低磷酸盐短期处理对水稻叶片延缓衰老的分子机制

《Plant Science》：Molecular basis of delayed leaf senescence induced by short-term treatment with low phosphate in rice

　　赫克托·马丁-卡多索（Héctor Martín-Cardoso）、米雷亚·邦多（Mireia Bundó）、安东尼·加西亚-莫利纳（Antoni Garcia-Molina）、布兰卡·桑·塞贡多（Blanca San Segundo）
农业基因组学研究中心（Centre for Research in Agricultural Genomics, CRAG）
西班牙巴塞罗那自治大学（Universitat Autónoma de Barcelona, UAB）- IRTA-CSIC-UB
地址：C/ de la Vall Moronta, CRAG Building, Bellaterra, Barcelona, 08193

**摘要**
叶片衰老是植物发育过程中的一种程序性现象，也可受到环境因素（如养分可用性）的调控。尽管磷是决定植物生长的必需元素，但植物适应磷可用性的机制尚未明确。本研究结合了生理学、生物化学和分子生物学方法，探讨了磷酸盐供应对水稻叶片衰老的影响。结果表明，短期低浓度磷酸盐处理可增加水稻幼苗中的光合色素含量，增强其对甲基紫素诱导的氧化应激的耐受性，并提高抗氧化酶活性。低磷酸盐处理的植株叶片中的膜脂质过氧化和电解质渗漏现象也有所减轻。在高浓度磷酸盐处理下，叶片衰老进程加速。进一步的研究表明，CRISPR/Cas9技术介导的MIR827基因编辑可延缓叶片衰老，而MIR827和MIR399基因过度表达则会促进叶片衰老。因此，miR399和miR827可能在调节水稻叶片衰老中起关键作用，其机制可能与细胞内磷平衡的调节有关。对低磷酸盐处理植株的转录组分析显示，多个生物过程（包括光合色素合成和衰老相关过程以及多种代谢过程）均受到协同调控。这些发现支持了水稻在低磷酸盐条件下叶片衰老延迟的现象，并揭示了调控叶片衰老的复杂网络。阐明水稻营养生长期适应低磷酸盐供应的机制有助于优化农田中的磷肥施用策略。

**1. 引言**
成年植物的叶片衰老是一种由基因调控的现象，主要与植物老化过程相关。在衰老过程中，叶片在生理、生物化学和分子层面发生协调变化，以确保植物的存活和繁殖成功（Mayta等，2019）。叶片衰老也可由干旱、盐碱、强光或高温等环境胁迫引发（Tan等，2023）。叶片衰老的时机需要严格控制，以避免过早衰老，同时仅在不利条件下激活这一过程。在农业上，延迟衰老（保持叶片绿色）能延长植物的光合作用能力和碳固定能力，从而提高作物产量（Lee和Masclaux-Daubresse，2021）。发育程序性衰老与环境因素反应之间的精细调控对于提高植物存活概率至关重要。延迟衰老可延长叶片的功能寿命，进而增加光合作用、生物量和抗逆性。衰老叶片中最显著的现象是叶绿素分解导致的黄化。相反，过早的叶片衰老会加速叶绿素分解，从而降低生物量产生。叶片在自然衰老或环境胁迫下也会产生更多的活性氧（ROS）（Moustakas等，2023）。由于叶绿体是植物细胞中ROS的主要产生部位，因此防止ROS过量产生并维持叶绿体内的氧化还原平衡对叶片正常衰老至关重要。叶绿体内过多的ROS会直接损伤大分子（如脂质、DNA和蛋白质），并破坏光合系统（Hasanuzzaman等，2020）。为避免ROS引起的氧化损伤，植物具有清除ROS和抗氧化系统，以维持叶绿体内的ROS平衡。类胡萝卜素也参与叶绿体内的ROS清除。

在分子层面上，叶片衰老与一系列被称为“衰老相关基因”（Senescence-Associated Genes, SAGs）的表达变化相关，这些基因具有多种功能，涉及光合作用、氧化应激、转录调控、养分再利用及大分子降解（Woo等，2019；Lee和Masclaux-Daubresse，2021）。SAG基因可能作为叶片衰老相关过程的正调控因子或负调控因子。虽然我们对衰老相关过程的大部分认识来自拟南芥（Arabidopsis thaliana）的研究，但近年来，由于作物品种的农艺重要性，对其叶片衰老的研究也受到了广泛关注（Woo等，2019）。除了老化外，养分可用性也会影响衰老的程度和时机。通常认为，高养分可用性可延缓叶片衰老以促进生长，而低养分可用性（尤其是氮）可能引发早期衰老，以便从老组织中回收养分以支持生长（Zhang等，2024b）。参与植物对养分利用响应的分子机制可能也参与衰老相关途径，但目前对此研究较少。此外，养分失衡已成为降低植物光合作用效率和繁殖成功率的关键胁迫因素（Lu等，2025）。不同养分元素调节的光合作用机制因它们的独特功能而异（Lu等，2025）。

磷（P）是植物生长的重要养分，植物通常以无机磷酸盐（Pi）的形式从土壤中吸收。尽管环境中磷含量丰富，但由于有机化合物的络合作用和与金属阳离子的沉淀作用，其生物有效性有限（George等，2016）。为克服磷限制，植物发展出适应性机制来增强对土壤中磷的吸收，例如激活所谓的“磷饥饿反应”（Phosphate Starvation Response, PSR）（Puga等，2024；Yang等，2024；Chiang等，2025）。两种微小RNA（miRNAs），miR399和miR827，在PSR中起核心调节作用，控制植物中的磷平衡（Chiou等，2006；Lin等，2013；Puga等，2024；Yang等，2024）。在磷缺乏时，miR399和miR827表达上调，下调相应靶基因表达并增加磷的吸收（Puga等，2024；Yang等，2024）。miR399靶向PHOSPHATE2基因，该基因编码一种泛素结合E2酶，负责磷转运蛋白的泛素化和蛋白酶体降解（Aung等，2006；Chiou等，2006；Liu等，2012）。miR399/PHO2调控模块在多种植物中发挥作用，调控磷平衡（如拟南芥、水稻、番茄、菜豆和葡萄）。与大多数保守靶标的古老miRNAs不同，miR827在进化过程中发生了靶标转换（Lin等，2018）。在拟南芥（和十字花科植物）中，miR827靶向NLA基因，该基因编码一种E3泛素连接酶，参与质膜定位的磷转运蛋白PHT1的泛素化和降解（Lin等，2013）。然而在水稻中，miR827靶向OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2基因，这两种基因编码液泡中的磷转运蛋白（Lin等，2010）。尽管靶标发生变化，miR827调节细胞内磷平衡的功能在物种间保持一致。在水稻中，miR399和miR827的过表达会导致磷积累，而CRISPR/Cas9介导的miR827突变会降低磷含量（Campos-Soriano等，2020；Bundó等，2024）。作为必需养分，细胞内磷水平的改变可能影响植物的生理和分子过程。然而，磷营养不足对水稻叶片衰老相关过程的具体影响仍需进一步研究。

本研究探讨了短期磷处理对水稻早期营养生长阶段叶片衰老的影响，分析了不同磷条件下水稻幼苗的生理、生物化学和分子变化，包括光合色素含量、膜脂质过氧化和电解质渗漏、对甲基紫素诱导的氧化应激的响应、抗氧化酶活性以及转录组变化。通过短期处理来观察植物对磷供应的适应性反应，同时避免对植物生理状态的不可逆影响。结果表明，低浓度磷处理可能延缓叶片衰老，而高浓度磷处理则可能加速叶片衰老。CRISPR-Cas9编辑抑制miR827表达并降低磷积累可延缓叶片衰老；相反，miR399和miR827的过表达会促进叶片衰老。这些发现表明miR827和miR399在调节水稻叶片衰老中起关键作用，可能通过调控细胞内磷水平实现。这些发现表明，在水稻生长早期施加低浓度磷处理可以调节叶片衰老的过程。本研究阐明了低磷条件下叶片衰老延迟的分子机制和生物学过程，有助于培育能够在磷限制条件下良好生长的新品种，减少对磷肥的依赖。

**2. 材料与方法**
2.1. 植物材料、生长条件和磷含量测定
水稻（Oryza sativa， japonica cv Nipponbare）在28℃/25℃、14小时光照/10小时黑暗的条件下生长。本研究还使用了Tainung 67（TN67）品种。miR827过表达植株和CRISPR/Cas9突变体植株（Nipponbare背景）以及miR399过表达植株（TN67背景）的培育和表征方法已在前文中有描述（Campos-Soriano等，2020；Bundó等，2024）。

磷处理时，植物在50%陶粒和50%石英砂的混合介质中生长。为了保证所有植物的均匀生长，种子先在水中预发芽7天，然后移栽到土壤中，并施用含目标磷浓度的Hoagland半浓度溶液（分别为0.025 mM（低磷条件）、1.0 mM（对照条件）和2.5 mM（高磷条件）。最终磷浓度通过KH2PO4进行调整。植物在控制条件下培养14天、21天和28天。

水稻叶片的磷含量测定方法如前文所述（Ames，1966；Versaw和Harrison，2002）。共进行了三次独立实验来测定磷含量，每次实验至少包含4个生物学重复和每个生物学重复的3个技术重复。

2.2. 暗诱导叶片衰老实验
在土壤培养的水稻幼苗上进行了暗诱导叶片衰老（Dark-Induced Leaf Senescence, DILS）研究。幼苗按照上述方法培育（预发芽1周后进行2周的磷处理），然后分别在黑暗条件下或光照条件下继续生长1周。在此期间，幼苗继续接受相应的磷浓度处理。

还对分离的叶片（整片叶片或2-3厘米长的叶片片段）进行了DILS实验。研究的是第1位（最年轻的完全展开叶片）和第2位的叶片。整片叶片或叶片片段浸泡在灭菌蒸馏水中（分别为100 mL和25 mL），然后置于28℃的黑暗环境中，观察衰老进程。使用APS Assess 2.0程序 quantify叶片衰老面积的百分比。对于每片叶片，颜色范围为72至125像素（红色至绿色），衰老面积的范围为72至101像素（红色至橙色/黄色）。每次实验包含20个生物学重复和每个基因型的3个技术重复。

2.3. 光合色素含量测定
叶绿素和类胡萝卜素的含量测定方法如前文所述（Barja等，2021），随后使用Agilent 12000系列HPLC系统进行高效液相色谱（HPLC）分析。叶绿素和类胡萝卜素的洗脱通过光电二极管阵列检测器监测。叶绿素（650 nm）和类胡萝卜素（叶黄素、β-胡萝卜素、9-顺-β-胡萝卜素、 violaxanthin和neoxanthin）的峰值通过Agilent ChemStation软件确定。定量结果与商业标准品进行比较（Sigma）。共进行了三次独立实验，每次实验包含4个生物学重复（每个条件4株植物）。

叶绿素和总类胡萝卜素的含量也通过分光光度法测定（Lichtenthaler和Buschmann，2001）。叶片材料（30 mg）用96%乙醇（v/v）在50℃下提取2小时，离心1分钟以去除细胞碎片。通过测量上清液在649 nm和664 nm处的吸光度来确定光合色素含量（用于叶绿素），在470 nm处测定类胡萝卜素含量（Spectramax M3读数器，Molecular Devices，USA），结果以mg/g鲜重（FW）表示（Lichtenthaler和Buschmann，2001）。进行了三次独立的实验，每次实验每种条件都有四个或五个生物重复（每个重复包含3或4株植物），并且每个生物重复还有三个技术重复。2.4. 电解质泄漏和脂质过氧化测定 电解质泄漏（EL）的分析按照之前的描述进行（Campo等人，2014年）。简而言之，将叶片片段（2-3厘米长）在高压灭菌的Milli-Q水中清洗，并在摇床中用高压灭菌的Milli-Q水培养2小时。接下来测量电导率（EC1）。然后将叶片片段高压灭菌20分钟，再次测量电导率（EC2）。电解质泄漏率计算为（EC1/EC2）× 100。电导率使用电导率计（Mettler-Toledo，FiveGo3系列，Greiefensee，瑞士）进行测量。脂质过氧化的程度通过使用硫代巴比妥酸试剂测量产生的MDA量来确定（Martín-Cardoso等人，2024年）。使用Spectramax M3读数器（Molecular Devices，美国）在532纳米和600纳米处测量吸光度。进行了三次独立的实验，每种条件都有四个生物重复（每个重复包含6株植物），并且每个生物重复还有三个技术重复。2.5. 甲基紫罗兰素处理 甲基紫罗兰素的测定按照之前的描述进行（Salvador-Guirao等人，2019年）。将叶片片段（2-3厘米长）在黑暗中用甲基紫罗兰素溶液（10 μM）处理12小时，然后在28oC下维持3天，光照周期为16小时/8小时。叶绿素和类胡萝卜素按照上述方法提取并通过分光光度法进行定量。使用Leica DM6显微镜在明场照明下拍摄图片。进行了三次独立的实验，每次实验每种条件都有三个生物重复（每个重复包含4株植物），并且每个生物重复还有三个技术重复。2.6. 酶活性 对于抗氧化酶活性的分析，按照Zhang等人（2016年）的描述提取了粗酶溶液。简而言之，将水稻叶片（0.3克）用液氮研磨成粉末，然后在含有0.2 μM EDTA的3毫升冷50 mM PBS（pH 7.8）中匀浆。匀浆液在4oC下以15,000 g离心20分钟，上清液用于酶活性分析。蛋白质浓度使用Bradford试剂盒（Bradford，1976年）测定。APX活性通过测量290纳米处3分钟内的吸光度下降来确定（Nakano和Asada，1981年）。反应测定混合物（1毫升）包含50 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）、0.5 mM抗坏血酸、0.1 mM H2O2、0.1 mM EDTA和15 μL植物提取物。CAT活性通过测量240纳米处5分钟内的吸光度下降来确定（Poli等人，2018年）。反应测定混合物（1.5毫升）包含0.75毫升100 mM磷酸钾缓冲液（pH 7.0）、0.25毫升30 mM H2O2、25 μL植物提取物和0.475毫升蒸馏水。POD活性通过测量470纳米处5分钟内的吸光度增加来确定（Poli等人，2018年）。酶活性测定的吸光度使用Spectramax M3读数器（Molecular Devices，美国）进行。进行了三次独立的实验。每种条件从6株不同的植物中各取出五个生物重复，每个生物重复还有三个技术重复。2.7. 转录组分析 从用不同磷供应（例如，低磷和对照磷）处理了14天的3周龄水稻叶片中提取总RNA，使用Maxwell RSC Plant RNA Kit（Promega）。每种磷条件检查了三个生物重复，每个生物重复包含来自五株单独植物的叶片（最年轻的完全展开的叶片）。使用Agilent 2100 Bioanalyzer（Agilent Technologies，Inc.）评估RNA的质量和完整性，只使用了RNA完整性数（RIN）≥ 7的样本。根据制造商的说明使用Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Library Prep Kit for Illumina（Yeasen，美国）制备RNA文库，并使用Illumina NovaSeq 6000（Illumina，美国）进行测序。RNASeq数据集使用fastp（v0.21）（Chen等人，2018年）进行修剪，允许最小读取长度为35 bp和最小序列质量为25。使用STAR（v2.7.9）和Oryza sativa cv Nipponbare参考基因组（IRGSP-1.0）进行读段对齐。使用featureCounts（v1.6.0）获取读段计数。计数结果过滤掉在至少3个样本中表达量低于40的转录本。基于绝对log2 FC ≥ 0.5（调整后的P ≤ 0.01，Wald检验）声明DEGs。使用GO webtool（调整后的P ≤ 0.05；Fisher精确检验）（https://www.geneontology.org）进行GO富集分析，并使用ReviGO（https://www.revigo.irb.hr/）选择和绘制非冗余术语。使用ShinyGO v0.85.1（https://bioinformatics.sdstate.edu/go/）进行京都基因组和基因组百科全书（KEGG）通路富集分析（调整后的P ≤ 0.01；Fisher精确检验）。为了识别替代转录本变体，使用Integrative Genomics Viewer（IGV v2.19.7）将映射的RNASeq读段可视化为水稻参考基因组（IRGSP-1.0；https://rapdb.dna.affrc.go.jp）。2.8. 通过RT-qPCR进行表达分析 使用Maxwell RSC Plant RNA Kit（Promega）提取总RNA。总RNA（1 μg）使用High Capacity cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems，Waltham，MA，美国）进行逆转录。使用Primer-BLAST工具（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）设计PCR引物。RT-qPCR在LightCycler 480（Roche，Basel，瑞士）中的光学96孔板上进行，使用SYBR? green进行反应。使用ubiquitin1基因（OsUbi1，Os06g0681400）来标准化转录本水平。使用2-ΔΔCt方法计算相对表达水平。每个条件从四株不同的植物中取出四个生物重复，每个生物重复还有三个技术重复进行分析。用于RT-qPCR的引物和分析的基因列在表S1中。从Leaf Senescence Database 5.0（LSD，https://ngdc.cncb.ac.cn/lsd/）（Zhao等人，2024年）中选择了与衰老相关的基因（SAGs）。2.9. 统计分析 在整篇手稿中，使用单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）分析了磷含量、叶片衰老面积、叶绿素和类胡萝卜素定量、丙二醛含量、电解质泄漏、酶活性以及通过RT-qPCR检测的基因表达。对于甲基紫罗兰素处理下的叶绿素和类胡萝卜素含量分析，使用了双因素方差分析（TWO-WAY ANOVA）。单因素和双因素方差分析后进行了Tukey的多重比较检验（调整后的P ≤ 0.05）。数据使用GraphPad Prism v10.4.1软件（https://www.graphpad.com/）进行分析。3. 结果 3.1. 磷处理干扰水稻植物的光合色素含量和叶片衰老 为了研究对磷处理的适应性反应，水稻幼苗接受了不同浓度的磷处理，例如0.025 mM磷（以下简称低磷植物）、1.0 mM磷（对照磷植物）和2.5 mM磷（高磷植物），处理时间为2周、3周或4周（图S1A）。在处理2周后，水稻幼苗叶片中的磷含量逐渐增加（图S1B），表明水稻植物能够感知并响应磷处理。最重要的是，在处理两周后，不同条件下的水稻幼苗生长没有显著差异（图S1C）。通过延长磷处理时间（3周和4周），幼苗叶片中的磷继续积累（图S2A和B）。然而，在3周或更长时间的磷处理后，低磷和高磷植物的生长显著减缓（图S2A和B的右侧面板）。此外，高磷处理下的植物出现了叶片尖端坏死，这是水稻磷毒性的典型症状（图S2C）。为了避免生长抑制或磷细胞毒性引起的混淆效应，采用了短期处理（例如2周的磷处理）来研究水稻幼苗对磷的适应性反应。如前所述，光合色素（叶绿素和类胡萝卜素）在叶片衰老过程中会降解，导致叶片变黄（Mayta等人，2019年）。值得注意的是，HPLC分析显示，随着磷供应的增加，水稻幼苗叶片中的叶绿素a（Chl a）和叶绿素b（Chl b）浓度逐渐降低（图1A）。低磷和高磷植物的叶绿素a值分别为0.174至0.140 μg/mg干重，而叶绿素b值分别为0.062至0.048 μg/mg干重（图1A）。尽管磷处理对叶绿素含量的变化在统计上显著且逐渐减少，但不同条件之间的差异幅度不大（例如，高磷植物的叶绿素a含量为低磷植物的80.46%，叶绿素b含量为77.42%）。如前所述，本研究采用了短期的低磷处理，以防止磷处理对植物生理的负面影响，如生长减缓或严重缺磷。这也解释了在不同磷条件下的光合色素含量变化相对较小。这使得植物能够在低磷条件下适应，并在暴露于这种条件后恢复并继续高效生长。对类胡萝卜素含量的测量也显示，随着磷供应的增加，类胡萝卜素（β-胡萝卜素、9-顺-β-胡萝卜素）和黄酮类（叶黄素、新生黄质和 Violaxanthin）的含量逐渐减少（图1B）。低磷处理对光合色素和类胡萝卜素含量的积极影响表明，低磷处理的水稻幼苗可能会延迟衰老。下载：下载高分辨率图像（579KB）下载：下载全尺寸图像 图1. 磷处理对水稻叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量的影响。从在不同磷供应条件下生长了2周的幼苗中制备叶片提取物（低磷、对照和高磷幼苗）。叶绿素和类胡萝卜素含量通过HPLC测定（A和B）。结果显示的是最年轻的完全发育的叶片（叶片1；叶片2中也得到了相同的结果）。(A) 叶绿素含量（叶绿素a，Chl a；叶绿素b，Chl b）。(B) 总类胡萝卜素含量，β-胡萝卜素、9-顺-β-胡萝卜素、叶黄素、Violaxanthin和新生黄质。结果以μg/mg干重表示。(C) 与衰老相关的基因（SAGs）的表达：OsNAC6、OsNAP、OsSGR、Osl2、Osl55、Osl57、OsABC1-2和OsSAG12-2。进行了三次独立的实验，得到了相同的结果。条形图代表4个生物重复的平均值± SEM，每个生物重复来自4株不同的植物。通过单因素方差分析（ONE-WAY ANOVA）确定了统计上的显著差异（不同的字母表示不同磷条件之间的显著差异）。由于已知短期低磷或高磷处理可以分别对抗性地延缓或加速叶片衰老，因此我们研究了磷处理是否会影响SAGs的表达。在这方面，SAGs在叶片衰老中起着关键作用，其中一些直接参与叶绿素的降解（Guo等人，2021年）。因此，我们监测了已知在衰老过程中表达上调的基因的表达，例如OsNAC6、OsNAP、OsSGR、Osl2、Osl55、Osl57（Lee等人，2001年，Park等人，2007年，Liang等人，2014年，Wairich等人，2023年）。其中，OsSGR（编码一种在叶片衰老过程中参与叶绿素降解的酶）是发育性叶片衰老的标志物（Park等人，2007年）。与上述衰老表型一致，所有这些SAGs在低磷植物中的表达都较弱，其表达随着磷供应的增加而逐渐增强（图1C）。相反，OsABC1（编码一种在衰老过程中帮助维持叶绿体功能的激酶）（Gao等人，2012年）和OsSAG12（一种抑制细胞死亡的因子，其表达在自然叶片老化过程中被诱导）（Singh等人，2016年）在低磷植物中的表达比对照和高磷植物中的表达更高（图1C）。除了OsSGR，其他参与叶绿素降解的基因（也常称为SAGs）在低磷植物中的表达也较弱，例如OsNYC1、OsNOL、OsHCAR、OsNYC3、OsPAO和OsRCCR1（图S3A）。对于参与叶绿素生物合成的基因，如OsGUN5、OsCRD1、OsPORA和OsPORB，它们的表达在低磷植物中比对照和高磷植物中的表达更高（图S3B）。与观察到的随着磷供应增加类胡萝卜素水平下降的趋势一致，MEP（甲基赤藓糖醇磷酸）和类胡萝卜素生物合成途径中的关键基因的转录水平从低磷条件逐渐降低到高磷条件（图S4）。这些基因包括：OsDX3（编码催化MEP途径初始步骤的酶，该途径产生类胡萝卜素的前体），OsPSYI（决定植物组织中积累的类胡萝卜素总量的关键酶），OsPDS，OsLCYe（参与类胡萝卜素生物合成途径的基因），以及OsCYP97A4和OsHYD1（参与叶黄素生物合成途径的基因）（见图S4）。为了进一步研究磷（Pi）处理对叶片衰老的影响，采用了黑暗诱导的叶片衰老（DILS）方法。众所周知，黑暗处理会促进叶绿素的降解和叶片衰老（Sobieszczuk-Nowicka等人，2018年）。最初，整个植株都在不同磷含量条件下生长了2周，然后继续在持续黑暗环境中生长1周。对照组植株在整个实验期间都处于正常光照条件下。结果显示，来自低磷（Low-Pi）处理幼苗的叶片在经历黑暗处理后比对照组和高磷（High-Pi）处理幼苗的叶片更少出现黄化现象（见图2A）。随着磷含量的增加，叶片中的叶绿素和类胡萝卜素含量呈下降趋势（见图2B和C）。

通过分析供应不同浓度磷的水稻幼苗的黑暗诱导叶片衰老（DILS）实验，发现磷含量对叶片衰老有显著影响。整个叶片从低磷、对照组和高磷处理的植株上摘下并置于黑暗环境中。（A）图显示了在黑暗中保存9天后的叶片代表性图像；右侧面板使用APS Assess 2.0软件通过图像分析量化了9天后的衰老区域，衰老程度以叶片面积中显示衰老部分的百分比表示，箱线图表示中位数和数据分布（每个处理组20片叶片）。（B）叶绿素含量（叶绿素a，Chl a；叶绿素b，Chl b）。（C）总类胡萝卜素含量。叶绿素和类胡萝卜素含量通过分光光度法测定，并以新鲜重量每克毫克（mg/g）表示。数据对应于第一片叶片的结果，第二片叶片也得到了类似的结果。B和C中的条形图代表5次生物重复实验的平均值±标准误（SEM），每次实验来自3株不同植株的叶片。通过双因素方差分析（ANOVA）确定统计显著差异（不同字母表示不同磷处理组之间的显著差异）。

为了观察叶片黄化模式随时间的变化，在从低磷处理的稻苗上摘下的整片叶片上进行DILS实验。在稻苗中，叶片衰老通常从叶片尖端（由最老的细胞组成）向叶片基部（最年轻的细胞）逐渐进行（Gregersen等人，2008年）。在黑暗处理9天后，低磷处理幼苗的叶片仅在尖端出现黄化，而叶片中部和基部仍保持绿色（见图S5A）。随着磷含量的增加，叶片的整个部分都会出现严重黄化（见图S5A）。彩色图像分析证实低磷处理稻苗的叶片衰老延迟（25% vs 50-75%的叶片面积黄化）。与整片叶片的DILS实验结果一致，从低磷处理的叶片上切下的叶片切片中也观察到叶片黄化进程较慢。与对照组和高磷处理叶片相比，低磷处理叶片保持绿色的时间更长（见图S5B）。因此，在黑暗处理下，叶片中的叶绿素含量也随时间逐渐减少，且磷含量越高，这种减少越明显（见图S5C）。总体而言，这些分析证实了稻苗叶片中的磷含量调节叶片衰老过程：低磷处理会延缓叶片衰老，而高磷处理则会加速这一过程。

3.2. 短期低磷处理可以减少膜脂质过氧化和电解质泄露，并提高稻苗叶片的抗氧化能力

由于我们的研究将磷处理与叶片衰老状态联系起来，我们进一步探讨了磷处理对衰老相关过程的影响，特别是与活性氧（ROS）产生相关的过程。在正常生长条件下，光合作用过程中产生的ROS通过抗氧化系统得到控制，以防止氧化应激造成的损害。ROS的过量生成会打破ROS产生与清除之间的平衡，可能导致膜脂质过氧化，最终影响膜的完整性和功能。为了研究磷处理对稻苗叶片膜脂质过氧化的影响，我们测量了丙二醛（MDA）衍生物的浓度作为膜脂质过氧化的指标。此外，还测量了电解质泄露情况以评估叶片的通透性。与对照组相比，短期低磷处理的稻苗叶片中MDA含量显著降低，其电解质泄露值也低于对照组（见图3A）。相反，高磷处理稻苗的MDA浓度和电解质泄露值高于对照组（见图3A）。数据表明，短期低磷处理提高了稻苗叶片的膜稳定性。

3.3. 转录组分析揭示了低磷处理稻苗叶片中核心生物过程的重组

为了全面了解稻苗对低磷处理的适应机制，我们对低磷处理和对照组稻苗的叶片进行了RNASeq分析（见表S2）。主成分分析（PCA）清楚地分离了各磷处理下的转录组响应（93%的方差集中在PC1上）（见图S6A）。基于绝对对数变化倍数（FC）≥0.5且调整后的P值≤0.01（Wald检验），确定了低磷处理叶片中的差异表达基因（DEGs）。进一步的功能聚类分析表明，低磷处理和对照组叶片之间的转录组差异涉及具有不同稳态的转录本（见图S6B）。上调和下调的DEGs数量相近，分别为2908个和2945个。完整的DEGs列表见表S3。为了功能分析这些基因的相关性，我们使用REVIGO软件（Supek等人，2011年）对非冗余基因本体（GO）术语进行了富集分析。富集的GO术语主要与“代谢过程”相关，无论是上调还是下调基因（见图4；表S4）。具体来说，上调基因中排名前十的GO术语主要与“光合作用和光能吸收”、“前体代谢物及能量生成”以及“碳水化合物生物合成过程”相关（见图4A；表S4）。下调基因中则涉及“硫酸脂生物合成过程”、“对刺激的反应”（例如“细胞对磷酸盐饥饿的反应”、“细胞解毒”、“对非生物刺激的反应”以及“离子运输”（例如“磷酸盐离子运输”）等术语（见图4A；表S4）。相比之下，下调基因中的“代谢过程”相关术语主要与“RNA代谢过程”相关（例如“转录”、“RNA加工”、“翻译”等）（见图4B；表S4）。

由于发现磷处理改变了膜脂质过氧化，我们进一步评估了低磷处理植株叶片对甲基紫精（MV）诱导的氧化应激的耐受性。已知MV（或百草枯）暴露会引发叶绿体中的ROS生成（Scarpeci等人，2008年）。与对照组相比，低磷处理植株的叶片对MV诱导的叶绿素漂白现象较轻，而高磷处理植株的叶片对MV诱导的氧化应激更为敏感（见图3B）。与视觉观察结果一致，低磷处理植株的叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量显著高于对照组和高磷处理植株（见图3C）。如果光合作用过程中产生的ROS分子H2O2未能得到充分清除，其积累会导致羟基自由基的产生，进一步加剧氧化应激。抗坏血酸过氧化物酶（APX）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）负责清除H2O2。有趣的是，低磷处理植株叶片中这些酶的活性显著高于对照组和高磷处理植株（见图3D）。低磷处理植株叶片对MV诱导的氧化应激具有更高的耐受性，这可能是因为抗氧化酶活性更高（如APX、CAT和POD），这些酶有助于抑制叶绿体中H2O2的积累。因此，短期低磷处理似乎对稻苗叶片具有保护作用，能够抵御氧化应激。

3.4. 转录组分析揭示了低磷处理稻苗叶片中核心生物过程的重组

为了全面了解稻苗对低磷处理的适应性反应的分子机制，我们对低磷处理和对照组稻苗的叶片进行了RNASeq分析（表S2）。主成分分析（PCA）清楚地分离了不同磷处理下的转录组响应（93%的方差集中在PC1上）。基于绝对对数变化倍数（FC）≥0.5且调整后的P值≤0.01（Wald检验），确定了低磷处理叶片中的差异表达基因（DEGs）。进一步的功能聚类分析表明，低磷处理和对照组叶片之间的转录组差异涉及具有不同稳态的转录本（见图S6B）。上调和下调的DEGs数量相近，分别为2908个和2945个。完整的DEGs列表见表S3。为了功能分析这些基因的相关性，我们对非冗余的基因本体（GO）术语进行了富集分析，并使用REVIGO软件进行了可视化（Supek等人，2011年）。GO术语主要与“代谢过程”相关，无论是上调还是下调基因（见图4；表S4）。具体来说，上调基因中排名前十的GO术语与“光合作用和光能吸收”、“前体代谢物及能量生成”以及“碳水化合物生物合成过程”相关（见图4A；表S4）。下调基因中则涉及“硫酸脂生物合成过程”、“对刺激的反应”（例如“细胞对磷酸盐饥饿的反应”、“细胞解毒”、“对非生物刺激的反应”以及“离子运输”（例如“磷酸盐离子运输”）等相关术语（见图4A；表S4）。与下调基因相关的“代谢过程”术语主要与“RNA代谢过程”相关（例如“转录”、“RNA加工”、“翻译”等）（见图4B；表S4）。

综上所述，首次功能分析表明低磷处理主要影响植物的中心代谢过程。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分类（adj P ≤ 0.01，Fisher’s Exact检验）用于解析变化的代谢反应。如图5A所示，低磷处理导致碳相关代谢水平的整体增加，包括光合作用、卡尔文循环、氧化戊糖途径、糖酵解/糖异生以及淀粉/蔗糖合成（见图S7）。另一方面，低磷处理植株中与氨基酸和核苷酸分解代谢以及氨基酰化相关的转录本水平降低（见图5B）。这一结果提示，在低磷条件下，植物可能更高效地利用光能将无机碳转化为碳骨架，因此对氨基酸消耗的信号传导减弱。低磷处理植株较强的光能利用能力与其较高的光合色素（叶绿素和类胡萝卜素）浓度以及延迟的衰老现象相符（见图1和图2）。

RNASeq数据集进一步用于筛选参与光合色素代谢的基因，以及参与叶绿体生成和发育的基因（例如OsPSYI、OsPDS、OsHYD1、OsNOL、OsNYC3、OsPAO、OsRCCR1、OsGUN5、OsCRD1、OsPORA、OsPORB等）（见表S5）。在同一条线中，许多与叶片衰老相关的重要SAG基因（例如OsNAC6、OsNAP、OsSGR、Osl2、Osl55、Osl57、OsABC1-2、OsSAG12-2）及其调控途径在低磷（Low-Pi）植株中的表达受到了调控（表S6）。最后，与对甲基紫菜素（MV）介导的氧化应激的耐受性和抗氧化活性相关的研究结果一致，编码参与氧化还原平衡的酶的转录本（例如过氧化物酶、抗坏血酸过氧化物酶、硫氧还蛋白、谷胱甘肽-S-转移酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶等）也在低磷处理下的水稻植株中表现出调控（表S7）。总的来说，我们的转录组数据提供了水稻对短期低磷处理所涉及的分子调控机制的全面图谱。基因表达的转录变化主要集中在许多代谢途径和生物过程中，这些过程代表了水稻对短期低磷处理的适应性反应，而不是典型的全身性应激反应。因此可以推断，短期低磷处理会引起基因表达的暂时性改变，而不是不可逆的变化（这是在长期严重低磷处理导致营养缺乏的水稻植株中预期会出现的情况）。在分子功能方面，上调基因集合中最丰富的术语是“糖基转移酶活性”、“磷酸酯水解酶活性”和“UDP-糖基转移酶活性”，而下调基因则分为多种分子功能，包括“RNA催化活性”和“水解酶活性”（表S8）。在细胞组分类别中，上调基因中显著富集的前四个术语是“质体包膜”、“类囊体”、“外膜”和“光合膜”（表S9）。通过对DEGs（差分表达基因）的生化功能的进一步解读，使用了PANTHER-PC本体（基于进化关系的蛋白质分析-蛋白质分类）分析（Mi等人，2021年）。该分析显示，“水解酶”蛋白质类是在低磷植株中上调基因集合中最常见的类别，这些酶主要与磷的再利用有关（例如磷酸二酯酶、磷酸酶和磷脂酶等）（表S10）。与磷缺乏适应相关的关键基因也在低磷处理的植株中受到调控，包括磷转运基因（下文将进一步讨论）、磷诱导的OsPHR4转录因子、含有SPX结构域的蛋白质基因IPS1和IPS2，以及编码核糖核酸酶（S-RNases或RNSs，PR10a或PBZ1）的基因和参与非磷脂（包括半乳糖脂和硫脂）生物合成的基因（表S11）。总之，我们的转录组分析揭示了水稻在短期低磷处理下基因表达的全局调控机制。研究表明，多种代谢途径和生理功能在植物对短期低磷处理的适应性反应中受到调控，这些功能有助于延缓叶片衰老。

3.4. MIR827和MIR399的表达变化对水稻叶片衰老有影响
作为对水稻植株进行磷处理的补充方法，我们研究了过表达MIR827或MIR399对衰老相关机制的影响。先前的研究表明，持续表达MIR399或MIR827的水稻植株其叶片中的磷含量会增加（Campos-Soriano等人，2020年；Bundó等人，2024年）。相反，通过CRISPR/Cas9基因编辑沉默MIR827会降低磷含量（Bundó等人，2024年）。我们评估了纯合miR827过表达系（miR827 OE；3个独立生成的系）和在MIR827基因位点携带两种不同突变的CRISPR/Cas9编辑的水稻系（CRISPR-miR827系）（Bundó等人，2024年）。如先前报道的，在三叶期这些植株与野生型相比没有明显的表型差异（图S8A和B，左侧面板）。然而，在较晚的发育阶段，miR827 OE植株由于磷过量积累而表现出叶尖坏死，这与miR399 OE植株的情况相同（Campos-Soriano等人，2020年；Bundó等人，2024年）。与野生型植株相比，miR827 OE和CRISPR-miR827植株的磷含量分别增加或减少（图S8A和B，右侧面板）。值得注意的是，miR827 OE植株的叶片黄化加速，而CRISPR-miR827植株的衰老则被延缓（图6A；图S9）。此外，miR827 OE植株的叶片在甲基紫菜素（MV）处理后完全褪色，而CRISPR-miR827植株的叶片在MV处理后仍保持绿色（图6B和C）。相比之下，MV处理后的miR827 OE植株中的光合色素含量低于野生型植株（图6B），而MV处理后的CRISPR-miR827植株中的光合色素含量高于野生型植株（图6C）。

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图6. 分析MIR827表达异常的水稻植株中的衰老相关过程。对3-4叶期的miR827过表达（miR827 OE）和CRISPR/Cas9编辑植株（CRISPR-miR827）的整片叶片（叶片1）进行了DILS（差异染色法）分析。miR827 OE植株的叶片在黑暗中保存6天，CRISPR-miR827植株的叶片保存9天。（A）接受DILS处理的衰老叶片（整片叶片）的代表性图像（左侧面板）。右侧面板显示了衰老区域的量化结果。衰老程度以衰老叶片面积占叶片总面积的百分比表示。箱线图表示中位数和数据分布（N = 20片叶片，每个基因型）。图像分析使用APS Assess 2.0软件进行。条形=1厘米。（B）甲基紫菜素（MV）处理对miR827 OE水稻植株叶片（叶片1）的影响。上部分别是接受MV处理的叶片和用水处理的叶片（对照组）的代表性图像。条形=50微米。下部分别是MV处理后的水稻叶片中光合色素（叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）的光谱测量和量化结果。条形代表3个生物重复实验的平均值±标准误差（每个实验来自4株不同的植株）。（C）甲基紫菜素（MV）对CRISPR-miR827水稻植株叶片（叶片1）的影响。上部分别是接受MV（10微摩）处理的叶片和用水处理的叶片（对照组）的代表性图像。刻度条=50微米。下部分别是MV处理后的水稻叶片中光合色素（叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素）的光谱测量结果。条形代表3个生物重复实验的平均值±标准误差（每个实验来自4株不同的植株）。进行了两次独立实验，结果相似。通过单因素方差分析（A）和双因素方差分析（B和C）确定统计学上显著的差异（不同的字母表示显著差异）。

正如在高磷处理下的野生型植株中所观察到的，miR827 OE植株的叶绿素含量（叶绿素a和叶绿素b）也低于野生型植株，而在CRISPR-miR827植株中则增加（图7A）。关于类胡萝卜素，其含量在miR827 OE植株中低于野生型植株，但在CRISPR-miR827植株中则较高（图7B）。与miR827 OE植株一样，miR399 OE植株也表现出加速的叶片衰老（图S10A和B）、对MV诱导的氧化应激更敏感（图S10C），以及叶绿素和类胡萝卜素含量降低（图S10D和图S11）。因此，在miR399 OE和miR827 OE植株中观察到的结果，它们都在叶片中积累磷，与在高磷条件下得到的野生型植株的结果一致。这些发现进一步证实了miR399和miR827不仅作为磷稳态的调节因子，还参与叶片衰老的调控。关于miR827，先前的研究表明，MIR827在水稻旗叶衰老过程中上调（Sasi等人，2019年），从而建立了miR827功能与水稻叶片衰老调控之间的联系。

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图7. MIR827表达异常的水稻植株叶片中的光合色素含量。在3-4叶期从miR827过表达（miR827 OE）和CRISPR/Cas9编辑的植株（CRISPR-miR827）中收集叶片（叶片1，最年轻的叶片）。使用HPLC测定叶绿素a和叶绿素b的含量以及类胡萝卜素的总含量。（A）叶绿素a和叶绿素b的含量。（B）类胡萝卜素含量（总类胡萝卜素、叶黄素、9-顺-β-胡萝卜素、β-胡萝卜素、紫黄质和新黄质）。条形代表4个生物重复实验的平均值±标准误差（每个实验来自4株不同的植株）。进行了三次独立实验。通过单因素方差分析确定统计学上显著的差异（不同的字母表示不同磷条件下的显著差异）。

3.5. 低磷处理水稻植株叶片中液泡磷转运蛋白的表达
我们对低磷处理的水稻植株进行的转录组分析显示，编码磷转运蛋白的许多基因的表达发生了变化（见表S11），其中包括位于质膜上的PHT家族磷转运蛋白（如PHT1）、PHT2和PHT4磷转运蛋白（例如OsPHT1;9、OsPHT1;3、OsPHT1;10、OsPHT1;4、OsPHT1;8、OsPHT1;1、OsPHT4;5和OsPHT2;1）。转录组分析还显示，在低磷处理下，液泡磷转运蛋白（包括miR827靶向的OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2基因）的表达也发生了变化。
液泡中磷的运输调节对于维持细胞内磷的稳态至关重要。在充足的磷供应下，高达95%的细胞内磷可以储存在液泡中（Bucher和Fabiańska，2016年）。细胞内磷的缓冲由位于液泡膜上的磷转运蛋白介导，包括磷的摄入和排出转运蛋白。这样，在磷限制条件下，储存在液泡中的磷会被释放到细胞质中，以满足细胞代谢的需求。尽管功能上不完全相同，但三种水稻SPX-MFS蛋白（SPX-MFS1、SPX-MFS2、SPX-MFS3）都作为液泡中的磷摄入转运蛋白发挥作用（Guo等人，2023年）。在水稻中也鉴定出了不同的液泡磷排出转运蛋白，即VPE1（液泡磷排出转运蛋白1）和VPE2（Xu等人，2019年）。miR827靶向的液泡转运蛋白OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2的表达分析表明，这些基因对低磷处理的反应不同（图8A）。与低磷处理导致的miR827积累增加一致，OsSPX-MFS1在低磷处理下的表达显著降低。然而，OsSPX-MFS2的转录本在低磷处理下增加（同样也被miR827靶向）。在这方面，先前的研究显示，在CRISPR-miR827植株中OsSPX-MFS1的表达上调，而在这些植株中OsSPX-MFS2的表达没有显著变化（Bundó等人，2024年）。类似地，Lin等人（2010年）报告了在缺磷水稻植株中OsSPX-MFS1下调，而OsSPX-MFS2上调。无论磷的供应情况如何，OsSPX-MFS2的表达始终比OsSPX-MFS1高得多（图8A）。总的来说，这些观察结果支持了除了miR827介导的调控外，还存在其他调控机制来控制低磷处理下OsSPX-MFS2的表达。关于OsSPX-MFS3（不是miR827的靶标），其表达在低磷水稻植株中下调（图8A）。最后，低磷处理下OsVPE1和OsVPE2这两种磷排出转运蛋白的表达在低磷植株中显著高于对照组（图8A），这与这些植株从液泡中释放磷以维持细胞内磷稳态相一致。

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图8. 低磷处理下水稻植株叶片中液泡磷转运蛋白的表达。（A）液泡磷摄入转运蛋白OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2（miR827靶向）以及液泡磷排出转运蛋白OsVPE1和OsVPE2的表达。表达数据对应于RNASeq结果。条形代表3个生物重复实验的平均值±标准误差。通过Wald检验确定统计学上显著的差异（显示了原始p值）。（B）miR827靶向的OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2的RT-PCR分析。（C）OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2基因的示意图以及相应基因5'UTR区域中鉴定出的新的可变剪接转录本。新鉴定的可变剪接转录本分别缺失了118个和150个核苷酸。用于RT-PCR分析的寡核苷酸分别用红色和绿色条形表示（正向和反向引物）。星号表示5' UTR区域中的miR827识别位点。

综上所述，这些发现表明miR827靶向和非靶向的液泡磷转运蛋白（例如OsSPX-MFS1、OsSPX-MFS2和OsSPX-MFS3）的表达存在差异。先前的研究推测，液泡磷转运蛋白表达的补偿性调控机制将确保短期低磷处理下的水稻植株具有最佳的细胞内磷状态和磷稳态，这一点值得进一步研究。

3.6. miR827靶向的液泡磷转运蛋白中的可变剪接事件识别
基于在拟南芥（Lin等人，2018年）中关于miR827靶向基因的可变剪接事件的研究结果，本工作进一步探讨了OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2中可能发生的可变剪接事件的可能性，这种机制可能会调节miR827靶标基因的表达。在这方面，先前有研究提出产生非目标替代转录本是一种机制，可以减弱miR827对拟南芥目标基因的调控作用。在水稻中，SPX-MFS基因具有高度保守的结构，包含10个内含子和11个外显子，其中5′UTR区域有一个大的内含子（Wang等人，2012年）。miR827的识别位点位于OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2转录本的5′UTR区域（但在OsSPX-MFS3中不存在）（图S12A）。在这项工作中，使用特异性引物进行RT-PCR扩增后对PCR产物进行DNA测序，以鉴定Pi处理水稻叶片中miR827靶基因的转录本变异体。每个基因（OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2）观察到了两个覆盖5′UTR区域的转录本变异体（分别为118个核苷酸和150个核苷酸的缺失）（图8B和C）。最重要的是，DNA测序结果显示，OsSPX-MFS2的最短转录本变异体不包含miR827的靶序列，从而使其免受miR827的调控（图8C）。将RNASeq读取结果映射到水稻基因组（https://rapdb.dna.affrc.go.jp/）后，确认了OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2中的新内含子（图S12B）。这些结果突显了调控OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2表达的复杂机制，这整合了miR827的功能和OsSPX-MFS转录本的可变剪接，从而为液泡Pi转运蛋白的控制增加了另一层调节。因此，生成目标和非目标的替代转录本可能有助于水稻植株适应变化的Pi供应条件。

4. 讨论
在本研究中，我们提供了证据表明Pi对水稻早期营养生长期间的叶片衰老有显著影响。支持这一结论的定性和定量分析显示，在不同Pi营养条件下，短期Pi处理可以延缓水稻幼苗的叶片衰老，而增加Pi供应则会引发叶片衰老状态。不仅Pi施肥制度，MIR827和MIR399的表达变化也会影响叶片衰老的过程。因此，CRISPR-Cas9编辑后的MIR827水稻植株中Pi含量的降低会延缓叶片衰老，而在MIR399和MIR827含量增加的植株中则会加速叶片衰老。重要的是，在这项研究中，对水稻幼苗进行了短期处理，以避免由长时间Pi处理（例如Pi缺乏或Pi毒性）引起的表型混淆，这一点在文献中尚未得到准确反映。显然，Pi处理的持续时间和强度（例如使用的Pi浓度）可能决定了植物对处理的反应，从而影响Pi含量对衰老的影响。长时间的低Pi处理可能导致营养缺乏，最终可能引发不可逆的反应。这里观察到的低Pi诱导的延迟衰老是一种暂时性的反应，而不是稳定的生理状态。然而，在本研究中，尚未检测到超过3周的长期低Pi处理。另外，值得一提的是，与年龄相关的衰老调控涉及营养再利用，这种现象发生在成年植株和/或持续缺Pi的植株中（Zhang等人，2024a）。这种情况会严重干扰植物生长和发育所必需的生理过程。通过研究早期发育阶段水稻植株对Pi处理的反应，可以排除年龄相关因素对叶片衰老的控制作用。

在低Pi条件下，叶绿素和类胡萝卜素含量较高，而随着Pi供应的增加，其含量逐渐减少。由于光合色素的降解是叶片衰老最明显的标志，因此光合色素的积累增加可以解释短期低Pi处理下叶片衰老的延迟。这些结果与最近使用高光谱成像技术对籼稻品种（例如KDML105品种）的研究结果一致，该研究报道在Pi缺乏的水稻幼苗中叶绿素含量增加（Jaisue等人，2025年）。低Pi诱导的延迟叶片衰老可能是一种适应性机制，有助于植物在土壤中Pi生物利用度暂时下降的情况下维持生长。相反，高Pi会导致叶绿素含量显著减少并加速叶片衰老，表明过量的Pi是一个更具有压力的因素。总体而言，我们的结果提供了证据，表明在水稻植株面临Pi限制时，其具有更强的适应性，而Pi的积累则会妨碍植物应对压力环境的能力。这里呈现的结果还表明，短期低Pi处理可以使水稻植株对MV诱导的叶绿体ROS产生具有耐受性。低Pi植株中有效的抗氧化系统（例如H2O2解毒酶）与观察到的对MV诱导的氧化应激的耐受性表型相关。与此相反，叶中Pi的积累会增加对MV诱导的氧化应激的敏感性，并降低抗氧化酶活性。高Pi植株中清除ROS的能力减弱，使得这些植株无法有效应对MV诱导的氧化应激。这一事实也与高Pi植株中脂质过氧化和膜通透性的增加相符合，这是叶片衰老的固有特征。此外，在低Pi供应下水稻叶片中类胡萝卜素含量的增加有助于保护膜系统免受脂质过氧化和电解质泄漏（Jaisue等人，2025年）。支持这种可能性的是，类胡萝卜素已知可以作为ROS清除剂，保护叶绿体免受氧化损伤，特别是单线态氧（1O2）的伤害，后者是脂质过氧化和叶绿素漂白的的主要原因（Falk和Munné-Bosch，2010年）。因此，高Pi植株叶片中类胡萝卜素浓度较低将有利于膜脂质过氧化和电解质泄漏。观察到低Pi短期处理能够增强植物抵御氧化应激的能力，这引发了为什么植物在低Pi条件下需要投入更多资源到抗氧化系统中的疑问。这种明显的矛盾可以通过本研究中检测到的低水平Pi压力来解释，这种压力不足以引起明显的生理变化或不可逆的改变。低Pi处理可能触发的是一种暂时性反应，而不是损害性的压力因素。另一方面，已知轻微的压力可以诱导植物的“压力记忆”，即在低Pi处理下的预处理效应可能使水稻植株在再次暴露于低Pi时能够更快、更强烈地启动抗氧化反应。需要进一步的研究来澄清这些问题。

对低Pi处理的水稻植株的表达分析提供了一个整体视图，揭示了这些植株叶片衰老背后的分子机制。与观察到的叶片衰老表型一致，低Pi处理伴随着SAGs以及参与光合色素（叶绿素和类胡萝卜素）生物合成和/或降解的基因表达变化。转录组分析揭示了水稻对低Pi短期处理的适应性反应的分子机制，其中多个生物过程似乎共同作用以有效延缓叶片衰老。正如预期的那样，低Pi处理伴随着参与Pi稳态维持的基因表达变化，包括参与Pi信号通路和Pi转运蛋白的基因。在低Pi植株中上调的基因还包括参与非磷脂生物合成的基因，如半乳脂质（单半乳糖二酰甘油合成酶和二半乳糖二酰甘油合成酶）和硫酸脂质（UDP-硫酸奎诺糖合成酶；硫酸奎诺糖转移酶）。半乳脂质对于维持叶绿体中的功能性光合装置至关重要。然而，在应激条件下，膜磷脂会被非磷脂替代，半乳脂质在细胞外膜中作为磷脂的替代品（Okazaki等人，2013年；Li和Yu，2018年）。可以推测，在低Pi水稻细胞的膜中，膜脂质从磷脂向半乳脂质和硫酸脂质的转换会发生。转录谱分析还显示，与碳代谢、次生代谢物和脂质代谢相关的基因在低Pi植株中的表达水平更高。这些基因的表达变化可以作为基于Pi处理的策略的 functional markers，旨在延缓水稻叶片衰老。

除了低Pi处理外，还表明MIR827或MIR399表达的变化也会影响水稻叶片衰老。如前所述，CRISPR/Cas9介导的MIR827突变会降低Pi含量，而MIR827或MIR399的过表达则会增加水稻叶片中的Pi含量（Campos-Soriano等人，2020年；Bundó等人，2024年）。CRISPR/Cas9介导的MIR827表达沉默伴随着光合色素含量的增加、叶片衰老的延迟以及对MV诱导的氧化应激的耐受性。相反，miR827和miR399的过表达（Pi积累植株）会导致光合色素减少和叶片衰老加速，并增加叶绿体对MV诱导的氧化应激的敏感性。因此，用高Pi处理野生型水稻植株以及MIR827（或MIR399）过表达这两种策略在叶片衰老相关过程中的后果相似。尽管miR827和miR399在调控Pi稳态中的功能重要性已有充分记载，但它们在叶片衰老中的作用，尤其是在水稻中的作用仍需进一步探索。然而，在拟南芥中，Pi稳态和叶片衰老已经通过鉴定一个新的miR827靶基因而相互关联（Ma等人，2021年）。此外，据报道拟南芥miR827还靶向转录调节因子GPLalpha（GLABRA1增强子结合蛋白样α基因），其表达在拟南芥衰老过程中被诱导（Ma等人，2021年）。不过，在那项研究中未能检测到5’-RACE（cDNA末端快速扩增）在预测的靶位点切割AtGPLα转录本（Ma等人，2021年）。支持miR827在水稻叶片衰老中起作用的证据来自对不同阶段叶片衰老（早期衰老、中期衰老和晚期衰老）中表达的miRNAs的研究（Sasi等人，2019年）。在这里，发现miR827的积累在叶片衰老过程中增加，特别是在衰老的最后两个阶段MIR827的表达上调（Sasi等人，2019年）。鉴于miR827的功能在植物进化过程中会发生靶标转换（Lin等人，2018年），我们探讨了miR827是否可能调控其他与衰老相关的基因。使用psRNATarget工具预测靶基因时，发现miR827与编码未知生物学功能的F-BOX-TYPE E3 UBIQUITIN连接酶的OsFBX285具有部分序列互补性。然而，未能在OsFBX285转录本中通过5’-RACE识别出miR827的切割事件。无论OsFBX285是否受miR827调控，与对照组和高Pi植株相比，低Pi植株中的OsFBX285表达均上调（结果未显示）。另一方面，据我们所知，目前还没有关于低Pi处理水稻叶片的降解组数据。在植物中，至少在拟南芥中，Pi稳态和衰老程序存在共同的调控机制，miR827在这些机制中负责Pi信号通路和衰老信号通路之间的整合，使植物能够快速适应变化的Pi环境。然而，与拟南芥的不同，目前尚未在水稻植株中找到受miR827调控的其他基因（除了OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2）。

通常认为，5′区域的转录本变异体，尤其是5′UTR区域的变异体，可能是基因表达的关键调控因子，常常决定mRNA的稳定性、翻译效率和蛋白质异构体的多样性。在本工作中，提供了以前未知的OsSPX-MFS1和OsSPX-MFS2转录本变异体的产生证据，这些变异体可能对基因表达的调控有重要影响。特别值得注意的是OsSPX-MFS2。因此，miR827未靶向的替代转录本的生成代表了一种将可变剪接和miR827介导的切割结合的调控机制，这可能有助于水稻植株适应变化的Pi供应条件。然而，尽管这些发现为调控编码液泡Pi转运蛋白的rice SPX-MFS基因提供了新的线索，从而有助于维持Pi的稳态，但还需要进一步的研究来确定OsSPX-MFS基因生成目标和非目标替代转录本是否与水稻的衰老有关。这些观察结果还表明，存在一种整合miRNA功能和mRNA处理的调控机制来控制OsSPX-MFS2的表达。鉴于细胞内Pi的稳态在细胞质（低浓度）和液泡（高浓度）之间的平衡中起着重要作用，因此必须在植物细胞中严格控制Pi在液泡和细胞质之间的转运机制。miRNA（特别是miR827）通过提供快速、可逆的调控层，使植物细胞能够在不改变转录水平的情况下精细调节液泡Pi转运蛋白的功能，从而快速应对Pi供应的变化，尤其是在Pi不足的情况下。另一方面，考虑到叶片衰老表型在时间上的变化、SAGs（以及其他与衰老相关的基因）的表达、控制代谢过程的基因以及衰老生理参数（如ROS解毒）的变化，可以得出结论，多种生物过程参与了水稻对短期Pi缺乏的适应反应。图9提出了一个总结这些适应反应的模型。简而言之，短期Pi缺乏（以及miR827的沉默）会导致光合色素（叶绿素、类胡萝卜素）含量的增加，并增强H2O2解毒酶的活性。这些因素加上较高的类胡萝卜素含量有助于维持ROS的稳态，减少膜脂质过氧化，并保持膜的通透性。短期Pi缺乏还会引起代谢过程的变化（例如与碳代谢、脂质代谢或次级代谢相关的过程），这可能有助于延缓叶片衰老。而在通过高Pi施肥或miR827/miR399过表达使水稻叶片积累Pi的情况下，则观察到相反的效果。鉴于长期Pi缺乏会导致叶片过早衰老，可以推测短期Pi缺乏下的观察到的效应是一种暂时性反应，而不是低Pi处理下水稻的稳定生理状态。

图9. 水稻叶片衰老过程中涉及Pi调节的机制。低Pi施肥（或miR827沉默）导致的Pi含量下降会促使光合色素含量增加，减少膜脂质过氧化和渗透性，并增强叶绿体中对MV诱导的氧化应激的耐受性，同时增加参与ROS解毒的酶（APX、抗坏血酸过氧化物酶；过氧化氢酶，CAT；过氧化物酶，POD）的活性。水稻叶片中Pi含量的降低还会改变与衰老相关过程（如SAGs、叶绿素生物合成和降解、类胡萝卜素生物合成、氧化应激）以及Pi稳态相关基因的表达。而在通过高Pi施肥或miR827/miR399过表达使水稻叶片积累Pi的情况下，叶片衰老会加速。值得注意的是，低Pi处理还调节了参与多种代谢和生理过程的基因的表达，如碳代谢、脂质代谢和次级代谢。这项研究揭示了水稻适应低Pi供应的分子机制。尽管水稻是最重要的主食之一，但其种植仍面临诸多挑战，包括气候变化、病虫害的影响、水污染（主要是由于过度使用化肥）以及与城市扩张相关的人为压力和农业用地的减少。这里的研究结果表明，Pi营养对于控制水稻生长早期的叶片衰老至关重要。因此，解读水稻植物如何适应Pi水平的变化以及导致叶片衰老延迟的机制在水稻栽培中具有重大意义。另一方面，上个世纪绿色革命 Strategy的采用通过广泛使用化肥大大提高了水稻产量，但这导致了水稻田中Pi的过剩。因此，现代水稻品种高度依赖Pi肥料的施用。由于高Pi施肥会加速叶片衰老，有必要重新评估当前基于过度使用Pi肥料的栽培实践。这里的研究结果为理解水稻对低Pi供应的适应策略提供了理论基础，有助于减少因化肥过量使用带来的环境问题。

本研究得到了PID2021-128825OB-I00（B. SS）和PID2024-162615OB-I00（A.G-M）项目的资助，这些项目由MICIU/AEI/10.13039/501100011033和ERDF/EU资助；以及RYC2022-037020-I（A. G-M）项目的资助，该项目也由MICIU/AEI/10.13039/501100011033和ESF+资助。我们还要感谢CEX2019-000902-S项目的财务支持，该项目由MICIU/AEI/10.13039/50110001103以及CERCA Program/Generalitat de Catalunya提供。H. M-C获得了MCIN（参考编号PRE2019-087477）的奖学金。

CRediT作者贡献声明：
Mireia Bundó：撰写 – 修订与编辑、方法论、研究、数据分析。
Héctor Martín-Cardoso：撰写 – 修订与编辑、原始草稿撰写、可视化、方法论、研究、数据分析。
Blanca San Segundo：撰写 – 修订与编辑、原始草稿撰写、监督、项目管理、资金获取、概念化。
Antoni Garcia-Molina：撰写 – 修订与编辑、方法论、研究、资金获取、数据分析。