有残余的碎片或受损细菌细胞的碎片，这表明两种聚合物均具有有效的杀菌活性和严重的膜损伤。

除了研究聚合物系统的抗菌活性外，还评估了它们对模型人类皮肤成纤维细胞的细胞毒性（图10）。结果表明，即使在暴露72小时后，POx–DTPA和POx–NH2在其抗菌活性对应的浓度范围内也表现出可忽略的细胞毒性。这一观察表明了生物相容性，并表明这些聚合物结合物适用于潜在的生物医学应用。

总之，这项研究展示了一种通过直接CROP功能化单体、随后去保护和DTPA结合来制备POx-螯合物的有效方法，提供了一个简化的生物活性聚合物平台。结构表征证实了聚合物的完整性和成功的结合，而生成的POx–DTPA有效螯合了对细菌膜稳定性至关重要的二价阳离子。使用大肠杆菌模型菌株进行的微生物实验显示，该结合物及其氨基功能化前体都能有效破坏内膜，其中POx–DTPA对外膜的破坏略大。在未来的研究中，应该评估更广泛的细菌菌株，包括革兰氏阴性和革兰氏阳性菌种。这两种聚合物都表现出极低的细胞毒性，突显了它们作为多功能抗菌材料的潜力。所获得的POx系统结合了结构多样性、可调的单体组成和功能化，从而能够精确控制物理化学和生物性质。在这个意义上，所介绍的平台为未来的优化提供了坚实的基础，而不是代表最终的结构。总的来说，这些发现确立了基于POx的结合物作为多功能和可调抗菌材料平台的能力。