健康中国儿童中41种血清生化指标参考区间的建立

《Practical Laboratory Medicine》：Establishment of Reference Intervals for 41 Serum Biochemical Analytes in Healthy Chinese Children

　　刘秦兰|张秀发|庄玲|王一丹|陈贤|王锋
临床实验室。深圳市宝安区妇女儿童医院。中国深圳市宝安区玉乐路56号，518100

**摘要**
**目的**
由于缺乏适合儿童的参考区间（RI），本研究试图为健康中国儿童的血清生化分析物建立年龄特异性的RI。

**方法**
从28天到17岁的儿童中，在深圳市宝安区妇女儿童医院收集了2627份剩余血清样本。使用Mindray BS-2800M分析仪测量了41种分析物，包括酶、蛋白质、脂质、电解质等。根据临床和实验室标准协会（CLSI）EP28指南进行了离群值去除和RI建立。可视化年龄依赖性轨迹，并将RI与多中心研究结果进行了比较。此外，还通过方程评估了估计的肾小球滤过率（eGFR）的儿童模式。

**结果**
21种分析物显示出明显的年龄依赖性变化，包括肝酶、前白蛋白、胆红素、免疫球蛋白、肾脏生物标志物、心脏酶、铁蛋白和抗链球菌溶血素O。与此同时，电解质、蛋白质、葡萄糖和其他贫血标志物在不同年龄段保持稳定。36种分析物的RI与比较研究基本一致，尽管甘油三酯和抗链球菌溶血素O存在定量差异。在806名儿童中，eGFR在出生后的前两年内迅速增加，不同公式之间的变异性较大。欧洲肾脏功能联盟方程产生的分布模式与比较研究的测量范围最为接近。

**结论**
本研究为41种血清分析物建立了全面的儿童生化RI，其中21种表现出明显的年龄依赖性变化。与标志性研究的比较显示，36种分析物的一致性良好。在选择eGFR方程时需要谨慎，特别是在幼儿中。这些RI为支持跨区域标准化提供了可靠的证据，并有助于减少在儿童中不适当使用参考值的情况。

**引言**
参考区间（RI）对于准确解释实验室结果和指导临床决策至关重要。依赖不适当的RI可能会导致将个体错误分类为患病或健康，从而可能导致漏诊、不必要的随访或错误的治疗。因此，建立可靠的RI是临床实验室的基本职责。临床和实验室标准协会（CLSI）的EP28-A3c指南仍然是最广泛采用的框架[1]，为定义、建立和验证RI提供了标准化流程。虽然RI的概念很简单，但构建考虑到年龄、性别和区域差异的代表性区间实际上很有挑战性。在儿童特定的RI方面仍存在关键差距，大多数临床实验室仍然根据成人人群的区间来解释儿童的生化检测结果[2],[3]。这种做法存在问题，因为儿童的分析物浓度随年龄和发展阶段显著变化，使用基于成人的RI存在显著的误诊风险。几项重要倡议试图填补这一差距。CALIPER（加拿大儿科参考区间实验室倡议）项目前瞻性地为加拿大儿童的实验室生物标志物建立了全面的年龄和性别特异性RI数据库[4]，为全球儿科RI研究树立了标杆。在中国，PRINCE（中国儿科参考区间）研究基于大规模多中心儿童队列提供了14种生化标志物的权威RI[5]，为中国儿童人群提供了宝贵的参考[6]。尽管有这些贡献，生化分析物的覆盖范围仍然有限[6]。因此，迫切需要可靠的儿童RI。此外，到目前为止，还没有为Mindray（中国深圳）系统完全报告儿童RI。认识到这一差距，本研究旨在使用BS-2800M化学分析仪为广泛的血清生化分析物建立全面的儿童RI，从而提供参考数据，以支持更准确的临床诊断和健康评估。

**方法与材料**
2.1. 样本收集
2023年3月至2024年6月，在深圳市宝安区妇女儿童医院的临床实验室收集了剩余血清样本。样本来自28天至17岁的健康儿童，他们正在接受常规体检。我们应用了以下纳入标准：(1) 显然健康的儿童，年龄在28天至17岁之间，体检结果正常；(2) 前两周内未使用任何药物；(3) 无心脏病史、慢性疾病史、肾脏损伤史、遗传性代谢紊乱史、自身免疫疾病史或恶性肿瘤史。排除标准包括：(1) 腹部超声显示肝脏、脾脏或肾脏的结构或形态异常；(2) 诊断出先天性疾病的儿童；(3) 两周内出现发热或急性严重疾病；(4) 过去一个月内进行过大手术；(5) 有输血史或严重内出血史。采用基于关键发育阶段的分层样本收集策略，尽可能覆盖所有年龄段的儿童。在样本收集之前，根据公认的生长发育阶段，将目标儿童群体前瞻性地划分为七个预定义的年龄组：婴儿期（哺乳期：28天－<6个月；断奶期：6个月－<1岁）、幼儿期（1岁－<3岁）、学龄前期（3岁－<6岁）、学龄期（6岁－<9岁）、青春期前期（9岁－<12岁）和青春期（12岁－<18岁）。RI的最终年龄划分取决于每种分析物的分布特征和统计差异。

2.2. 分析物选择
选择了41种血清测试分析物来建立儿童RI，包括肝功能分析物[天冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰转移酶（γ-GT）、总蛋白（TP）、白蛋白（Alb）、前白蛋白（PA）、总胆红素（TBIL）和直接胆红素（DBIL）]、肾功能分析物[肌酐（Crea）、尿素（Urea）、尿酸（UA）和胱抑素C（CysC]、脂质测试[总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）]、心血管分析物[肌酸激酶（CK）、肌酸激酶MB亚型（CK-MB）、乳酸脱氢酶（LDH）、α-羟基丁酸脱氢酶（α-HBDH）和肌红蛋白（MYO]、离子分析物[钾（K）、钠（Na）、氯（Cl）、钙（Ca）、镁（Mg）、磷酸盐（P）、二氧化碳（CO2]、特定蛋白质分析物[免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白A（IgA）和免疫球蛋白E（IgE]、葡萄糖[葡萄糖氧化酶法（Glu-GOD）和己糖激酶法（Glu-HK]、贫血分析物[铁（Fe）、铁蛋白（FER）、转铁蛋白（TRF）、不饱和铁结合力（UIBC）和总铁结合力（TIBC）]以及风湿病分析物[抗链球菌溶血素O（ASO）]。血清样本的收集、处理和储存按照H18-A3文档中的规格进行[7]。这些分析物的试剂均来自Mindray（中国深圳），TIBC是一个计算参数。一旦确定了血清Fe和UIBC的值，TIBC通过以下公式计算：TIBC = Fe + UIBC。

2.3. 样本检测过程
所有样本都在同一天收集并检测，以确保新鲜度，并在收集后两小时内使用Mindray BS-2800M化学分析仪和配套试剂在深圳市宝安区妇女儿童医院的临床实验室完成检测。检测后，样本冷藏三天。校准过程和样本检测按照制造商的说明进行。关于可追溯性，带有参考材料的生化分析物可追溯到参考材料，没有参考材料的生化分析物可追溯到参考方法。本研究中使用的生化分析物的缩写、方法和可追溯性列在补充表1（表S1）中。校准物和对照的信息列在表S2中。

2.4. 质量控制
排除了溶血、黄疸和高脂血症的样本。样本分析在深圳市宝安区妇女儿童医院的临床实验室进行。该实验室于2018年通过了中国国家认可服务（CNAS）的现场评估，并于2021年获得了ISO15189医学实验室认证。所使用的化学分析仪由制造商进行了预防性维护，以确保检测系统的性能符合要求，包括精度、准确性、分析测量范围、携带污染等[8],[9]。

2.5. 数据处理和参考区间建立
该过程按照临床实验室标准协会（CLSI）发布的EP28-A3c[1]指南进行。在分析前进行了数据清洗（清洗对象包括异常负值或输入错误的数据，以及缺少任何年龄或性别的数据）。按年龄绘制了参考值分布图，并按性别分开显示每个参数。通过Kolmogorov-Smirnov检验确定了每个分析物测量值的正态性。首先在总体人群中筛选出离群值。对于正态和偏态分布数据，使用Tukey方法消除离群值；对于偏态分布数据，使用Dixon方法消除离群值。考虑到与年龄相关的生理变化，通过基于分布散点图的视觉验证补充了初步识别的离群值，以确保整体筛选不会无意中掩盖特定年龄变化内的离群值。然后，通过视觉检查散点图来识别明显偏离每个预定义年龄组主要群体的潜在离群值，并进行统计确认和移除。这种结合方法最小化了儿童人群中主观消除错误的可能性。

2.6. 儿童特定划分
年龄特定划分采用了两步法。首先，根据性别分层，视觉检查测试数据与年龄的散点图，以识别每个参数的趋势和拐点。如果通过视觉检查观察到分析物的测量值随年龄或性别有显著变化，则初步考虑进行年龄/性别划分。对于趋势和拐点与预定义的生理发育组不同的参数，进行了重新分组评估以进一步分析。然后应用Harris-Boyd方法确定年龄划分的必要性。对于每对相邻的年龄组，通过标准差（s）、平均值（x）和样本量（n）计算z值。并根据相邻两组的样本量计算临界值（z*）。如果计算的z值超过临界z值（z > z*），则表明两组之间存在统计学上的显著差异，建议进行划分。如果测试不显著（z ≤ z*），则考虑合并这些组。此外，如果一个子组中的标准差大于下一个子组的1.5倍，也建议进行分组。之后，使用One-way ANOVA与Student-Newman-Keuls（SNK）事后检验进行补充验证，以确认最终划分的组在统计上是不同的。对于性别划分，使用Mann-Whitney U检验分析每个最终年龄组内男性和女性之间的统计差异。根据EP28-A3c的指导，对于样本量至少为120的子组，采用非参数方法估计每个参数的参考限值。对于样本量小于120的子组，应用Box–Cox变换来近似正态性，通过最大似然估计最佳变换参数λ。随后，使用稳健方法计算参考限值。RI的单侧性或双侧性由每个分析物的临床决策阈值决定。对于同时显示异常升高和降低的分析物，建立了双侧RI（第25和第97.5百分位数）。对于仅在异常升高或降低时显示疾病的分析物，建立了单侧RI（第5或第95百分位数）。为两个参考限值计算了90%置信区间（CIs）。统计分析使用Medcalc（版本22，比利时奥斯滕德。https://www.medcalc.org）和Graphpad Prism（版本10.1.2，美国圣地亚哥。www.graphpad.com）进行。

2.7. 儿童估计肾小球滤过率的评估
为了评估不同发育阶段估计的肾小球滤过率（eGFR）的年龄依赖性轨迹，分别使用了7个报告的方程来计算eGFR，包括慢性肾病流行病学协作组（CKD-EPI）Crea-CysC[10],[11]、Schwartz Bedside[12]、欧洲肾脏功能联盟（EKFC）[13]、儿童慢性肾病（CKiD）U25[14]、Counahan-Barratt公式[15]、高加索和亚洲儿童及成人（CAPA）[16]、全年龄范围（FAS）[17],[18]，如表S3所示。使用局部加权散点图平滑（LOWESS）回归绘制散点图，以捕捉三种方程计算的eGFR随年龄的非线性生理趋势，并按性别分层。使用小提琴图和核密度估计（KDE）来评估结果的总体分布和中心趋势，提供了概率密度、中位数、四分位距（IQR）和潜在估计的全面可视化。所有图形可视化和统计图表都是使用Python（带有matplotlib和seaborn库）生成的。

**结果**
3.1. 参考人群的一般信息
本研究的分析过程如图1所示。共有2627份儿童血清样本被纳入，用于根据纳入和排除标准建立RI，其中包括1453名男孩和1174名女孩。按预定义的七个组划分的样本大小显示在表S4中。由于同一试管中的剩余样本血量有限，无法同时满足所有分析的需求，因此样本分三次批进行检测。每批样本的样本量和检测的分析物详细信息见表S5。所有批次都进行了日常内部质量控制，当质量控制值在规格范围内时，结果被接受。每个分析物的原始样本量显示在表S6中。下载：下载高分辨率图像（478KB）下载：下载全尺寸图像

图1. 本研究中建立参考区间（RI）的流程图。

3.2. 血清生化RI的分布模式
如表1所总结的，为41种血清生化分析物建立了RI。其中，21种分析物显示出明显的年龄依赖性动态变化，包括肝脏参数（AST、ALT、ALP、γ-GT、PA、TBIL、DBIL）、肾脏参数（Crea、Urea、UA、CysC）、心血管参数（LDH、CK-MB、α-HBDH、MYO）、免疫球蛋白（IgA、IgG、IgE、IgM）以及其他参数（FER、ASO）。其他指标，如离子（Ca、Mg、P、Na、K、Cl）、蛋白质（Alb、TP）、葡萄糖和贫血参数（Fe、TRF、UIBC、TIBC）的变化相对稳定。具有年龄依赖性变化的分析物的分布图显示在图2中。

表1. 中国深圳明显健康体检儿童血清临床生化分析物的RI
| 分析物 | 单位 | 组 | n | 平均值 | 中位数 | LL90% CI | UL90% CI |
|--------------|------------|---------|---------|---------|---------|----------|
| AST | U/L | 28天<1岁 | 26 | 22.15 | 40.67 | 75.70 | 20.48 | -25.37 | 70.77 | -80.76 |
| ALT | U/L | 28天<1岁 | 12 | 39.94 | 39.61 | 24.48 | 55.68 | 22.03 | -28.47 | 53.31 | -62.33 |
| ALP | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| γ-GT | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| PA | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| TBIL | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| DBIL | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Crea | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| UA | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| FER | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| TRF | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| TIBC | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| LDH | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| α-HBDH | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| CK-MB | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| MYO | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgA | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgG | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgE | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| CK | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Fe | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| TRF | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| TIBC | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| HBsAg | ng/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| ASO | IU/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Urea | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| UA | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Ca | mmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Mg | mmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| P | mmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| P | mmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| CO2 | mmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgA | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgM | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgG | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| IgE | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| CK | U/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| LDL-C | mmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| HDL-C | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Glu-HK | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| Glu | mg/mL | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| TBIL | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 | 44.81 | 20.65 | -22.82 | 43.32 | -45.61 |
| DBIL | μmol/L | 28天<1岁 | 80 | 131.34 | 30.94 | 21.91 例如，我们队列中TG的血浆水平上限（UL）几乎是Mayo、Tietz教科书和Gregory教科书所报告值的2到3倍[26]，尽管略低于CALIPER的数据。这些差异可能源于分析前的因素，如禁食条件、饮食摄入量、从母乳喂养过渡到固体食物期间的特定人群饮食结构，以及不同的统计年龄分组模型。同样，ASO的血浆水平上限也随年龄增长而增加，但6至<18岁组的数据远低于Mayo的限值。这种显著差异可能反映了A组链球菌感染的地区流行率差异或各种免疫测定方法（例如浊度法与散射比浊度法）之间的分析差异。数据分布分析显示至少有21种分析物的年龄依赖性差异。在儿科肝病学评估中，比较不同研究中酶（如AST、ALT、ALP）的结果时，应仔细审查分析因素。这些差异往往取决于实验室是否使用吡哆醛-5'-磷酸激活方法或不同的孵育温度。本研究结果显示，AST和ALT水平在28天至1岁期间达到峰值，随后逐渐下降。与PRINCE和CALIPER研究一致，青少年时期男女之间的AST和ALT水平存在差异，男性的水平大约是女性的1.2倍，这与PRINCE和CALIPER的研究结果一致。对于ALT，男性和女性的比例是1.6倍，与PRINCE研究的结果一致。相比之下，CALIPER报告的性别差异较小（1.1倍），反映了不同地区发育过程中性别差异的潜在人群特异性。Bussler等人[27]也发现血清转氨酶水平遵循特定的年龄趋势，特别是在青春期更为明显。ALP的轨迹更为复杂且波动较大，在6个月之前显著增加（大约是6-12个月组的1.4倍）。我们研究中的血浆水平上限与CALIPER和PRINCE的结果基本一致。此后，6个月以上的ALP水平逐渐下降，从1岁开始再次逐渐上升直至15岁。青少年时期，男性的ALP水平大约是女性的1.4倍，与PRINCE研究（1.3倍）一致，但低于CALIPER的1.8倍，反映了这一时期性别间骨骼成熟的差异。由于我们研究中青少年参与者数量有限（尤其是15岁以上的），进一步进行性别分层分析受到限制。作为参考，PRINCE和CALIPER研究在这个人群中报告的男女性ALP比例约为1.5到1.7倍。Li等人的其他研究也发现了儿童ALP的复杂变化[28]。上述分布特征强调了在分析生化分析物的年龄相关趋势时，也应考虑性别特异性差异（特别是在青春期）。与PRINCE研究一致，中国儿童的γ-GT血浆水平上限在6个月之前显著较高，之后下降了约78%。相比之下，CALIPER和Mayo的报告指出γ-GT的高水平持续时间超过了1岁，反映了该分析物在儿童人群中发育模式的地区差异。前白蛋白水平随年龄持续增加，尽管我们研究中确定的参考区间（RI）通常低于CALIPER报告的区间。关于胆红素代谢，TBIL和DBIL在出生后前两个月相对较高，这是由于新生儿肝脏的结合能力尚未成熟。随着肝脏发育，3个月以后胆红素水平下降，1岁以后则平稳上升。与CALIPER相比，我们的研究缺少28天以下新生儿的亚组，这些新生儿的胆红素水平相对较高且具有更大的临床意义。此外，我们研究中1-<12岁组的TBIL血浆水平上限是CALIPER的1.4-1.8倍，而12-<18岁组则接近Mayo的区间。对于DBIL，10-<18岁组的血浆水平上限与CALIPER非常一致。然而，在1岁以下儿童中，我们进一步发现了3-6个月组和6-12个月组之间的差异，而CALIPER的研究中没有进行这种区分。这些年龄特异性差异反映了不同地区之间的生理过程差异，对于确保儿科参考区间的临床准确性至关重要。

在儿科肾功能分析方面，血清肌酐（Crea）浓度在28天至12岁期间保持较低水平，12岁以后升至接近成人的水平，这与婴儿肾脏的功能成熟一致。CALIPER、PRINCE和Mayo的研究也都显示，12-13岁以后肌酐水平有所增加。尽管不同地区之间的具体年龄分组有所不同，但整体变化趋势是一致的。特别是在青春期，男性的肌酐水平略高于女性（约高1.2倍），这突显了青少年肌肉质量发展的性别差异。其他肾功能指标，如尿素（Urea）和尿酸（UA），也随年龄逐渐增加，尤其是在青春期，性别差异也很明显。相反，CysC水平随年龄下降，这与CALIPER的研究结果一致。考虑到肌酐和CysC的配对结果，以及估算肾小球滤过率（GFR）的固有挑战（因为使用外源性清除标志物（如碘海醇或菊粉）进行直接测量具有侵入性、劳动强度高且不适用于常规临床护理），肾脏病学界几乎完全依赖内源性生物标志物为基础的估算公式。因此，我们扩展了分析范围，使用一系列已建立的公式来描述eGFR的年龄依赖性分布。尽管许多研究团队（如CKiD、FAS、EKFC）和先驱者（如Schwartz和Counahan）开发了多种公式来填补这一空白，但由于儿童期的发育变化，不同年龄段的结果仍有差异[29]。分布图显示，所有公式都捕捉到了eGFR在前两年的快速增加，但其绝对值和发展轨迹存在显著差异。值得注意的是，EKFCrea-CysC和Schwartz Bedside公式在临床范围90-120 mL/min/1.73 m2内表现出最集中的分布。Hu等人[15]的一项近期研究针对4.3-9.2岁的中国非慢性肾病（CKD）儿童直接测量了mGFR，并确定了89.3-110.7 mL/min/1.73 m2的参考范围（中位数：100.7 mL/min/1.73 m2）。在我们的分析中，这个年龄段范围内，EKFC公式生成的数据分布（4-9岁组的第25-95百分位数：84.0-111.7 mL/min/1.73 m2）与Hu等人的结果非常接近。这种高度一致性表明，EKFC公式有效地反映了中国儿童群体的肾脏生理生长模式。此外，我们的数据还揭示了某些公式在应用于特定年龄时的评估偏差。CKD-EPICrea-CysC公式主要针对成人进行校准，系统性地高估了1至9岁儿童的肾功能，经常产生超过超滤阈值120 mL/min/1.73 m2的估计值，这可能是由于采用了成人系数。有趣的是，当进入青春期时，其估计值接近正常范围[30]。同时，CKiD U25Crea-CysC公式普遍显示出向右偏斜的趋势，系统性地产生较低的估计值。CAPA公式严重依赖于胱氨酸C，在2岁以上儿童中显示出异常的持续下降。2岁以下儿童在某些模型中成为一个特别的“灰色区域”。与原始用户建议一致，EKFC公式倾向于高估较小年龄儿童的eGFR。FASCrea-CysC和U25公式对早期年龄波动过于敏感，经常在1岁以下婴儿中产生低于80 mL/min/1.73 m2的估计值。这种整体不稳定性凸显了早期肾发育难以完美评估的局限性。然而，随着儿童进入青春期，大多数公式的估计值趋于一致，反映了肾脏生理向成人水平的稳定。这些扩展性发现通过描绘这些公式在中国儿童不同年龄段的分布特征，提供了一个横断面映射。这表明在使用基于公式的eGFR评估时应全面考虑其年龄适用性，并在早期婴儿期解释公式得出的eGFR时需要格外谨慎。

尽管儿童的心血管功能在发育过程中迅速成熟，但大多数心脏功能生物标志物的临床参考标准都是基于成人数据建立的，这使得准确评估儿童的心肌酶谱变得困难[31]。我们关于心肌酶（如LDH、α-HBDH、CK-MB和MYO）的结果显示，在3岁以内这些酶的水平显著增加，随后逐渐降至成人水平。特别是LDH，本研究中总参考区间与CALIPER和Mayo的结果非常接近，但分组上有细微差异。本研究中的LDH血浆水平上限在3岁以后逐渐下降，而其他研究则在1岁以后开始下降。然而，α-HBDH、CK-MB和MYO在上述研究中未有所报道。因此，我们的研究结果可能有助于更好地理解儿童人群中心肌酶标志物的发育模式。关于其他参数，儿童的免疫球蛋白表现出更明显的动态变化。IgA、IgG、IgM和IgE的水平在1岁时显著较低，随着年龄增长逐渐增加，并显示出更高的敏感性。在本研究中，每种免疫球蛋白被分为六到七个年龄亚组，而Mayo使用了更多的亚组，从而能够更详细地描述年龄相关趋势。每个年龄亚组的IgG和IgM参考区间与Mayo报告的区间基本一致。相比之下，IgA水平随年龄增加2到7倍，而IgE随年龄增加6到25倍，老年组的血浆水平上限低于Mayo的数值。总的来说，这些发现揭示了儿童免疫功能谱的发育特征，并强调了提高免疫球蛋白测量灵敏度的必要性，尤其是在较年幼的儿童中。在贫血指标方面，6个月初的FER水平升高，主要是由于早期铁稳态调节机制不完善。与CALIPER研究相比，本研究中初始6个月组的血浆水平上限低约20%。在6-<18岁组中，区间表现出性别差异，血浆水平上限大约是CALIPER的两倍，接近Tietz报告的数值。相比之下，Mayo发布的区间没有包括年龄分组。其他标志物，如铁（Fe）、总铁结合蛋白（TRF）和铁蛋白结合能力（TIBC），表现出相对较低的年龄敏感性，我们的发现与Mayo和CALIPER的研究结果大致一致。在葡萄糖评估方面，我们发现确定的血浆水平上限低于Mayo的区间，略高于Tietz的区间，但接近Bohn等人的结果。此外，我们量化了HK和GOD方法之间的方法学差异。这两种方法得出的参考区间高度一致，证实了这些特定分析差异在儿童人群中引起的临床变化可以忽略不计。

在与其他研究的进一步比较中，我们还注意到Zhong等人[32]使用了含PLP和不含PLP的方法报告了ALT结果。所有年龄组中，含PLP方法确定的参考区间始终高于不含PLP的方法，且他们的总体区间略低于我们研究的区间。值得注意的是，我们研究和PRINCE研究中<1岁组的血浆水平上限约为Zhong等人报告值的1.6倍，这可能是因为他们的研究人群中没有6个月以下的婴儿。对于ALP，他们报告了一个初始下降后上升的复杂趋势，10岁以后出现性别差异。关于肌酐，参考区间使用了苦味酸（Jaffe）方法和酶法来确定。我们发现，在3岁以下儿童中，Jaffe方法的结果高于酶法；而在青春期后，酶法的结果高于Jaffe方法。值得注意的是，酶法得到的结果与我们的研究结果一致。这些发现强调了临床医生在解释转氨酶和肌酐测量结果时需要注意方法相关差异的必要性。尿酸水平随年龄增长而升高，并在青春期表现出性别差异，男性值大约是女性的1.4倍，也高于我们研究中的观察值。CysC随年龄增长呈现下降趋势，这与我们的发现一致，尽管年龄相关的变化并不明显。Zhong等人提供了更详细的IgG、IgA和IgM的年龄分段数据，这些指标均随年龄增长而升高，并在青春期应用了性别特异性分段。他们规定的IgA的参考上限（UL）比我们研究中的高1.3倍。在比较不同地区的数据时，应仔细考虑多个多样性因素[33]，包括样本类型等预分析因素、分析平台、试剂组成和校准溯源性等分析因素，以及种族、地理位置、营养状况等人群特征，这些因素可能会影响分析物分布，尤其是在生长和青春期。此外，年龄和性别分段策略以及技术选择因研究而异。年龄组数量和边界的差异，以及是否提供性别特异性区间，直接影响结果的可比性。由于儿童发育的复杂性，生化分析物的范围表现出更动态的变化[34][35]。多项研究正在探索更合适的儿童年龄分段策略，以减少对任意或经验性分段的依赖，从而缩小研究结果与其直接临床应用之间的差距[36][37]。一些研究团队试图通过基于证据的方法来标准化通用生化分析物的参考区间（RI）[38][39][40]，本研究提供了更多关于中国数据的直接和客观证据，以促进跨区域比较的可行性。然而，这项研究也存在一些局限性。首先，由于实际操作限制，我们无法为每个特定年龄月份或年份招募足够样本，因此最初的样本收集是根据预定义的生理发育阶段进行分层的。但最终每个分析物的年龄分段主要是基于数据分布特性和统计显著性确定的，这可能导致某些分段的样本数量不足。其次，由于采样限制，并非所有分析物和样本同时进行检测。检测分三次进行，每次包含的分析物和样本量有所不同。通过每日质量控制和批内评估确保了同一分析物在不同批次间测试结果的可比性。偶尔，某些分析物的试剂准备不及时，导致可用于分析的样本数量相对有限，例如γ-GT和CO2的样本量较少。第三，本研究的样本量远低于PRINCE（n=12352）和CALIPER（n=9700），尤其是招募的青少年参与者数量有限，这可能影响了这一青少年群体的代表性和估计精度。对于样本量少于40且存在偏态的亚组，如Daly等人[41]所展示的，没有一种方法能统一提供最无偏且最精确的参考区间估计，而稳健的方法可能会伴随更大的偏差和更宽的置信区间。但自助法（bootstrapping）几乎与转换后的参数法一样准确和精确[42]。我们还必须承认另一个局限性，即尽管我们评估了儿童各种eGFR方程的轨迹，但由于缺乏直接测量的mGFR，我们无法确定哪个方程更优。因此，我们无法计算绝对偏差和精度来明确指出哪个方程更优越。此外，本研究仅基于单中心人群，可能会引入选择偏差，不能完全代表不同地理区域的普通儿童群体。在将这些结果推广到其他区域人群时需要谨慎。尽管存在这些局限性，我们的研究为儿童人群中的广泛生化分析物提供了全面的参考区间。我们将多项研究之间的比较证据结合起来，有助于推进跨区域协调研究的进展。未来需要大规模的多中心协作研究来进一步完善这些发现，并促进旨在实现实验室间儿童生化分析物参考区间一致性和标准化的全球协调工作。

**结论**
总之，本研究基于 Mindray 化学分析仪，建立了中国儿童41种血清生化分析物和生化谱型的全面参考区间（RI）。年龄和性别特异性分段显示了21种分析物的不同发育轨迹。与多中心项目的比较显示，多达36种分析物的结果具有良好一致性，支持了我们发现的可推广性。然而，一些差异凸显了预分析、分析和人群特异性因素的影响。此外，我们对儿童特定eGFR方程进行了系统评估，确定EKFC方程在跨研究比较中相对稳健。尽管存在单中心设计和青少年代表性受限等局限性，本研究为中国儿童人群提供了有价值的RI，促进了跨区域协调工作，并为未来研究提供了指导，以进一步完善儿童实验室医学，减少使用不适当RI的风险。

**作者贡献声明**
秦兰（Qinlan Liu）：撰写原始草稿、方法学设计、正式数据分析、概念构思。
张秀发（Xiufa Zhang）：撰写原始草稿、正式数据分析、概念构思。
庄玲（Ling Zhuang）：撰写原始草稿、方法学设计、概念构思。
王一丹（Yidan Wang）：验证、数据调查、数据管理。
陈茜（Xian Chen）：撰写审稿与编辑、资源整理、数据调查。
王峰（Feng Wang）：撰写审稿与编辑、项目监督、项目管理、概念构思。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

**数据可用性声明**
该研究的原始贡献包含在文章中。如需进一步信息，可直接联系相应作者。

**伦理声明**
本研究遵从《赫尔辛基宣言》并获得了深圳市宝安妇女儿童医院伦理委员会的批准（参考编号：LLSC-2022-03-10-05-KS）。对于文章中可能包含的可识别图像或数据，已获得未成年人的书面知情同意以及其父母/监护人的同意。

**资金信息**
本研究的研究、作者身份和/或文章发表得到了资助。该研究得到了广东省中南山医学基金会（ZNSXS-20240021）和深圳市自然科学基金会（JCYJ20220530160015033）的支持。资助机构未参与研究构思、数据提取、数据分析、发表决定或手稿准备。