BjuBBX25b蛋白的鉴定及其功能与相互作用分析：该蛋白参与油菜（Brassica juncea）的发育调控及对镉（Cd）的响应

《Plant Science》：Identification, functional and interaction proteins analysis of BjuBBX25b involved in development regulation and Cd responsiveness in Brassica juncea

　　姜高|任可然|徐远曼|吴成润|王青|黄代宇|黄宝文|曾静
浙江丽水大学农业与生物技术学院，邮编323000，中国

摘要
B. juncea（Brassica juncea var. latipa Li）是中国一种重要的叶菜类蔬菜，既适合鲜食也适合加工。在本研究中，我们鉴定出了71个BjuBBX基因，并将其分为五个亚家族，发现这些基因的片段重复是导致家族扩增的原因。通过RNA-seq和qRT-PCR的分析显示，BjuBBX25b在根部的表达具有明显的器官特异性，并且在镉（Cd）胁迫下显著上调，这激发了我们对其功能的进一步研究。为了阐明其在发育和重金属响应中的作用，我们在拟南芥中生成了三个BjuBBX25b过表达（OE）株系。与野生型植物相比，这些株系的莲座叶数量减少，角果（豆荚长度）也缩短。qRT-PCR分析表明，在重金属胁迫（Mn、Zn、Mg、Cd）下，与生长素相关的基因（AtYUC6、AtPIN4）、发育调控因子（AtCUC2、AtDPA4）以及镉响应转运蛋白（AtHMA3、AtPAMP4）的表达显著下调。酵母双杂交和BiFC实验鉴定了六个与BjuBBX25b相互作用的蛋白，其中包括BjuPRMT1.1。表达分析显示，虽然BjuBBX25b和BjuPRMT1.1在花蕾中表达下调，但其六个相互作用蛋白在早期生殖阶段（角果形成期）表达上调。亚细胞定位结果显示，BjuBBX25b主要定位于细胞核，而其相互作用蛋白则主要位于细胞质中。综上所述，BjuBBX25b在调节叶片发育、生殖过程和镉胁迫响应中发挥着多重作用，可能是通过负调控生长素信号成分、发育调控因子和重金属相关转运蛋白来实现的，其相互作用蛋白（BjuPRMT1.1）可能也对这些调控过程有所贡献。

引言
B. juncea是中国广泛食用的叶菜类蔬菜，因其富含氨基酸、维生素C、蛋白质、可溶性糖和粗纤维而受到重视。然而，抽薹会显著增加粗纤维含量，从而影响口感和加工品质。作为十字花科模型植物，拟南芥的抽薹时间受六个主要途径调控（春化作用、光周期、赤霉素、温度、自主途径和衰老途径，Notaguchi等人，2008年；Fornara等人，2010年；Srikanth和Schmid，2011年）。其中，光周期和春化作用被认为是控制抽薹时间最重要的因素（Song等人，2014年）。尽管十字花科植物的抽薹调控网络已得到广泛研究，但关于B. juncea的具体分子机制的研究却很少（Yang等人，2014a年；Wang等人，2015年）。
在拟南芥中，根据B-box结构域的数量、特定序列特征以及CCT结构域的存在与否，已鉴定出32个AtBBX蛋白，并将其分为五个结构亚组（Khanna等人，2009年）。BBX（B-box结构域蛋白）是一类特殊的锌指转录因子，其特征是含有一个或两个B-box结构域。这些结构域作为锌结合基序，并由保守的半胱氨酸和组氨酸残基稳定。大量研究表明，BBX蛋白在植物生长和环境适应中起着多种作用，包括应激响应、激素信号通路、光形态发生、开花时间调控和光信号传导（Laubinger等人，2006年）。例如，BBX18、BBX19、BBX21、BBX22、BBX24和BBX32已被确定为非生物胁迫响应的介导因子（Nagaoka和Takano，2003年；Wang等人，2013年；Imtiaz等人，2015年；Liu等人，2019年；Wu等人，2023年）。其中，AtBBX18作为光形态发生和耐热性的负调控因子，可抑制热响应基因如DGD1、Hsp70、Hsp101和APX2的表达，从而降低热胁迫下的萌发率和幼苗存活率（Wang等人，2013年）。BBX19和BBX21还调节耐旱性（Chen等人，2022a年；Gómez-Ocampo等人，2021年）。AtBBX24/STO（耐盐蛋白）通过与CLONE EIGHTY-ONE/RADICAL-INDUCED CELL DEATH1（CEO/RCD1）相互作用来促进高盐度下的根系生长，从而调节相关基因的表达（Nagaoka等人，2003年；Fujibe等人，2004年）。过表达AtBBX24可显著提高拟南芥的耐盐性和根系生长（Chiriotto等人，2023年）。在菊花中，CmBBX24提高了耐寒性和耐旱性，而其敲减则降低了耐寒性和耐旱性，这与碳水化合物代谢相关基因的表达下调有关（Yang等人，2014a年；Liu等人，2022年）。在水稻中，30个OsBBX基因中有29个含有与胁迫相关的顺式元件（如ARE、W-box、HSE和MBS），表明它们在胁迫响应中起广泛作用（Huang等人，2012年）。具体而言，OsBBX1、OsBBX2、OsBBX8、OsBBX19和OsBBX24的表达在干旱、寒冷和盐胁迫下显著增强（Huang等人，2012年）。此外，许多BBX蛋白参与激素信号通路。例如，BBX2、BBX3、BBX11、BBX13、BBX16、BBX18、BBX19、BBX21和BBX22与脱落酸（ABA）信号传导相关；BBX18、BBX24和BBX30参与赤霉素（GA）通路；BBX27参与生长素（IAA）信号传导；BBX16和BBX21在生长素信号转导中起作用（Crocco等人，2011年；Crocco等人，2015年；Yang等人，2014年；Zhang等人，2014年）。在光形态发生中，多个BBX蛋白参与复杂的调控网络：BBX20、BBX21、BBX22和BBX23作为正向调控因子，而BBX24和BBX25作为负调控因子（Datta等人，2006年；Datta等人，2007年；Datta等人，2008年；Holtan等人，2011年；Fan等人，2012年；Gangappa等人，2013年）。此外，还有一些BBX成员对开花时间的调控具有相反的作用，包括BBX4、BBX5、BBX7、BBX13、BBX19、BBX24、BBX27、BBX31和BBX32（Cheng和Wang，2005年；Hassidim等人，2009年；Lee等人，2010年；Cao等人，2014年；Wang等人，2014年；Yang等人，2014b年；Wang和Dehesh，2015年；Tripathi等人，2017年；Wu等人，2018年）。另一个成员BBX25（也称为STH，耐盐同源物）在拟南芥中作为光形态发生和光介导发育的负调控因子（Gangappa等人，2013年）。BBX25含有两个位于氨基酸位点5–42和57–94的B-box结构域，其蛋白质积累受光调控，其降解由COP1 E3泛素连接酶介导（Gangappa等人，2013年；Shin等人，2016年）。在幼苗阶段，BBX24和BBX25形成一个异二聚体，干扰转录因子elongated hypocotyl 5（HY5）的活性，从而通过下调AtBBX22/LZF1（该过程的正向调控因子）来抑制光形态发生（Holm等人，2001年；Gangappa等人，2013年）。此外，BBX25与COP1协作，在避荫条件下促进下胚轴伸长，而bbx25的功能丧失突变体表现出较短的下胚轴表型（Weller等人，2009年；Gangappa等人，2013年）。
B. juncea是中国主要的经济蔬菜作物，但早期抽薹会严重降低其产量和品质（Liu等人，2005年）。尽管BBX基因家族在拟南芥等模式植物中已被广泛研究并得到很好表征，但其在B. juncea中的作用知之甚少（Datta等人，2007年；Datta等人，2008年；Gangappa等人，2013年；Liu等人，2019年；Wang等人，2015年）。鉴于对B. juncea中BBX基因的了解有限，我们首先进行了全基因组鉴定和表达分析。初步的RNA-seq数据分析显示，在镉（Cd）胁迫下，几个BjuBBX基因，尤其是BjuBBX25b，在根部显著上调。这种特定的表达模式，结合先前关于BBX家族成员与多种非生物胁迫响应相关的报道（Wang等人，2013年；Liu等人，2019年），促使我们进一步研究BjuBBX25b在重金属耐受中的作用。因此，在本研究中，我们对十字花科物种中的BBX基因进行了系统而全面的鉴定和表征，特别关注了对Cd胁迫有反应的BjuBBX25b。我们在拟南芥中进行了异源过表达实验，并通过qRT-PCR检测到BjuBBX25b转基因株系中生长素信号基因、发育调控因子和镉响应转运蛋白的表达显著下调。随后的Y2H和BiFC实验确认了BjuBBX25b的蛋白质相互作用网络。qRT-PCR分析表明，BjuBBX25b和BjuPRMT1.1在花蕾中表达下调；然而，其六个相互作用蛋白在早期生殖阶段（角果形成期）表达上调。GFP定位显示，这六个相互作用蛋白主要位于细胞质中，而BjuBBX25b位于细胞核中。

### B. juncea中BBX基因的鉴定和表征分析
为了鉴定和表征B. juncea中的BBX基因家族，我们从Brassicaceae数据库（BRAD；http://brassicadb.cn/；Chen等人，2022b）获取了B. juncea的参考基因组（版本2.0）及其相应的基因和蛋白质序列及功能注释文件。随后从Pfam数据库下载了BBX保守结构域（PF00643）的隐马尔可夫模型（HMM）模型。利用该模型对B. juncea蛋白质组进行了BBX家族成员的筛选。

### B. juncea中BBX基因的全基因组鉴定
在B. juncea中鉴定出71个BjuBBX基因，根据它们与拟南芥的 closest orthologs 命名为BjuBBX1a至BjuBBX32b。BjuBBX蛋白的长度、分子量（MW）和等电点（PI）分别为69至446个氨基酸、7831.92–49701.11 Da和4.18–9.05（表S2）。亚细胞定位分析显示，80%的BjuBBX蛋白位于细胞核中。

### B. juncea中BjuBBX基因的分子表征和进化
B. juncea是一种重要的经济叶菜类蔬菜，但其生产受到早期抽薹的严重威胁，这会对产量和品质产生不利影响。植物的开花时间（或抽薹时间）受复杂的调控途径控制，这对完全理解开花调控机制构成了挑战（Sheldon等人，2000年）。此外，作为异源四倍体物种，B. juncea的开花调控更为复杂。

### 结论
总共鉴定出71个BjuBBX基因，并将其分为五个亚家族，这些基因分布在不同的染色体上，存在片段重复的证据。BjuBBX25b的异位过表达导致了表型变化，包括莲座叶数量减少和角果缩短。qRT-PCR显示，BjuBBX25b的过表达显著下调了与生长素生物合成、运输、发育调控和镉响应相关的基因表达。

### 作者贡献声明
吴成润：数据可视化、验证、正式分析。
王青：正式分析、数据管理。
姜高：撰写初稿、软件使用、正式分析、数据管理。
任可然：验证、资源获取、研究。
徐远曼：数据可视化、验证、方法学研究。
曾静：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金获取。
黄宝文：项目监督、研究、资金获取、概念构思。
黄代宇：验证。

### 资金支持
本研究得到了重庆市自然科学基金（CSTB2025NSCQ-GPX0023、CSTB2024N SCQ-MSX0181）、重庆市科委科技研究计划（KJQN202401413）和重庆大学创新研究组资助计划（CXQT21029）的支持。

### 利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。写作过程中使用了AI辅助技术（deepseek）。