RNA-seq分析揭示了下丘脑中参与儿茶酚胺合成和代谢的差异表达基因，这些基因影响了生长缓慢的科拉特（Korat）鸡残余饲料摄入量的不同

《Poultry Science》：RNA-seq reveals differentially expressed genes involved in catecholamine synthesis and metabolism in the hypothalamus affecting divergent residual feed intake in slow-growing Korat chickens

　　潘普拉杜布·辛普鲁|奥拉平·詹塔萨昂|波查拉蓬·帕斯里|布尼亚里特·卡姆克拉托克|萨克纳林·彭桑西亚|汤姆·E·波特|维塔瓦特·莫利|阿蒙拉特·莫利
泰国那空拉差西玛苏拉纳雷技术大学农业技术研究所动物技术与创新学院，30000

**摘要**
科拉特鸡（KRC）是一种生长缓慢的鸡肉品种，以其独特的肉质和营养价值而闻名，其饲料效率（FE）存在差异。由于下丘脑是多种营养相关信号的汇聚和整合中心，本研究旨在比较两组具有不同剩余饲料摄入量（RFI）的雄性KRC之间下丘脑的转录组谱型和神经通路。从低RFI组（n=10）和高RFI组（n=10）的雄性KRC下丘脑组织中提取RNA。结果表明，与高RFI组相比，低RFI组有257个差异表达基因（DEGs），包括138个上调基因和119个下调基因。对这些DEGs的基因本体分析显示，它们主要与代谢过程和转运蛋白活性相关。京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析确定了3个显著通路：叶酸生物合成（包含GCH1、TPH2和TH的3个基因）、酪氨酸代谢（包含DDC、TH和FAH的3个基因）以及色氨酸代谢（包含DDC、TPH2和TDO2的3个基因）。低RFI组中上调的基因（TPH2、DDC和TH）在叶酸生物合成、酪氨酸代谢和色氨酸代谢通路中富集，这与观察到的多巴胺（DA）和血清素/5-羟色胺（ST/5-HT）的血浆浓度一致。这些发现表明，不同鸡群体之间的DA和ST/5-HT水平差异可能与饲料效率的差异有关。此外，GCH1、TPH2、DDC、TH和FAH等基因可能是支持下丘脑调节KRC饲料效率作用的候选基因。

**引言**
科拉特鸡（KRC）是泰国本土雄性鸡系（Leung Hang Khao, LK）与肉鸡系（苏拉纳雷技术大学, SUT）的杂交品种。KRC被归类为生长缓慢的鸡种，平均日增重（ADG）为24.13克/天，在12周龄时体重达到1.79公斤，饲料转化率（FCR）为2.94（Hang等人，2018）。由于饲料成本约占家禽生产总成本的60-70%，因此饲料利用效率是决定家禽业盈利能力的关键因素（Guo等人，2024）。为了维持小农户的收入并减少生态足迹，提高KRC的饲料效率至关重要。

动物的饲料效率取决于其饲料摄入量（FI）与生长之间的关系，其中大脑整合来自外周组织的代谢信号，并随后协调FI和能量消耗的适应性变化（Blouet和Schwartz，2010）。在KRC中，高通量组学技术已被用于比较饲料效率不同的动物之间的基因表达模式，提供候选生物标志物，并通过遗传选择确定提高饲料效率的机制。对空肠的研究发现，不同饲料效率的动物在免疫反应、谷胱甘肽代谢、维生素转运和代谢、脂质代谢、神经和心脏成熟、发育及生长相关通路中存在差异表达基因（Sinpru等人，2021）。类似的研究表明，高饲料效率的鸡在能源提取方面具有更好的葡萄糖分解能力，并且它们的肠上皮具有更强的紧密连接（Kaewsatuan等人，2022）。此外，我们之前的研究在垂体组织中发现了低RFI组和高RFI组之间的几个差异表达基因，这些基因可能对其表型差异有贡献，例如G-protein信号调节因子1（RGS1）、促甲状腺激素释放激素受体3（TRHR3）、溶质转运蛋白家族6成员1（SLC6A1）、溶质转运蛋白家族6成员13（SLC6A13）、溶质转运蛋白家族13成员3（SLC13A3）、PR/SET结构域6（PRDM6）、ATP酶13A5（ATP13A5）和α-胰蛋白酶抑制剂重链2（ITIH2）。这些基因与代谢稳态、能量平衡、营养代谢和激素调节信号通路相关（Sinpru等人，2025）。然而，下丘脑对饲料效率差异反应的调节机制复杂且尚不清楚，尤其是在生长缓慢的KRC中。

下丘脑在调节食物摄入量和能量消耗中起核心作用（Sohn，2015），它是整合来自外周组织的代谢信号的关键脑区，以在变化的代谢条件下维持FI和能量平衡（Blouet和Schwartz，2010）。儿茶酚胺（如多巴胺、去甲肾上腺素）是下丘脑中的重要神经递质，它们通过作用于特定的下丘脑核团调控食欲、应激反应、心血管控制和生殖激素，进而影响垂体腺，将神经系统与内分泌系统联系起来，其水平会受到应激、水分状态甚至瘦素信号的影响（Neill等人，1979）。已有研究表明，下丘脑神经肽基因表达[神经肽Y（NPY）受体Y5]会影响鸭子的饲料效率（Zeng等人，2016），在低剩余饲料摄入量组中减少FI并增加厌食。对猪下丘脑基因表达的研究发现，低RFI和高RFI个体之间的差异表达基因在调节FI的神经通路中富集，例如摄食行为通路和嗅球发育通路（Hou等人，2018）。在鸭子中，高RFI组的γ-氨基丁酸（GABA）A型受体（γ-氨基丁酸A型受体亚单位δ和γ-氨基丁酸A型受体亚单位β1）增加，这可能通过GABA信号通路激活GABA释放，从而激活弓状核NPY/阿古提相关肽神经元，引发摄食反应（Guo等人，2024）。在选择不同RFI值的产蛋鸡中，发现了几种神经肽的表达差异，如下丘脑细胞因子信号抑制因子3、胃饥饿素受体、NPY和阿古提相关肽（Sintubin等人，2014）。基于这些发现，我们假设下丘脑水平的基因表达变化可能激活对鸡饲料效率有贡献的关键分子过程。然而，目前尚无研究报道与生长缓慢鸡饲料效率差异相关的下丘脑神经信号转导基因。这是首次揭示生长缓慢KRC下丘脑转录组谱型和通路的研究。因此，本研究旨在利用RNA测序（RNA-seq）确定与低RFI组和高RFI组之间RFI差异相关的候选基因和通路。本研究的结果可以作为生长缓慢鸡的模型，以阐明影响生产成本并促进环境可持续性的下丘脑神经信号机制。

**材料与方法**
**伦理声明**
本研究中应用的实验程序和方案已获得泰国那空拉差西玛苏拉纳雷技术大学动物使用伦理委员会的批准（SUT-IACUC-0016/2022）。

**动物、饲养环境、饲料效率评估和组织采样**
为了生产KRC，以1:5的比例将20只LK雄性鸡和100只SUT雌性鸡配对。所有一天大的KRC雏鸡均进行了性别鉴定，并在孵化时进行了个体称重。雏鸡被单独饲养在笼子里，并免费提供商业饲料（CPF有限公司，那空拉差西玛，泰国），在3周龄之前提供起始饲料（总能量3,946 kcal/kg，蛋白质含量21%），4至6周龄提供生长饲料（总能量4,081 kcal/kg，蛋白质含量19%），7至10周龄提供育肥饲料（总能量4,111 kcal/kg，蛋白质含量17%）。从1周至10周龄期间，分别记录每只KRC的体重（BW）和饲料摄入量（FI）。在10周龄时，根据Poompramun等人（2021）的方法计算RFI。RFI计算公式如下：
**RFIj = 总饲料摄入量（克）在第j周 ? (b0 + b1 × MWj + BWGj)**
其中BWGj是第j周的体重增重（克），MWj是根据第j周的平均体重估计的代谢体重，即（**初始体重 ? 最终体重**）/ 0.75，b0是截距，b1和b2是偏回归系数。然后根据计算出的RFI值，从孵化到第j周的累积RFI如下：
**RFIj = ∑i=1j RFIi**

根据10周龄时的RFI值，分别选出10只RFI极低的鸡和10只RFI极高的鸡，形成低RFI组和高RFI组。屠宰前，所有20只鸡均进行了8小时的禁食处理，但可持续供水。经过电击处理（150 mA，频率200 Hz，持续4秒）后，通过斩首方式安乐死鸡，并使用带光源的放大镜小心解剖下丘脑样本。初始切口位于动眼神经（nervus oculomotorius）前方和嗅结节（tuberculum olfactorium）后方，依据已发表的描述和图示进行（Kuenzel和Masson，1988）。接下来，从中线向外侧约2毫米处做切割，获取一块矩形组织。将其侧放，然后在次隔膜器官（organum subseptale）下方、平行于下丘脑基底表面处进行最终切割。这种解剖方案能够一致地获取与摄食相关的核心区域，主要包括漏斗核（infundibular nucleus, IN）、腹内侧核（ventromedial nucleus, VMH）和室管膜下核（paraventricular nucleus, PVN）（Boswell等人，2002；Chen等人，2007；Kosonsiriluk等人，2008）。将下丘脑组织收集到管中，立即置于液氮中冷冻，并保存在?80°C直至进一步进行RNA提取分析。随后仔细解剖腹部脂肪并称重。

**总RNA提取和质量控制**
使用Trezol试剂（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）根据制造商的方案从20只雄性鸡（每个处理组10只）中分离下丘脑总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA）测量RNA浓度。为了提高RNA产量并减少组织解剖引起的变异，将每个组内两只鸡的等量RNA合并成一个生物样本，从而为低RFI组和高RFI组各生成五个合并样本。RNA合并基于RFI值排序，将与同一表型组内RFI排名相近的样本组合起来。使用1%琼脂糖凝胶电泳验证合并样本的RNA纯度，并使用5400 Fragment Analyzer Systems（Agilent Technologies，Santa Clara，CA）评估RNA完整性数（RIN）。选择RIN ≥ 7.7的1 μg总RNA用于构建cDNA文库。剩余的RNA保存在?80°C以备后续验证测定。

**cDNA文库构建和RNA-seq**
cDNA文库的构建和RNA-seq由Novogene Biotechnology Company（北京，中国）根据制造商的用户指南（Illumina，San Diego，CA）完成。每个合并样本使用1 μg RNA构建10个文库。简要来说，使用Poly-T oligo-attached磁珠从总RNA中纯化mRNA。片段化后，使用随机六聚体引物合成第一条cDNA链，随后使用dUTP合成第二条cDNA链，形成定向文库。使用AMPure XP系统（Beckman Coulter，Beverly，USA）纯化cDNA片段，选择长度为370-420 bp的片段进行PCR扩增，最终构建cDNA文库。文库在Illumina Novaseq 6000仪器（Illumina，San Diego，CA）上进行测序，采用150 bp配对末端读长方法。

**生物信息学分析**
过滤FASTQ格式的原始读长以去除适配子和低质量读长（Martin，2011）。同时计算Phred分数Q20、Q30和GC含量。使用Hisat2版本2.0.5软件（Kim等人，2013）将10个合并样本的高质量清洁读长映射到鸡参考基因组（GRCg6a，GenBank组装访问号：GCA_000002315.5）。为了识别低RFI组和高RFI组之间的DEGs，使用DESeq2 R包（版本1.20.0）（Love等人，2014）的原始读数计数作为输入。基因表达水平也以每百万读数中的读数（RPKM）进行估算以便比较。DEGs的阈值设定为P值<0.05和|log2倍数变化|>1。使用clusterProfiler R包（版本3.8.1）进行DEGs的功能富集分析，包括基因本体（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路分析，P调整值（P-adj）<0.05视为显著富集。 menggunakan basis data STRING (versi 10; http://string-db.org/) dilakukan analisis jaringan interaksi protein-protein pada gen yang diekspresikan secara diferensial (DEGs). Untuk validasi keakuratan dan reproduktibilitas data RNA-seq antara kelompok dengan RFI rendah dan tinggi, dilakukan reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) dengan menggunakan lima sampel RNA pool yang sama untuk masing-masing kelompok. Lima DEGs dipilih untuk validasi, termasuk L-DOPA decarboxylase (DDC), tyrosine hydroxylase (TH), tryptophan hydroxylase 2 (TPH2), fumarylacetoacetate hydrolase (FAH), dan GTP cyclohydrolase 1 (GCH1), berdasarkan koneksi tinggi mereka dan keterlibatan dalam jaringan regulasi yang mempengaruhi perilaku pemakanan. RT-qPCR dilakukan menggunakan LightCycler 480 System (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Jerman) dengan bahan pengencer SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). Kondisi siklus termalnya adalah 95°C selama 10 menit, diikuti oleh 40 siklus dengan 95°C selama 30 detik, 60°C selama 1 menit, dan 72°C selama 30 detik. Secuens primer dirancang menggunakan Ensembl (https://ensembl.org) dan disediakan dalam Tabel S1. Lima sampel RNA pool dianalisis untuk setiap kondisi, dengan masing-masing sampel diukur tiga kali secara teknis. Ekspresi gen relatif dihitung menggunakan metode 2???Ct (Livak dan Schmittgen, 2001), dengan β-actin sebagai gen referensi. Nilai ekspresi masing-masing gen diubah ke log2 untuk memudahkan perbandingan antara hasil RT–qPCR dan RNA–seq.

Untuk memvalidasi jalur metabolik dan sinyal yang diidentifikasi melalui analisis transkriptomik, dilakukan analisis terarah untuk mendukung relevansi biologis temuan tersebut. Darah dikumpulkan dari sepuluh ekor burung dalam setiap kelompok dan dimasukkan ke dalam tabung EDTA, kemudian dinetrolis pada kecepatan 4,000 × g selama 15 menit pada suhu 4°C. Sampel plasma dibagi ke dalam tabung 1.5 mL dan disimpan pada suhu ?20°C untuk analisis jalur KEGG selanjutnya. Kadar dopamine (DA) diukur menggunakan kit ELISA DA (Antibodies.com LLC, MO, USA), dan kadar serotonin/5-hydroxytryptamine (ST/5-HT) diukur menggunakan kit ELISA kompetitif (Thermo Fisher Scientific, Bender MedSystems GmbH, Vienna, Austria). Kurva logistik empat parameter (4-PL) dibuat sebagai kurva standar untuk menghitung konsentrasi sampel.

Perbedaan rata-rata fenotipe, tingkat ekspresi gen, serta kadar DA dan ST/5-HT antara kelompok dengan RFI rendah dan tinggi dievaluasi menggunakan uji t Student dalam paket perangkat lunak SPSS 24.0 (SPSS Inc., Chicago, IL). Nilai P < 0,05 dianggap signifikan secara statistik. Semua data dinyatakan sebagai rata-rata ± SEM.

**Hasil dan Diskusi**

**Pengukuran Fenotipik**
Kelompok KRC dengan fenotipe RFI ekstrem menunjukkan perbedaan signifikan dalam FI, FCR, dan RFI (P < 0,01), tetapi tidak ada perbedaan signifikan dalam BW, BWG, ADG, dan lemak abdominal (P > 0,05) (Tabel 1). Ayam dengan kelompok RFI rendah menunjukkan FI, FCR, dan RFI yang signifikan lebih rendah dibandingkan kelompok RFI tinggi (P < 0,01). Nilai RFI kelompok RFI rendah adalah ?233,98 ± 12,23 g, sedangkan kelompok RFI tinggi adalah 256,53 ± 21,90 g. Sesuai dengan definisi RFI, kelompok RFI rendah menunjukkan FE yang lebih tinggi dengan FI yang lebih rendah, sementara BW, BWG, ADG, dan lemak abdominal tidak terpengaruh.

**Tabel 1. Karakteristik fenotipik kelompok RFI rendah dan tinggi (rata-rata ± SEM)**
| Karakteristik | Kelompok RFI Rendah (n=10) | Kelompok RFI Tinggi (n=10) | Perbedaan Rata-Rata (95% CIP-value) | Rata-Rata ± SEM | CV (%) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| BW (g) | 1,388,80 ± 36,72 | 8,36 | 1,456,00 ± 26,48 | 5,75 | -67,20 (-155,90, 21,50) | 0,16 |
| BWG (g) | 1,341,40 ± 36,47 | 8,60 | 1,411,50 ± 26,53 | 5,94 | -70,10 (-158,70, 18,50) | 0,14 |
| ADG (g/d) | 19,30 ± 0,51 | 8,36 | 20,20 ± 0,38 | 5,95 | -0,90 (-2,08, 0,28) | 0,17 |
| FI (g) | 2,977,00 ± 66,64 | 7,08 | 3,560,60 ± 62,37 | 5,54 | -583,60 (-783,30, -383,90) | <0,01 |
| FCR | 2,22 ± 0,20 | 28,49 | 2,52 ± 0,20 | 25,10 | -0,30 (-0,89, 0,29) | <0,01 |
| RFI (g) | -233,98 ± 12,23 | 16,53 | 2,565,3 ± 21,90 | 27,00 | -490,51 (-545,40, -435,60) | <0,01 |
| Lemak Abdominal (g) | 11,61 ± 2,27 | 61,83 | 15,15 ± 2,45 | 51,14 | -3,54 (-10,70, 3,60) | 0,30 |
| Lemak Abdominal (%) | 0,83 ± 0,16 | 60,96 | 1,04 ± 0,18 | 54,73 | -0,21 (-0,68, 0,26) | 0,38 |

Rata-rata karakteristik fenotipik dihitung dari masing-masing individu dalam kelompok (n = 10). CV: koefisien variasi. Perbedaan rata-rata dihitung sebagai RFI rendah versus RFI tinggi. Interval kepercayaan 95% (CI) diperkirakan berdasarkan rata-rata kelompok dan simpangan baku. Perbedaan antar kelompok dievaluasi menggunakan uji t Student.

**Mengingat bahwa lemak abdominal umumnya dianggap sebagai indikator metabolisme pada ayam jenis daging**, tidak ada perbedaan signifikan antara kelompok RFI rendah dan tinggi. Persentase lemak abdominal telah menunjukkan korelasi fenotipik positif dengan RFI pada both ayam broiler (Zhuo et al., 2015; Li et al., 2020; Chen et al., 2021a) maupun ayam tumbuh lambat lokal. Eksperimen persilangan di Ethiopia antara garis ayam tumbuh lambat komersial (SASSO) dan ayam lokal (Koekoek) menunjukkan perbedaan signifikan dalam BW dan FE antara hibrida dan ayam murni, tetapi tidak ada perbedaan dalam persentase lemak abdominal, dengan nilai yang moderat (0,9 hingga 0,8% pada hibrida) (Itafa et al., 2021). Penelitian ini hanya mencakup ayam hibrida dengan latar belakang genetik tumbuh lambat, yang menunjukkan tingkat persentase lemak abdominal yang cukup mirip dengan yang ditemukan oleh Itafa et al. (2021). Ini menunjukkan bahwa FE mungkin tidak secara langsung mempengaruhi penumpukan lemak abdominal pada ayam hibrida, yang mungkin memiliki karakteristik metabolik unik dibandingkan garis ayam broiler atau ayam lokal. Selain itu, hubungan antara FE dan persentase lemak abdominal pada hibrida mungkin dipengaruhi oleh efek heterosis yang masih perlu diteliti.

Dalam penelitian ini, ayam KRC yang diklasifikasikan ke dalam kelompok RFI rendah dan tinggi menunjukkan perbedaan yang jelas dalam karakteristik FE. Secara keseluruhan, temuan ini menunjukkan bahwa peningkatan FE (RFI rendah) terutama dip驱动 oleh FI, bukan oleh perbedaan dalam kinerja pertumbuhan, memberikan dasar fisiologis untuk analisis molekuler selanjutnya tentang regulasi metabolik dan neuroendokrin.

**Kualitas Data RNA-seq Hipotalamus**
Hasil RNA-seq dan pemetaan ditampilkan dalam Tabel S2. Rata-rata 41.286.507 bacaan bersih dihasilkan dari jaringan hipotalamus. Bacaan bersih tersebut dipetakan ke genom Gallus gallus -6,0 dengan tingkat pemetaan antara 90,14% hingga 91,70%. Kandungan GC rata-rata dari sampel adalah sekitar 47,64%, sedangkan persentase basis Q20 dan Q30 masing-masing adalah 96,24% dan 90,80%. Berdasarkan tingkat ekspresi gen dari semua sampel pool, peta termal menunjukkan korelasi yang tinggi antar sampel (nilai lebih dari 0,90) (Gambar S1).

Data sekuening transkriptomik tersedia melalui Sequence Read Archive (SRA) dari NCBI dengan nomor akses GSE278826.

**Alasan dan Implikasi dari Strategi Pemelingan**
Dalam penelitian ini, digunakan strategi pemelingan untuk menyeimbangkan kekuatan statistik dengan keterbatasan praktis, termasuk sumber daya dan hasil RNA yang terbatas, sambil memastikan penggunaan hewan yang etis. Strategi pemelingan ini merupakan pendekatan yang efisien secara biaya dan telah banyak diterapkan dalam penelitian RNA-seq yang serupa (Izadnia et al., 2019; Kubota et al., 2023; Teufel dan Sobetzko, 2022). Selain itu, ketika sampel pool representatif, seimbang, dan diproses secara seragam, pemelingan tidak diperkirakan akan memperkenalkan bias sistematis terhadap arah atau besarnya perbedaan pada tingkat kelompok (Takele Assefa et al., 2020). Namun, profil transkriptomik yang dihasilkan mencerminkan pola ekspresi rata-rata pada tingkat kelompok, sehingga harus diinterpretasikan pada tingkat populasi, bukan sebagai indikator respons individu.

**Validasi dengan RT-qPCR**
Validasi dilakukan menggunakan sampel RNA pool yang sama yang digunakan untuk analisis RNA-seq. Dengan demikian, hasil ini memberikan konfirmasi teknis mengenai konsistensi pengurutan, bukan validasi biologis yang independen pada tingkat individu. Rincian skema pemelingan RNA, termasuk penugasan individu unggas ke masing-masing sampel pool, kini tersedia dalam Tabel S3.

**Gen dengan Ekspresi Diferensial**
Totalnya 15.053 gen ditemukan di hipotalamus dengan RPKM > 1. Dari gen-gen yang ditemukan, 516 gen unik untuk kelompok RFI rendah dan 410 gen unik untuk kelompok RFI tinggi, serta 14.127 gen diekspresikan bersama di kedua kelompok (Gambar 1A). Setelah perbandingan, 257 gen dianggap sebagai DEGs yang signifikan antara kelompok RFI rendah dan tinggi dengan nilai P < 0,05 dan |log 2-fold change| > 1. Di antara DEGs tersebut, 138 gen meningkat dan 119 gen menurun (Gambar 1B); nilai ekspresinya disediakan dalam Tabel S4. Hasil analisis DEG mendukung hipotesis kami bahwa variasi dalam FE terrefleksikan dalam ekspresi gen pada tingkat hipotalamus. Pembahasan rinci tentang hasil ini disediakan di bagian berikutnya.

**Umpan Turun**: Unduh gambar beresolusi tinggi (196KB)
**Unduh gambar berukuran penuh**

**Gambar 1.** Diagram Venn menunjukkan jumlah gen yang diekspresikan (A) dan grafik gunung berapi (B) dari gen yang diekspresikan secara diferensial (DEGs) dalam jaringan hipotalamus antara kelompok RFI rendah dan tinggi.

**Klasifikasi GO dari DEGs**
Untuk memahami klasifikasi fungsional DEGs, dilakukan analisis GO dan KEGG terhadap 257 DEGs. Totalnya 113 terminologi yang signifikan ditemukan, termasuk kategori proses biologis (BP), komponen seluler (CC), dan fungsi molekuler (MF) (Tabel S5). DEGs terutama diperkaya dalam terminologi BP dan MF antara kelompok RFI rendah dan tinggi (Gambar 2). Di antara terminologi BP, sebagian besar DEGs terkait dengan respons terhadap zat beracun (GO:0009636), transportasi amonium (GO:0015696), proses metabolik senyawa yang mengandung fenol (GO:0018958), proses biosintesis senyawa yang mengandung fenol (GO:0046189), dan proses metabolik asam amino aromatik (GO:0009072). Jumlah DEGs terbesar dalam terminologi MF terkait dengan aktivitas pengangkut solut: natrium (GO:0015370), aktivitas pengangkut neurotransmiter (GO:0005328), dan aktivitas pengangkut amonium melintasi membran (GO:0008519).

**Gambar 2.** Analisis enkripsi ontologi (GO) terhadap 15 gen dengan ekspresi diferensial (DEGs) dalam jaringan hipotalamus. BP: proses biologis; CC: komponen seluler; MF: fungsi molekuler. Terminologi ditemukan dari DEGs dalam jaringan hipotalamus kelompok RFI rendah dibandingkan kelompok RFI tinggi.

Menariknya, DEGs terutama terkait dengan proses metabolik dan aktivitas pengangkut antara kelompok RFI rendah dan tinggi. Mengingat hipotalamus memainkan peran sentral dalam regulasi nafsu makan dengan memintegrasikan, mengoordinasikan, dan mengirimkan sinyal terkait nutrisi dari sistem perifer dan sentral (Liu et al., 2019), proses metabolik dalam jaringan hipotalamus kemungkinan besar berkontribusi pada modulasi perilaku pemakanan pada unggas (Guo et al., 2024). Regulasi ini terjadi melalui interaksi antara hormon neuron, reseptor, dan sensor substrat, yang mungkin mempengaruhi respons pemakanan (Seong et al., 2019). Penelitian pada ayam menunjukkan bahwa interaksi ligand-neuroaktif-reseptor mengontrol asupan makanan dan eksperimen energi dengan mengoordinasikan berbagaiGCH1是首个催化并限制通过从头合成叶酸途径（de novo folate pathway）的代谢流的酶（Auerbach等人，2000年）。有报道称，GCH1和TH（一种限制多巴胺（DA）合成的限速酶）可以改善多巴胺缺乏小鼠的摄食行为（Sotak等人，2005年）。TPH2是下丘脑中与食欲相关的基因，它通过血清素能突触和催产素信号通路调节肠道运动（Miao等人，2021年）。在给肉鸡添加甜味剂（诱导食欲）后，TPH2的mRNA表达下降（Jiang等人，2021年）。因此，通过调节从头合成叶酸生物合成途径的代谢流和能量，可以改变下丘脑中GCH1、TPH2和TH的表达，从而控制食欲。这种调节可能解释了低摄入量（RFI）组和高摄入量组之间观察到的食欲差异。此外，我们发现参与酪氨酸代谢的差异表达基因（DEGs）上调，包括DDC、TH和FAH。DDC和TH通过酪氨酸代谢参与DA的合成（Wang等人，2023年）。TH是从酪氨酸合成儿茶酚胺（多巴胺、去甲肾上腺素、肾上腺素）的限速步骤。色氨酸羟化酶（TPH），尤其是外周的TPH1和大脑中的TPH2，是合成血清素（一种吲哚胺）的限速酶（Wickramasuriya和Lyte，2025年）。DA是大脑中最丰富的儿茶酚胺类神经递质，它控制着多种认知功能、运动技能、食物摄入、内分泌调节和基于奖励的学习（Baik，2021年）。在鸡中，DA通过连接海马区的神经元基因表达来影响对喂养条件的反应（Chen等人，2021b）。FAH是酪氨酸代谢途径的最后一步的催化酶，它将富马酰乙酰乙酸转化为乙酰乙酸和富马酸。因此，酪氨酸代谢途径中DDC、TH和FAH的上调可能导致大脑中的神经或生化变化，进而改变喂养行为（Moore等人，2017年），这可能解释了低RFI组和高RFI组之间观察到的食欲差异。下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴是控制人类和动物喂养行为的关键神经内分泌系统（Cascino等人，2023年）。动物通过增加代谢率来应对压力，从而通过HPA轴调节糖皮质激素的分泌来增强能量消耗和利用。在本研究中，DDC、TPH2和色氨酸2,3-双加氧酶（TDO2）在依赖糖皮质激素水平的色氨酸代谢途径中富集。TDO2在催化犬尿氨酸途径（主要的色氨酸代谢途径）的第一步和限速步骤中起关键作用，而DDC和TPH影响血清素的合成速率（主要的色氨酸代谢途径）（Neavin等人，2018年）。在鸡中，血清素能系统参与多种生理功能调节，例如抑制喂养行为，导致能量消耗增加（Saadoun和Cabrera，2002年）。有趣的是，在低RFI的鸡中，DDC、TPH2和TDO2上调。大鼠的研究表明，促甲状腺激素释放激素受体（TRHR）对于介导TRH的激活和抗抑郁样效应至关重要，可能通过复杂的细胞内信号通路间接或直接刺激血清素能活性（Chávez等人，2022年）。我们之前的研究表明，参与代谢调节的垂体基因TRHR3在低RFI的KRC组中显著下调（Sinpru等人，2025年）。TRHR3由下丘脑的TRH激活，随后引发由RGS蛋白介导的细胞内信号级联反应，这些蛋白在调节下游代谢过程中起重要作用（Cheng等人，2023年）。总的来说，这些发现表明低RFI的鸡可能通过增强血清素能通路的调节更有效地利用能量，可能涉及TRHR介导的信号传递。鉴于HPA轴在调节应激诱导的糖皮质激素分泌和喂养行为中的核心作用，未来的研究应纳入更广泛的应激相关激素（如皮质酮和促肾上腺皮质激素），并对同一只个体的多组织（如下丘脑和肠道）进行综合分析。此外，需要实验验证方法，如靶向基因表达测定或功能研究，以确认这些通路在喂养行为中的因果作用。重要的是要认识到，食欲是一个由多个生理系统调节的多方面特征。除了中枢食欲调节外，肠道功能、营养素消化率和外周营养素感知也起着关键作用。胃肠道是营养素消化、吸收和感知的中心，是决定食欲的主要因素。最近在肉鸡中的研究表明，肠道形态（包括绒毛高度、隐窝深度和吸收表面积）以及紧密连接结构的完整性、营养转运蛋白表达与食欲变化密切相关（Beauclercq等人，2018年；Xiao等人，2021年）。具有良好食欲的鸟类通常表现出增强的肠道屏障功能、更有效的营养素吸收和优化的肠道微生物群组成，这些因素共同促进了营养利用的提高和维持能量的减少（Beauclercq等人，2018年）。我们的研究小组之前研究了肠道组织在KRC中调节食欲的作用。Sinpru等人（2021年）对不同RFI的鸡的空肠组织进行了RNA-seq分析，识别出与营养转运、免疫功能和代谢过程相关的DEGs。同样，Kaewsatuan等人（2022年）报告称，高摄入量和低摄入量组的十二指肠转录组存在差异，特别是在与紧密连接结构完整性、糖酵解和营养素吸收相关的通路中。Kongthungmon等人（2025年）发现，低RFI的鸡表现出改善的食欲，伴随紧密连接相关基因（ACTN1和TUBA3E）的上调、ACTN1蛋白表达增加以及更紧密且结构更完整的紧密连接。这些研究共同强调了肠道功能在KRC中决定食欲的重要性，而本研究则重点关注下丘脑，以阐明缓慢生长KRC中外周代谢信号在食欲调节中的整合作用。众所周知，肠道-大脑轴代表了一个双向通信网络，其中外周信号影响下丘脑的基因表达和神经递质合成，而中枢神经系统的输出（通过自主神经支配和神经内分泌通路）调节肠道运动、分泌、屏障功能和微生物群组成（Jiang等人，2021年；Bai等人，2024年）。如前所述，我们的研究小组已经对KRC的空肠（Sinpru等人，2021年）和十二指肠（Kaewsatuan等人，2022年）组织进行了转录组分析。尽管这些研究没有具体报告当前下丘脑分析中确定的三个KEGG通路（叶酸生物合成、酪氨酸代谢和色氨酸代谢）的富集，但在肠道组织中识别的代谢基因与营养代谢过程相关。这表明相关的或组织特异的通路也可能在肠道中活跃。因此，对同一只个体的下丘脑和胃肠道进行整合的多组织转录组分析对于阐明KRC中食欲的协调机制至关重要。

为了深入了解与食欲相关的差异表达基因（DEGs），我们基于STRING数据库进行了蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析（图3）。结果发现五个DEGs（GCH1、TPH2、DDC、TH和FAH）高度相关，并可能参与调节影响食欲的喂养行为。这一发现得到了先前研究的支持，该研究表明GCH1通过反馈抑制在调节四氢生物蝶呤合成中起关键作用，从而影响下丘脑中与食欲相关的代谢通路（Harada等人，1993年）。TPH2是大脑中血清素合成的限速酶，对血清素的产生至关重要（Ottenhof等人，2018年）。尽管TPH2在鸡中的调节机制尚不完全清楚，但已知血清素会影响与睡眠、情绪和食物摄入量（FI）相关的稳态系统（Pereira等人，2020年）。TH是DA合成的限速酶，下丘脑中的DA水平对调节食欲和食欲的神经内分泌功能至关重要（Lechan和Fekete，2005年）。此外，DA与HPA轴的相互作用也调节喂养反应，因为控制FI的神经回路汇聚在室旁核，其中包含表达促甲状腺激素释放激素和尿皮质素的神经元（Belda和Armario，2009年；Maniam和Morris，2012年）。我们的结果表明，组间RFI的变化可能与PPI网络中识别出的五个基因有关，这些基因与其他基因紧密相连，并且与RFI高度相关。

为了验证从RNA-seq数据统计比较中获得的差异表达值，我们进行了RT-qPCR来验证参与食欲调节的DEGs。根据它们的高连接性和在调节喂养行为中的作用，选择了五个基因（GCH1、TPH2、DDC、TH和FAH）。图4显示，RT-qPCR得到的表达模式与这些基因在低RFI组和高RFI组之间的RNA-seq结果一致。这些发现证实了所有五个基因在两组之间都有差异表达，突显了本研究RNA-seq结果的高重现性和可靠性。

为了验证差异表达基因（DEGs）的真实性，我们使用RT-qPCR进行了验证。选择五个基因（GCH1、TPH2、DDC、TH和FAH），因为它们在调节喂养行为的网络中具有高连接性。图4显示，RT-qPCR得到的表达模式与低RFI组和高RFI组之间RNA-seq的结果一致。这些发现证实了所有五个基因在两组之间都有差异表达，进一步证明了RNA-seq结果的高可靠性和可重复性。

TPH2、DDC和TH基因与三个显著富集的KEGG通路（叶酸生物合成、酪氨酸代谢和色氨酸代谢）相关，它们在这些通路中的参与与血浆中DA和ST/5-HT的浓度一致。低RFI组的血浆DA和ST/5-HT浓度显著高于高RFI组（P < 0.01；图5）。这一发现与KEGG通路富集的趋势一致。

血浆中的DA和ST/5-HT浓度是神经递质活性的关键生物标志物（Kim等人，2023年）。在本研究中，血浆DA和ST/5-HT水平与关键基因在富集KEGG通路中的参与一致，表明下丘脑中的单胺（DA和ST/5-HT）的合成和代谢可能解释了KRC中RFI的差异。值得注意的是，低RFI组中上调的基因TPH2、DDC和TH在叶酸生物合成、酪氨酸代谢和色氨酸代谢相关通路中富集，这与该组中较高的血浆DA和ST/5-HT浓度一致。然而，血浆中的神经递质水平是间接测量值，可能无法反映下丘脑的突触活动，因为受到血脑屏障的限制。因此，这些发现为神经递质相关代谢通路在食欲中的作用提供了支持性而非因果证据。尽管如此，它们为未来研究缓慢生长鸡的食欲分子机制提供了有用的框架。

据我们所知，这是首次报道慢生长鸡下丘脑组织中不同食欲的全局基因表达。本研究的综合分析表明，GCH1、TPH2、DDC、TH和FAH是调节喂养行为差异的潜在核心基因。DEGs的功能富集分析表明，影响食欲的分子机制主要与代谢过程和转运蛋白活性有关。KEGG通路分析确定叶酸生物合成、酪氨酸代谢和色氨酸代谢是与KRC食欲相关的显著通路。值得注意的是，低RFI组中上调的基因（TPH2、DDC和TH）在KEGG通路中富集，这与血浆中DA和ST/5-HT的浓度一致。尽管血浆水平是间接的，可能无法反映下丘脑的突触传递，但它们为本研究中识别的代谢通路提供了支持性证据，并为未来研究缓慢生长鸡的食欲机制奠定了理论基础。分析的大规模下丘脑组织样本可能会稀释核特异性信号。未来针对细胞核特异性采样或单细胞技术的进一步研究将对特定神经元群体有所帮助。

作者贡献说明：
Panpradub Sinpru：撰写稿件、审稿与编辑、撰写原始草案、可视化处理、方法论设计、概念构建、数据管理。
Orapin Jantasaeng：撰写稿件、审稿与编辑、撰写原始草案、方法论设计、概念构建、数据管理、可视化处理。
Phocharapon Pasri：撰写稿件、审稿与编辑、方法论设计。
Boonyarit Kamkrathok：撰写稿件、审稿与编辑、方法论设计。
Saknarin Pengsanthia：撰写稿件、审稿与编辑、软件开发。
Tom E. Porter：撰写稿件、审稿与编辑、项目监督、研究指导。
Wittawat Molee：撰写稿件、审稿与编辑、研究指导、项目监督。
Amonrat Molee：撰写稿件、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、概念构建、项目管理、资源协调。