来自Klebsiella michiganensis的生物絮凝剂的化学性质及其优化：染料脱色效果的阐明及机制研究

《Scientific African》：Chemical properties and optimisation of bioflocculant from Klebsiella michiganensis: Elucidation of dye decolourisation efficacy and mechanisms

　　斯坦利·莫科博罗（Stanley Mokoboro）| 特卢·纳尔逊·塞莱佩（Tlou Nelson Selepe）| 西里尔·特卢·塞莱佩（Cyril Tlou Selepe）| 安科阿纳·伊斯梅尔·蒙加洛（Nkoana Ishmael Mongalo）| 尔索兰库·西德尼·马利埃赫（Tsolanku Sidney Maliehe）| 卡加博·莫加内迪（Kgabo Moganedi）
南非林波波大学（University of Limpopo）生物化学、微生物学和生物技术系，邮政信箱X1106，索文加（Sovenga），0727

**摘要**
来自细菌的絮凝剂被认为是废水处理中化学絮凝剂的有希望的替代品。然而，很少有研究将它们应用于染料脱色并评估其絮凝机制。因此，在这项研究中，对从密歇根克雷伯菌（Klebsiella michiganensis）中提取的絮凝剂BF–PX353943进行了表征、优化，并将其用于染料脱色。扫描电子显微镜（SEM）、高效液相色谱（HPLC）、X射线衍射（XRD）、热重分析（TGA）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）分别用于表征该材料的形态、碳水化合物组成、结晶度、热稳定性（热解行为）和官能团。响应面方法（RSM）被用来优化操作参数，包括pH值、CaCl2浓度、沉淀时间和剂量。通过罐式实验（Jar test）和Zeta电位分析（zeta potential analysis）来评估脱色效率及作用机制。这种生物絮凝剂呈杆状形态，主要由蔗糖（31.90%）和果糖（17.77%）组成。2θ = 45°和84°处的尖锐衍射峰表明其具有结晶性。热重分析显示其具有良好的热稳定性，在600°C热处理后重量损失少于40%。傅里叶变换红外光谱显示其主要官能团为羟基、羧基、羰基和氨基。在最佳条件下（pH 6.8、5% CaCl2、沉淀时间10分钟、剂量1 mg/mL），该生物絮凝剂对刚果红（Congo red）的脱色效率达到71.82%，对亚甲蓝（methylene blue）的脱色效率达到82.17%。BF–PX353943通过阳离子介导的桥接机制实现絮凝作用。总体而言，这项研究表明BF–PX353943是一种有效且环保的生物絮凝剂，在处理含染料废水方面具有巨大潜力，有助于可持续水处理技术的发展。

**引言**
来自各种工业的含染料废水对公众健康和水生生态系统构成严重威胁[1]。其中许多染料已被证实具有毒性、致突变性和致癌性[2]。此外，它们的化学稳定性和抗降解性使得传统的废水处理方法效果较差[3]。因此，迫切需要高效、经济且环保的处理策略。
最近的研究表明，生物絮凝剂能够从水溶液中去除各种类型的染料，包括阴离子、阳离子和非离子化合物[4][5][6][7]。这些生物絮凝剂的絮凝活性（FAs）受操作参数（如pH值、温度、剂量、阳离子浓度和沉淀时间）的显著影响[8]。因此，优化操作条件对于最大化生物絮凝剂的疗效至关重要[9]。使用响应面方法（RSM）等统计工具进行系统优化，可以有效评估参数及其相互作用，从而确定改善生物絮凝剂性能和重现性的最佳条件[10]。这种方法不仅降低了实验成本和时间，还确保了生物絮凝剂在多样化的环境和工艺条件下的可靠应用[11]。
已有许多研究报道了生物絮凝剂在染料去除方面的应用，但效率不一。例如，不同细菌种类产生的生物絮凝剂对刚果红和亚甲蓝等染料的脱色效率较高[12][13][14][15]。然而，这些研究通常主要集中在去除效率上，对生物絮凝剂的全面物理化学特性和絮凝机制的阐明关注不足。此外，操作条件和生物絮凝剂组成的变化使得研究之间的直接比较变得困难。因此，需要结合优化、详细表征和机制分析来更好地理解和提高染料废水处理的性能。
生物絮凝剂的功能效率在很大程度上取决于其特定的物理化学性质。因此，通常使用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和热重分析（TGA）等技术来表征其官能团、键合类型、形态特征和热解谱[16][17][18]。补充的化学组成分析可以识别多糖、蛋白质和其他影响絮凝性能的生物分子的相对含量[19]。这些表征方法共同提供了对生物絮凝剂物理化学特性的全面理解，这对于优化其性能和应用至关重要。
传统絮凝剂的絮凝机制已经较为明确，而生物絮凝剂的絮凝机制则了解较少，部分原因是它们不针对特定污染物。因此，深入研究这些絮凝机制对于优化其在实际处理系统中的应用至关重要。目前的假设主要集中在电荷中和（即具有相反电荷的聚合物与胶体颗粒相互作用）和桥接作用（即聚合物片段吸附在颗粒表面形成环状结构并连接相邻颗粒）[20][21]。
在我们之前的研究中，我们从南非林波波大学的一个鱼塘中分离并优化了产生生物絮凝剂的密歇根克雷伯菌PX353943的培养条件。K. michiganensis产生的生物絮凝剂浓度为1.8 g/L，将其命名为BF–PX353943[22]。在这项研究中，我们探讨了BF–PX353943的特性，优化了其操作条件，并评估了其在合成染料废水中的脱色效率及其絮凝机制。

**材料与方法**
**生物絮凝剂的化学组成**
使用苯酚-硫酸法（以葡萄糖为标准物）测定了生物絮凝剂的总糖含量[23]（Dubois等人，1956年）。使用的试剂包括苯酚（Sigma-Aldrich，南非）、葡萄糖（≥99%）和硫酸（Masiye Laboratories，南非）。在490 nm处测量吸光度。蛋白质含量使用BCA试剂盒（Sigma-Aldrich，南非）根据制造商的方案测定，以牛血清白蛋白（BSA）为标准物。使用Jenway 7205 UV/Vis分光光度计在562 nm处读取吸光度值。

**单糖分析**
利用高效液相色谱（HPLC）测定生物絮凝剂的单糖组成。简要来说，将1 mg/mL的生物絮凝剂溶液制备在蒸馏水中，然后通过0.45 μm膜过滤器过滤以去除颗粒物。使用单糖标准品（Sigma-Aldrich，南非，包括阿拉伯糖、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、甘露糖、核糖、蔗糖和木糖）来识别和定量生物絮凝剂样本中的相应糖类[24]。

**官能团分析**
使用Spectrum Two FTIR光谱仪（Perkin Elmer，Pty LTD）在450–4000 cm?1波数范围内对生物絮凝剂的官能团进行了表征。应用背景减法校正光谱[25]。

**形态结构和元素组成**
使用与计算机连接的Gemini SEM（Sigma 500 VP，Zeiss（Pty）Ltd）分析生物絮凝剂的形态结构和元素组成。将双面对碳带粘贴在样品棒上，并在碳带的另一侧放置研磨后的生物絮凝剂。然后将样品棒放入溅射涂层机中，使其表面镀金。随后将样品棒插入SEM样品室中，在不同放大倍数下观察生物絮凝剂的形态。同样，还对样品进行EDAX分析以确定元素组成[26]。

**生物絮凝剂的结晶度分析**
使用X射线衍射（XRD）分析生物絮凝剂的结晶性质。分析在室温下进行，使用Bruker D8 Advance衍射仪（Bruker AXS，德国卡尔斯鲁厄），配备Cu–Kα辐射（λ = 1.5406 ?），操作电压为40 kV，电流为40 mA。将细磨的生物絮凝剂装载在样品架上，并记录2θ范围为5°至90°的衍射图谱[27]。

**生物絮凝剂的热稳定性分析**
使用热重分析（TGA）确定生物絮凝剂的热稳定性。分析在TGA分析仪（DTG–60；Shimadzu，日本）上进行，温度范围为25–600°C，加热速率为每分钟5°C。实验过程中持续通入每分钟40 mL的氮气以提供惰性气氛并防止氧化降解[28]。

**确定最佳阳离子**
使用单因素法评估不同阳离子对K. michiganensis产生的生物絮凝剂FA（ flocculation activity）的影响。将2 mL浓度为1 mg/mL的生物絮凝剂溶液或蒸馏水（作为对照）加入95 mL的高岭土悬浮液（4 g/L）中。随后分别加入3 mL浓度为1%的KCl（≥99%，Sigma-Aldrich，南非）、CaCl2（≥99%，Sigma-Aldrich，南非）、NaCl（≥99%，Sigma-Aldrich，南非）、AlCl3（≥98%，Sigma-Aldrich，南非）和FeCl3（≥98%，Sigma-Aldrich，南非）溶液。混合物在160 rpm下剧烈摇晃3分钟，然后在45 rpm下缓慢搅拌4分钟，最后在室温下静置5分钟。收集处理组和对照组的上清液，使用公式（1）计算FA百分比：
(1)%FA = [(Xo ? X1) / Xo] × 100，
其中Xo和X1分别表示对照组和处理组在550 nm处的光密度[29]。

**使用Box-Behnken设计（BBD）进行响应优化**
使用RSM优化生物絮凝剂的操作条件。Minitab中进行的三因素四水平BBD实验评估了阳离子、pH值、沉淀时间和剂量对FA的影响。独立变量与响应之间的关系用二次多项式方程表示：
(2) Y = β0 + ΣβiXi + ΣβijXiXj + ΣβiiXi2，
其中Y表示生物絮凝剂的FA百分比；Xi和Xj分别代表独立因素（阳离子、pH值、沉淀时间和剂量）。β0、βi、βi?和βii分别表示常数项、线性系数、双向交互系数和二次系数[30]。

**染料脱色效率**
根据Dlamini等人的方法[31]，评估了提取的生物絮凝剂在0.5 mg/L浓度下对亚甲蓝（≥98%，Sigma-Aldrich，南非）和刚果红（≥95%，Sigma-Aldrich，南非）的脱色效率。使用浊度计（Turbidimeter TB300 IR，Lovibond（Pty）Ltd，序列号：16/2721）测量每种染料溶液的初始浊度（单位：NTU）。使用0.1 M HCl和0.1 M NaOH将染料废水的pH值调整到最佳操作范围。然后采用罐式实验方法，使用95 mL染料溶液、3 mL阳离子溶液和2 mL生物絮凝剂剂量来确定脱色效果。随后仔细抽取处理后的上清液以测量浊度。同时，在相同条件下使用聚丙烯酰胺（PAM，Benotech，南非）和硫酸铝（≥98%，World of Science，南非）进行阳性对照。生物絮凝剂的脱色效率计算公式如下：
(3) Decolorization rate = [(Turbidityinitial ? Turbidityfinal) / Turbidityinitial] × 100

**提出的絮凝机制**
为了研究生物絮凝剂的絮凝机制，使用Zetasizer Nano（Malvern，英国）进行了Zeta电位测量。测试样品包括生物絮凝剂溶液、高岭土悬浮液、生物絮凝剂与阳离子混合物以及絮体。每次分析向一次性比色皿中加入2 mL样品，在25°C下以7.5 kcps的固定计数率测量。每个样品进行30次独立Zeta电位测量以确保准确性和重现性[32]。

**统计分析**
所有实验重复三次，结果以平均值±标准差的形式呈现。使用GraphPad Prism?版本8.4.2进行单因素方差分析（ANOVA）。p < 0.05的情况被认为是统计学上显著的，p > 0.05的情况视为不显著。使用Tukey的多重比较检验（p < 0.05）来验证平均值之间的显著差异。RSM数据使用Minitab软件版本21进行分析。ANOVA用于确定所选参数的线性、二次和双向交互项对响应变量的影响。使用统计指标（包括决定系数R2、调整后的R2和拟合度检验）评估模型适用性。在95%的置信水平下，p < 0.05被视为显著。

**BF–PX353943的化学组成**
图1展示了由密歇根克雷伯菌产生的生物絮凝剂BF–PX353943的化学组成。生物絮凝剂主要由碳水化合物组成，占其总组成的52.48%，蛋白质占8.10%。基于这一组成，BF–PX353943被归类为富含碳水化合物的糖蛋白。

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**图1. BF–PX353943的化学组成**

**BF–PX353943的糖分析**
组成分析显示了BF–PX353943中的糖成分（图2）。该生物絮凝剂包含多种单糖，其中蔗糖含量最高，占总组成的31.90%。果糖是第二丰富的糖组分，占17.77%，紧随其后的是半乳糖，占17.23%。未鉴定的单糖占组成的17.97%，而甘露糖和木糖的含量最低，分别为8.40%和6.73%。总体而言，结果显示BF–PX353943具有多样的糖组成。

**图2. BF–PX353943的单糖组成。**

**BF–PX353943的功能基团**
通过FTIR分析发现的BF–PX353943中的功能基团如图3所示。在3225 cm?1处的宽展峰表示羟基（O–H）和氨基（N–H）的重叠。2928 cm?1处的峰对应于C–H伸缩振动，表明存在烷烃。1643 cm?1处的吸收峰表明存在羰基（C=O）。最后，1056 cm?1处的尖锐吸收峰表示存在羧酸（–COOH）功能基团。

**图3. 生物絮凝剂BF–PX353943的FTIR光谱。**

**BF–PX353943的表面结构**
如图4所示，BF–PX353943的表面形态结构呈现出明确的晶体结构，具有细长棒状形态，边缘光滑且清晰。SEM显微图进一步显示这些棒状颗粒聚集在一起。密集排列的颗粒结构证实了该生物絮凝剂具有高度的组织性，表现为颗粒之间间距极小。

**图4. BF–PX353943的SEM图像。**

**BF–PX353943的元素组成**
BF–PX353943的元素组成（图5）显示氧（O）是最丰富的元素（35.31%），其次是磷（P）（17.39%）和钠（Na）（6.6%）。检测到的其他元素包括钾（K）（3.87%）、硫（S）（2.99%）、钙（Ca）（2.93%）、镁（Mg）（2.62%）、氯（Cl）（1.86%）和铝（Al）（1.17%），但含量较低。相应峰的强度各不相同，其中氧和磷的信号最为显著。这些结果表明BF–PX353943具有异质的元素组成，氧和磷占主导地位。

**图5. BF–PX353943的元素组成。**

**BF–PX353943的结晶性**
XRD分析揭示了BF–PX353943的结晶性特征（图6），强度随2θ在0–90°范围内变化。衍射图在10°至40°（2θ）区间呈现宽泛的扩散峰，最大强度出现在15–20°附近，随后强度逐渐下降。在大约45°和84°（2θ）处观察到的明显峰表明该生物絮凝剂具有结晶性。定量分析表明，该生物絮凝剂由14.41%的结晶态和85.59%的非晶态组成。

**图6. BF–PX353943的X射线衍射（XRD）光谱。**

**BF–PX353943的热稳定性**
BF–PX353943的TGA热谱及其对应的重量损失曲线如图7所示。在100至160°C的温度范围内观察到约15%的初始重量损失，这一过程伴随着吸热峰。此外，在200至300°C期间观察到约8%的重量损失，伴随着宽的吸热峰。温度进一步升高至300至600°C时，重量损失持续减少，最终降至略高于原始重量的水平。因此，这种生物絮凝剂具有热稳定性。

**图7. BF–PX353943的TGA和重量损失曲线。**

**不同阳离子对BF–PX353943絮凝活性的影响**
不同阳离子对BF–PX353943絮凝活性的影响如图8所示。随着阳离子的添加，絮凝活性有所变化，未添加阳离子时的活性最低，为16%。在测试的阳离子中，CaCl2与BF–PX353943之间的协同效应产生了最高的絮凝活性，达到52 ± 0.07%。NaCl、KCl和FeCl3也显著提高了絮凝活性，尽管效果低于CaCl2。因此，后续实验选择了CaCl2作为研究对象。

**图8. 不同阳离子对BF–PX353943絮凝活性的影响。字母（a, b, c）表示p < 0.05时的统计差异。**

**BF–PX353943模型的回归方程**
使用BBD方法开发了一个二阶多项式回归方程来描述生物絮凝剂BF–PX353943的絮凝活性（FA）与四个操作参数之间的关系：其中X1、X2、X3和X4分别代表CaCl2、pH值、沉淀时间和剂量大小。该模型包含了线性项、二次项和交互项，以详细评估每个因素及其组合对FA的影响。方程如下：
**FA(%) = 99.1 – 8.53X1 + 8.79X2 + 12.09X3 – 47.4X4 + 0.710X1×X1 – 0.5969X2×X2 + 0.546X3×X3 – 16.9X4×X4 – 0.654X1×X2 + 1.107X1×X3 + 0.33X1×X4 – 0.393X2×X3 + 6.52X2×X4 + 5.09X3×X4)**

**BF–PX353943优化模型的统计分析**
使用BBD对BF–PX353943优化模型进行的统计分析结果见表S1。p值表示变量的显著性，较小的p值表示变量间交互作用显著。p值小于0.05表明预测值和观测值之间存在显著差异。模型的p值为0.00，证实了模型的显著性。在线性项中，沉淀时间和剂量大小具有统计显著性（p < 0.05），而阳离子浓度和pH值的p值小于或等于0.001，但总体上线性模型具有统计显著性（p值=0.000）。二次项显示出显著的总体效应（p值=0.000）。在这些二次项中，pH值和沉淀时间具有显著性（p值<0.05），而阳离子（CaCl2）浓度和剂量大小的p值超过0.05阈值。总体双向交互作用也具有统计显著性（p值=0.000）。所有交互项均显著，p值小于0.05，除了阳离子（CaCl2）浓度和剂量大小之间的交互作用，其p值为0.903。模型的F值为14.66。拟合度检验不显著，p值为0.545。预测R2为0.9448，调整后的R2为0.8803，两者的差异约为0.0645（小于0.2的阈值），表明预测准确性可接受。

**BF–PX353943的最优条件**
BF–PX353943的絮凝活性对CaCl2、pH值、沉淀时间和剂量大小的响应变化见表S2。总体而言，第21次和第22次实验的条件分别产生了最高的絮凝活性，分别为74.54%和74.50%。第21次实验的最优条件为3.5% CaCl2、pH值7、沉淀时间10分钟和剂量大小1 mg/mL；第22次实验的条件为5% CaCl2、pH值7、沉淀时间10分钟和剂量大小0.75 mg/mL。相比之下，在第3次实验条件下（3.5% CaCl2、pH值10、沉淀时间7.5分钟和剂量大小0.5 mg/mL），记录到最低的絮凝活性，为47.16%。

**BF–PX353943的主要效应图**
主要效应图用于确定各参数对BF–PX353943絮凝效能的影响，结果如图9所示。阳离子（CaCl2）图形的轻微U形表明，CaCl2的最低和最高浓度都会导致比中等浓度更高的FA。pH值的凹曲线表明，中性附近的pH值可以增强BF–PX3943的絮凝活性，而酸性和碱性条件会显著降低其效能。沉淀时间的浅U形曲线说明，当沉淀时间延长至最长10分钟时，BF–PX3943的絮凝效能可以达到峰值。剂量大小的图表明，剂量大小的持续增加可以显著提高BF–PX3943的FA，最高FA可在最大剂量大小1 mg/mL时获得。

**CaCl2和pH值对BF–PX353943絮凝活性的影响**
图10展示了pH值和阳离子CaCl2对BF–PX3943絮凝活性（FA）的交互效应的等高线（A）图和响应表面（B）图。等高线图中的深绿色区域表示可能产生超过62%絮凝活性的区域；只要CaCl2浓度在4.1–5%范围内且pH值调整至4.5–8，或者CaCl2浓度在2–2.5%范围内且pH值调整至6.8–9，就可以实现这一最大絮凝效果。相反，等高线图中的浅绿色区域表示可能产生低于54%絮凝活性的区域；这种情况发生在CaCl2浓度在2–3.5%范围内且pH值调整至4–4.5，或者CaCl2浓度在3.7–5%范围内且pH值调整至9.8–10时。

**CaCl2和沉淀时间对BF–PX353943絮凝活性的影响**
图11展示了CaCl2浓度和沉淀时间对BF–PX3943絮凝活性的综合影响。等高线图（右上部分）中的最深绿色区域标志着可实现最高絮凝性能（>72%）的区域，当CaCl2浓度在4.5–5%之间且沉淀时间保持在9.5–10分钟时达到。相反，从右下角向中心延伸的最深蓝色区域标记了絮凝活性最低（<62%）的区域，对应的CaCl2浓度为2.2–5%且沉淀时间在5–8.5分钟之间。

**CaCl2和剂量大小对BF–PX353943絮凝活性的影响**
图12展示了CaCl2浓度和剂量大小对BF–PX3943絮凝活性的联合影响。等高线图（左上和右上 quadrant）中的深绿色区域表示产生最高絮凝活性（>64%）的条件；当CaCl2浓度在4–5%且剂量水平在0.75–1.0 mg/mL之间时，或者CaCl2浓度在2–2.2%且剂量保持在0.96–1.0 mg/mL之间时可以达到这些峰值。相反，中央低色区域表示絮凝活性最低（<58%）的区域，对应的CaCl2浓度在2.2–4.2%之间且剂量保持在0.50–0.52 mg/mL之间。

**沉淀时间和pH值对BF–PX353943絮凝活性的影响**
图13展示了沉淀时间和pH值对BF–PX3943絮凝活性的影响。等高线图（左下部分）中的深蓝色区域表示絮凝活性最低（<55%）的区域，对应的pH值在4–4.2之间且沉淀时间在5–7分钟之间。相反，位于右下角的一个浅绿色区域表示絮凝活性最低（小于48%）的条件，这种情况发生在pH值升高到9.9–10时，且剂量保持在0.50–0.52 mg/mL之间。下载：下载高分辨率图片（161KB）下载：下载全尺寸图片图14. 等值线（A）和响应面（B）图显示了剂量大小和pH值之间的相互作用及其对BF–PX353943絮凝活性（FA）的影响。剂量大小和沉淀时间的变化及其对BF–PX353943 FA的影响通过等值线（A）和响应面（B）图进行了可视化（图15）。等值线图右下部的淡绿色区域对应于最低活性（<60%），这种情况出现在沉淀时间为5.5–10分钟，剂量为0.50–0.65 mg/mL时。同时，右上角的深绿色区域表示絮凝活性最高的条件（>72%），这发生在沉淀时间为9–10分钟，剂量范围为0.82–1.0 mg/mL时。下载：下载高分辨率图片（176KB）下载：下载全尺寸图片图15. 等值线（A）和响应面（B）图显示了沉淀时间与剂量大小之间的相互作用及其对BF–PX353943 FA的影响。BF–PX353943的响应优化器示意了实现最大FA的最佳预测操作条件（图16）。BF–PX353943达到最大FA 79.1098%的理想条件用红色突出显示（中间行），包括5%的阳离子（CaCl2）、pH 6.7879、10分钟的沉淀时间和1 mg/mL的剂量大小。下载：下载高分辨率图片（148KB）下载：下载全尺寸图片图16. BF–PX353943的最佳预测操作条件。BF–PX353943的BBD模型验证BF–PX353943的最大FA通过实验确定为80.36±0.11%。在同一条件下，预测的FA略低，预测值与观察值之间的差值为1.25%（见图16）。生物絮凝剂在染料脱色中的应用表1显示了生物絮凝剂BF–PX353943的染料脱色效率。BF–PX353943在去除刚果红方面的脱色效率与硫酸铝和PAM相当（p > 0.05）。此外，BF–PX353943在去除亚甲蓝方面的效率也与硫酸铝相似（p > 0.05），而PAM的去除效率最高，为88.22%。表1. BF–PX353943的染料脱色效率。絮凝剂刚果红脱色（%）亚甲蓝脱色（%）BF–PX353943 71.82±0.00a 82.17±0.00aPAM 73.20±0.00a 88.22±0.00a硫酸铝 72.85±0.00a 84.71±0.00a字母（a）表示统计学显著性（p < 0.05）。提出的絮凝机制表2展示了使用生物絮凝剂BF–PX353943进行生物絮凝过程中样品的Zeta电位值。高岭土颗粒显示出最低的负Zeta电位–15.84±0.42 mV，其次是BF–PX3943絮凝后的高岭土颗粒（–7.95±0.51 mV）。总体而言，BF–PX3943溶液和高岭土溶液的负Zeta电位表明阳离子介导的桥接是主要的絮凝机制。表2. 用于确定BF–PX353943絮凝机制的样品的Zeta电位。样品 Zeta电位（mV）BF–PX353943溶液 –5.15±1.90高岭土溶液 –15.84±0.42BF–PX353943–CaCl2 17.57±2.40BF–PX353943–絮凝后的高岭土颗粒 –7.95±0.51讨论生物絮凝剂BF–PX353943主要由碳水化合物（>50%）组成，并与蛋白质结合形成糖蛋白。通常，富含碳水化合物的生物絮凝剂具有热稳定性[33,34]；因此，它们可以应用于多种污染物。这两种生物絮凝剂中的蛋白质含量也是一个重要组成部分，因为它们通常包含氨基、羧基和羟基等官能团，这些官能团增强了生物絮凝剂与溶液中污染物之间的静电相互作用和桥接。此外，碳水化合物和蛋白质部分的混合生物化学组成具有协同效应，即使在低剂量下也能提高较高的FA（通常>90%）[35]。这种生物絮凝剂的化学组成与Luo等人[36]和Fang等人[37]的报告相似，他们发现Klebsiella pneumoniae YZ–6和Klebsiella sp. 59L产生的糖蛋白生物絮凝剂主要由碳水化合物组成。BF–PX353943包含多种单糖成分，因此被归类为异多糖。这种结构多样性通过引入多样的官能团和灵活的分子构象赋予了其功能优势，从而增强了絮凝过程中的颗粒相互作用。先前的研究表明，以中性糖为主的生物絮凝剂富含羟基，这些羟基在通过氢键和颗粒桥接方面起着关键作用[38,39]。值得注意的是，BF–PX353943中鉴定出的所有糖类都是中性糖，表明这种生物絮凝剂富含羟基，这可能是其高絮凝效率的原因之一。生物絮凝剂与污染物的结合能力取决于其分子链中的官能团数量[40]。BF–PX353943中发现了羟基、羧基、羰基和氨基等官能团，进一步证实了其中含有碳水化合物和蛋白质。这些丰富的官能团为悬浮颗粒提供了多个吸附位点，从而提高了其絮凝效果。例如，由Klebsiella pneumoniae YZ-6产生的MBF-6生物絮凝剂具有羧基、羟基和氨基等官能团，对处理各种废水、纺织品、乳制品、啤酒和糖工业废水非常有效[36]。这强调了具有这类官能团的生物絮凝剂的多功能性和有效性。生物絮凝剂的表面形态在絮凝过程中起着重要作用[41]。BF–PX353943的晶体状、细长杆状结构可以增加悬浮颗粒的吸附表面积，从而提高其絮凝效率。Abd El-Salam等人的研究支持了这一观点[42]，他们发现一种晶体状线性生物絮凝剂达到了94.56%的最大FA。生物絮凝剂的元素组成决定了它们的结构柔韧性和稳定性，以及它们的絮凝效率[29]。BF–PX353943中氧的主要存在表明其中含有氧丰富的官能团，如羧基（–COOH）、羟基（–OH）和羰基（C=O），这些官能团增强了絮凝活性[39]。同样，由Klebsiella pneumoniae YZ–6产生的生物絮凝剂也富含氧（44.45%），并在去除各种类型的污染物方面表现出高效率[36]。BF–PX353943还含有镁、铝和钙等多价阳离子，这些离子已知有助于絮凝过程中的桥接机制[44]。总的来说，BF–PX353943饱和了阴离子和阳离子，表明其两性性质使其能够有效地处理阴离子和阳离子污染物。XRD分析清晰地揭示了生物絮凝剂的晶体性质和分子排列。该生物絮凝剂同时具有结晶和非晶区域；然而，它主要是非晶的。这两种结构相的共存是有利的，因为有序的结晶区域有助于提高刚性及结构稳定性，而非有序的非晶区域则增强了生物聚合物网络的灵活性[45,46]。Kaur等人[47]也报告了类似的观察结果，他们发现由Escherichia sp.产生的生物絮凝剂同时具有结晶和非晶特性。TGA显示，由于BF–PX353943主要含有碳水化合物且蛋白质含量较少，因此具有热稳定性和热不稳定性。生物絮凝剂的初始重量损失可归因于与碳水化合物中的羟基和羧基以及类糖蛋白分子相关的水分流失[48]。温度的进一步升高导致生物絮凝剂主链的降解，最终重量减少了超过60%，因此该生物絮凝剂具有热稳定性。Selepe等人[49]也观察到类似的发现，他们发现Ochrobactrum oryzae AB84113产生了一种热稳定的生物絮凝剂。此外，BF–PX353943的热稳定性也可以归因于其碳水化合物含量[50]。生物絮凝剂在最终阶段的缓慢重量损失对应于其中的矿物残留物[51]。为了提高其絮凝效果，生物絮凝剂通常会添加阳离子。CaCl2的效果证实BF–PX353943是一种依赖阳离子的生物絮凝剂。添加CaCl2通过中和并稳定高岭土颗粒和生物絮凝剂上的负电荷官能团，从而减少了静电排斥并促进了强絮体的形成[52,53]。这些发现与Khiew等人的研究结果不一致[54]，他们也观察到阳离子显著提高了生物絮凝剂的FA。模型统计分析提供了独立变量与絮凝效率之间的经验关系。模型的线性系数描述了不同参数对BF–PX353943 FA的影响。CaCl2（X1）的强烈负线性系数表明，超过最佳水平的CaCl2浓度会显著降低FA。虽然Ca2+离子已知可以桥接生物絮凝剂分子和颗粒上的负电荷位点，但过高的浓度可能导致电荷中和和不稳定，从而降低絮凝效率[55]。pH值（X2）的正线性效应表明，pH值的增加会提高FA。这可能反映了参与颗粒结合的官能团的最佳电离状态。沉淀时间（X3）的正线性效应表明，较长的沉淀时间会促进絮体的形成，从而提高FA。BF–PX353943的剂量大小（X4）的负线性系数表明，过量的生物絮凝剂剂量可能会降低FA，可能是由于颗粒重新稳定或过饱和效应。CaCl2（X12）的正二次系数表明，FA最初会随CaCl2浓度的增加而降低，但在某个水平后可能会略微改善，显示出非线性但适度的恢复趋势。沉淀时间（X32）的正二次项表明，延长的沉淀时间会继续提高FA。剂量（X42）的强烈负二次效应表明，过高的剂量可能会导致FA下降，可能是由于颗粒重新稳定或过度饱和。pH值（X22）的负二次系数表明，FA会随pH值的增加而降低。pH值强烈影响生物絮凝剂吸附位点的电离状态，从而改变其表面电荷和与胶体污染物的相互作用能力。还探讨了参数相互作用对FA的影响，以解释BF–PX353943的模型。X1*X3表明，适量的CaCl2与较长的沉淀时间可以协同提高FA。X2*X4和X3*X4表明，较高的pH值或较长的沉淀时间与最佳剂量结合可以增强FA。X1*X4显示出轻微的正协同效应，表明同时增加CaCl2和剂量带来的好处有限[44]。X1*X2和X2*X3的系数为负，表明同时增加CaCl2和pH值或pH值与沉淀时间可能会略微降低FA。对于BF–PP809651模型，X1*X2和X1*X3的正相互作用系数表明，适量的CaCl2与有利的pH值和沉淀条件结合可以协同提高FA。增加的阳离子水平可能增强了颗粒表面的电荷中和，促进了聚集，而较长的沉淀时间则使絮体有足够的时间沉降，从而提高了整体絮凝效率[56]。相反，X1*X4和X2*X3的强负系数表明，高浓度的CaCl2与高剂量的生物絮凝剂或极端的pH值与延长的沉淀时间相结合可能会负面影响FA。X2*X4的相互作用为正，表明增加pH值和剂量会提高FA。X3*X4的负相互作用表明，较长的沉淀时间与较高的剂量结合可能会降低FA，可能是由于絮体破裂或沉降效率低下。总的来说，显著的二次项和相互作用项表明，最佳絮凝性能取决于所有四个参数之间的精确平衡，而不仅仅是一个变量。ANOVA分析证实了二次BBD模型在统计上是稳健的，并可靠地表示了研究因素与BF–PX353943絮凝效率之间的关系。高F值、低模型p值和无拟合迹象表明模型拟合良好，证实了该模型的可靠性和有效性[59]。此外，模型的高R2（>0.90）值以及调整后和预测R2之间的最小差异反映了模型的强解释能力和预测能力[60]。BF–PX353943的主效应图提供了关于选定参数如何影响其FA的全面见解。阳离子对生物絮凝剂FA的主要影响被评估为它在影响絮凝效率方面起着关键作用。阳离子浓度不足或过高可能导致絮凝效果不佳；因此，最佳用量至关重要[60]。值得注意的是，5%浓度的CaCl2在提高BF–PX353943的絮凝效果方面表现出巨大潜力。阳离子类型和浓度的影响因生物絮凝剂的不同化学组成而异[44]。例如，1%浓度的MgSO4、CaCl2和AlCl3增强了由假单胞菌（Pseudoalteromonas sp.）产生的生物絮凝剂的絮凝活性（>90% FA）[61]。此外，1%浓度的Mn2+对由短杆菌（Bacillus pumilus）产生的生物絮凝剂具有最大的FA效果[62]。在本研究的测试条件下，5%的阳离子浓度是最佳值；可以推测这些生物絮凝剂主要由带负电荷的功能基团组成，因此需要较强的中和作用来提高絮凝效果。显然，傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示存在带负电荷的羟基和羧基功能团。由此可以看出，阳离子用量与生物絮凝剂用量相对应。生物絮凝剂在不同的最佳pH值下才能有效发挥功能[63]；改变pH值可能会影响生物絮凝剂的电荷和污染物的表面电荷，从而影响其絮凝能力[64]。BF–PX353943在中性pH值下表现最佳。然而，酸性和碱性条件可能会通过干扰其电荷而对其絮凝效果产生负面影响。同样，由莫哈文斯杆菌（Bacillus mojavensis）和铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）产生的生物絮凝剂在中性pH值下也最为有效[65,66]。BF–PX353943的主要效应图全面展示了沉降时间对其絮凝效果的影响。本研究中也观察到类似现象，沉降时间图表明絮凝过程需要更多时间完成，这可能是由于形成的絮体密度较低，需要足够的时间才能沉淀[67]。这一特点有利于絮体的形成，从而减少污染物的数量。生物絮凝剂的最佳用量确保了足够的吸附位点，以实现有效的颗粒结合[68]。在测试条件下，BF–PX353943在最高用量时表现出最佳的絮凝效率。这对于工业应用来说并不理想，主要是因为微生物絮凝剂的产量通常较低[69]。等高线和响应面图清晰地显示了影响生物絮凝剂絮凝效果的各个变量之间的相互作用对其絮凝效率的影响。CaCl2浓度与沉降时间之间的相互作用在最佳测试条件下可实现最高的絮凝效果。因此，可以预测在这些条件下，生物絮凝剂和高岭土颗粒之间的静电电荷达到平衡，同时有足够的沉降时间使絮体聚集并稳定下来[70]。相比之下，用量与沉降时间之间的相互作用在测试条件中略高于中等水平时可实现最高的絮凝效果。因此，BF–PX353943因其低用量下的高效率而被认为是一种经济型生物絮凝剂。此外，可以推测在这些测试条件下，用量可以提供最佳的结合位点和足够的时间来形成大而密的絮体[71]，从而实现最高的絮凝效率[72]。响应优化器被用来预测实现BF–PX353943最高絮凝效率的最佳条件。预测的总体絮凝效率与实际絮凝活性相当，差异不大，进一步验证了该模型的可靠性和预测精度。研究结果与Dbik等人[73]和Iber等人[11]的观察结果一致，即预测的去除效率与实验值相近。阴离子染料刚果红和阳离子染料亚甲蓝被用来评估BF–PX353943的脱色效果。BF–PX353943与两种化学絮凝剂（PAM和硫酸铝）对这两种染料的脱色效果相当，表明该生物絮凝剂有可能替代传统絮凝剂。BF–PX353943对亚甲蓝染料的高脱色效率表明其含有对这些染料具有高亲和力的功能基团。这些发现与Chen等人的研究结果一致[12]，即由Alteromonas sp. CGMCC10612产生的生物絮凝剂能有效去除阴离子和阳离子染料。微生物絮凝剂是废水处理中的有前景的绿色技术。BF–PX353943能够有效去除阴离子和阳离子染料，而基于吸附的材料（如纤维素）则表现出更强的去除能力，其中对藏红花素O（91.98%）的去除效率高于酸蓝25（41.12%）[74]。此外，经过表面修饰引入多个活性位点后，基于石墨烯的吸附剂对罗丹明B的去除效率达到97.07%[75]。然而，这种改性需要额外的合成步骤，而微生物絮凝剂本身含有多种功能基团，可能是更具成本效益和可持续性的选择。zeta电位分析不仅限于简单的表面电荷评估；在本研究中，它被用来研究影响生物絮凝剂性能的机制。zeta电位分析表明，BF–PX353943主要通过桥接机制促进絮凝[76]。桥接作用主要是通过阳离子的电荷中和效应实现的，减少了排斥力，从而使絮凝得以发生。在这种情况下，生物絮凝剂片段被吸附在污染物表面，形成环状和尾状结构，随后附着在相邻颗粒上[77]。多项研究表明，大多数生物絮凝剂利用阳离子介导的桥接机制来絮凝悬浮液中的颗粒[78,25]。结论：BF–PX353943是一种糖蛋白，富含羟基、羧基、羰基和氨基等功能基团。扫描电子显微镜（SEM）和元素分析确认了其结构特征和富氧组成。统计模型分析、主要效应图、等高线和表面图突出了选定变量之间的最佳相互作用，为改善絮凝活性提供了过程优化的指导。BF–PX353943在去除两种测试染料方面表现出高效率。据推测，BF–PX353943通过阳离子介导的桥接机制发挥作用。尽管有这些有希望的发现，仍需进一步研究其在实际废水系统中的性能，特别是在不同的物理化学条件和复杂污染物混合物存在的情况下。此外，还应探讨大规模生产、过程优化和成本分析，以评估其工业可行性。未来的工作还应研究该生物絮凝剂的长期稳定性、储存性、生物安全性和可重复使用性，以支持其实际应用。