综述：纳米生物催化剂：在生物燃料生产和生物转化中的潜在应用

《Carbon Neutralization》：Nanobiocatalysts: Potential Applications in Biofuel Production and Biotransformation

　　摘要

酶在生物工艺中被广泛用作催化剂，以提高生物燃料和增值化合物（VACs）的产量。为了提高这些过程中的产品产量，研究人员正在研究各种方法。其中，纳米生物催化剂（NBCs）具有很大的潜力，它们将酶固定在纳米载体上。这使得固定化酶的活性、稳定性和可回收性得到改善，并降低了处理过程的成本。不同的纳米载体，如有机、无机、杂化和功能化材料，已被用于固定单个或多个酶。本文讨论了利用NBCs来提高水解效率、发酵底物以生产生物乙醇和生物氢以及增强生物柴油的酯交换过程。还探讨了NBCs在将各种底物转化为VACs中的作用，以及使用单酶和多酶级联系统进行生物转化的方法。该综述批判性地评估了当前纳米生物催化系统的效率，并提出了提高其实际应用性能的策略。最后，综述强调了NBCs在实时应用中面临的挑战，并概述了其在生物炼油厂可能的应用领域。

1 引言

纳米生物催化剂（NBCs）是通过酶与纳米载体之间的协同作用形成的。这增强了酶的稳定性和活性，适用于潜在的生物工艺应用[1]。固定化酶预计能够在极端环境条件下表现出高效的催化活性和可重复使用性[2]。酶的回收利用降低了成本，并使产品回收更加容易。最近，基于纳米载体的酶固定化方法受到了关注，使用了多种类型的纳米载体，包括有机、无机和杂化材料。这些纳米载体有多种形式：纳米颗粒、纳米纤维和纳米花。由于碳纳米管（CNTs）和金属氧化物纳米颗粒的高回收潜力，它们常被用于生物燃料的生产[3]。功能化纳米载体作为纳米级平台，提供了较大的表面积和定制的结合位点，从而增强了反应速率[4]。因此，制造具有较大表面积的纳米载体可以在其表面上容纳更多的酶，从而提高NBCs的性能[5]。通过基于酶的催化过程，可以从底物中生产生物燃料和其他增值化合物（VACs）。然而，这些过程面临一些挑战，如酶的成本高、酶的稳定性以及底物的抗性。通过使用NBCs，可以将酶固定在纳米材料上以获得所需的产品，从而解决了这些问题。此外，NBCs还可用于底物水解，以提高生物燃料的产量[6]。使用纳米固定的酶可以通过降低成本、提高工艺效率和整体性能来改善生物工艺[7]。金属氧化物纳米载体在生物柴油生产中作为催化剂，由于它们具有大量的活性位点，可以增强反应速率并提高产量[8]。在生物乙醇生产中，糖化酶的高成本需要对其进行固定化，从而提高其稳定性、活性和可重复使用性，进而改善整个工艺的经济性。进一步将酶固定在纳米载体上可以带来高催化效率和增强的稳定性等优势[9]。NBCs表现出可重复使用的特点，并提供了较大的表面面积用于酶的装载，使其适用于工业级的生物工艺工厂。本文解释了用于开发NBCs的各种纳米载体和酶固定化方法，强调了采用NBCs进行高效生物燃料生产和将复杂及简单底物转化为VACs的重要性。同时指出了NBCs在生物燃料和VACs生产应用中的不足之处，从而提出了进一步研究和开发的潜在领域，并讨论了NBCs应用所面临的挑战和未来前景。

2 NBC

NBC通过固定化提高了酶的耐用性、效率和可回收性[10]。它通过增加表面积与体积的比率来增强催化活性[1]。酶固定化的效率取决于理想纳米载体的选择。理想的纳米载体应无毒、生物相容且可回收。此外，它还应提高生物催化过程中酶的稳定性和反应性[11]。在水溶液中，NBC的布朗运动增强了其催化活性，从而提高了活性和稳定性。NBC的适用性主要取决于其固定化类型。固定化方法有两种：可逆和不可逆。

2.1 可逆酶固定化

在可逆固定化中，酶以可逆的方式附着在纳米载体上，使得在非常温和的条件下可以将酶从载体上分离。可逆酶固定化包括多种机制，如吸附、离子结合、亲和结合、金属结合或螯合以及二硫键结合，如图1A所示。

（A）可逆酶固定化技术。（B）不可逆酶固定化技术。吸附
在吸附过程中，酶与载体之间通过非共价力（即范德华力、疏水力和静电作用力）发生相互作用[10]。在吸附过程中，酶结合到载体表面，且这种结合是可逆的。载体上的功能基团是高效吸附的主要原因。然而，在缺乏这些功能基团的情况下，可以通过添加载体修饰剂来改善载体-酶间的相互作用[12]。这种技术分为物理吸附、静电相互作用和疏水吸附。在物理方法中，酶被允许在特定时间内固定在载体上以实现吸附[13]。静电相互作用受两个主要参数的影响：反应溶液的pH值和酶的等电点[13]。在带电载体上，吸附是通过静电相互作用发生的[14]。疏水相互作用发生在载体表面和酶之间，这些相互作用被认为是由熵驱动的过程。这导致水分子从酶和载体中位移[15]。将脂肪酶吸附到疏水性载体位点上，可以在无水介质中产生更活泼和稳定的脂肪酶衍生物[16]。

离子结合
离子结合提供了一种简单、廉价且可逆的固定化方法[17]。它通过离子相互作用发挥作用，即酶与带相反电荷的载体结合，可以通过改变pH值轻松逆转[10]。这种方法的优点是易于操作、可逆性以及由于载体材料的稳定电荷而便于调节pH值。缺点是由于带电载体的影响，酶的结构和活性位点可能会发生变化，从而影响酶的活性。

亲和结合
亲和结合主要是由于载体、酶和标签之间的共价或非共价相互作用[18]。因此，它确保了互补分子之间的选择性结合[19]。在这种方法中，带有亲和力的载体被附着在酶上，从而不改变酶的特性。可以通过用配体修饰载体或修改酶以包含与载体相互作用的域来实现这一点[15]。这种方法的优点是选择性高，固定化酶的构型变化最小；缺点是成本较高。

金属结合
在金属结合过程中，金属盐或氢氧化物沉积在载体表面上，并与酶上的亲核基团结合形成配位键。这是一种可逆的方法，酶的回收更容易[20]。在结合过程中，空间障碍阻止载体完全占据金属的配位位点，为酶的结合留下了空间[19]。酶通过其带电的极性氨基酸基团与金属离子通过配位键结合。这种方法的优点是结合更为牢固，可以减少酶的泄漏。缺点是由于金属离子在活性位点的相互作用，酶的活性降低。

2.2 不可逆酶固定化

不可逆固定化可以通过包埋、封装、交联和共价结合来实现，如图1B所示，其中酶以不可逆的方式结合在载体上。包埋
在这种方法中，酶被包裹在聚合物网络中，限制了酶的聚集[23]。该方法包括将酶与聚合物溶液混合，然后进行聚合形成用于捕获酶的晶格结构[24]。Muanruksa等人[25]通过包埋将脂肪酶固定在海藻酸凝胶（果胶-海藻酸盐和明胶-海藻酸盐）上，分别获得了98.3%和97.6%的固定化效率。这种方法的缺点是传质限制，需要仔细设计载体孔径和基质属性[26]。其他限制包括载体磨损、固定化过程中酶的失活，以及如果载体孔径过大则可能导致酶泄漏[15]。

封装
封装类似于包埋，其中酶被固定在半透性基质内的封闭口袋中。通过改变疏水界面，这种方法提高了酶的性能，从而增加了反应表面积[27]。这种方法的优点是低分子量组分更容易通过半透性基质。主要的限制包括传质阻力、酶活性降低以及潜在的泄漏[17]。

交联
交联是一种无需载体的固定化方法，通过酶和连接剂之间的分子间共价键形成三维交联基质[10]。戊二醛是常用的交联剂[24]；然而，在某些情况下，它的使用会改变酶的活性位点并导致酶失活。因此，使用大分子交联剂（如右旋糖醛）作为分子支架来保护酶[28]。有两种常用的交联固定化类型：交联酶晶体（CLEC）和交联酶聚集体（CLEA）。在CLEC中，戊二醛在酶结晶后添加。它负责提高酶的稳定性、体积活性和固定化效率；然而，需要纯酶进行结晶，使得这种方法成本更高[29]。CLEA在水溶液中通过添加盐或有机溶剂形成，形成保持催化特性的酶聚集体[13]。它在更广泛的pH值和温度范围内表现出更高的生产力和稳定性。缺点是由于CLEA颗粒的松散交联而导致的机械强度较低，以及由于颗粒大小不均匀而引起的扩散限制[29]。

2.3 共固定化方法

酶的共固定化可以是顺序的，也可以是同时进行的，这有助于在同一空间内排列多个酶[34]。最初用于单酶固定化的方法经过某些修改后，也可用于多酶固定化。它们有两种类型：非特异性固定化和位点特异性固定化。

非特异性共固定化
这种固定化方法用于促进底物通道化、提高反应速率和减少滞后时间。通过将代表生物反应的一系列酶放在载体附近来实现。它使生物反应的中间产物更快地到达特定的酶，减少扩散限制并提高多步反应的动力学。共固定的多酶分为三种类型：随机、区室化和定位，如图2所示。随机固定到载体上是通过捕获和交联来完成的。这是一种最简单的方法，其中多种酶被随机附着在载体表面。这种技术的优点是连接的酶能够共定位，从而减少了酶的失活，提高了特异性活性，并增加了功能基团的可用性[35]。该技术的局限性在于保持固定配置和固定酶的比例[36]。第二种固定方法是 compartmentalization，即纳米载体被功能分区以模拟细胞的分区结构。这种方法降低了传质阻力，缩短了中间反应的路径长度。每个隔间作为一个独立的反应室并单独发挥作用。定位固定可以按特定顺序排列酶，从而提高级联过程中的催化效率。这种技术的缺点是制造空间支架的复杂性和时间消耗，以及由于酶结构变化导致的酶活性损失[37]。

在这种方法中，使用化学选择性接头将多种酶精确地定位在纳米载体上，以促进级联反应。在位点特异性共固定中，可以控制酶的连接数量和位置。它使用正交结合方法将酶固定在蛋白质支架上或通过与纳米载体的共价键合来实现微反应器系统中的级联反应[38]。除了正交结合方法外，还可以通过位点特异性融合蛋白将多种酶连接在一起[39]。图2（在图查看器中打开） PowerPoint

共固定的多酶系统在纳米载体上。

理想的用于NBC开发的支撑基质应具备表面特性、生物相容性和低毒性[40]。选择用于固定的载体时应非常小心，以防止其对酶结构产生不利影响或干扰。它应能够承受苛刻的反应条件，以保持高催化活性[41]。纳米载体大致分为四类：有机载体、无机载体、混合物载体和功能化载体，如图3所示。图3（在图查看器中打开） PowerPoint

不同的纳米载体用于酶的固定。NPs，即纳米颗粒。

3.1 有机纳米载体

有机聚合物如壳聚糖和海藻酸盐广泛用于固定[42]。其中，自组装多糖受到了关注，它们依赖于疏水分子（脂肪酸、胆固醇）与两亲性碳水化合物骨架的共价连接[43]。壳聚糖-海藻酸盐的捕获是由于海藻酸盐羧基和壳聚糖氨基之间的离子相互作用，这些相互作用进一步增强了纳米载体的机械性能[44]。最近，脂质体（由亲脂双层夹在两个亲水层之间的球形脂质基纳米载体）受到了更多关注[45]。它在生物医学和食品应用中得到广泛应用；然而，其在生物燃料生产中的使用仍处于早期阶段。

3.2 无机纳米载体 (INC)

无机纳米载体 (INC) 包括许多材料，如金属氧化物纳米颗粒、碳纳米管 (CNTs) 和金属纳米颗粒。与有机纳米颗粒相比，无机纳米载体的显著特点是亲水性、稳定性、兼容性和无毒性。常用的金属氧化物包括 ZnO、Fe3O4 和 TiO2[2]。由于其较大的表面积，金属纳米颗粒有利于酶（氧化还原酶）高效地附着在磁性纳米颗粒 (MNPs) 上，从而增强电子转移[3]。总体上，它以结构化的形式固定酶，实现高负载能力和电子转移率，通过逐层组装实现。同样，碳纳米管与酶形成更强的键合，改善了固定酶与底物之间的电子转移效率[41]。由于其可持续性和可重复使用性，磁性纳米颗粒被认为是高效的酶固定载体。这导致了更多关于应用磁性碳纳米管进行酶固定的研究。例如，将 β-葡萄糖苷酶固定在磁性纳米纤维上可以提高酶的稳定性，其磁性质使得可以通过磁场分离酶实现重复使用[46]。另一种有前景的纳米载体是超顺磁材料，特别是氧化铁纳米颗粒（磁铁矿和磁赤铁矿），用于酶固定。它们具有理想的载体特性，如更高的结合效率、更低的操作成本、快速的酶分离和降低的传质阻力[47]。这些超顺磁特性通常出现在粒径小于30 nm的材料中[48]。它们本身不具有磁性；而是通过外部磁场被磁化。磁铁矿和磁赤铁矿广泛用于生产生物燃料（生物乙醇和生物柴油）和真空吸收剂 (VACs) 的 NBC 的开发。

3.3 混合纳米载体

它们是有机和无机纳米载体的混合物，兼具两者的优点[49]。理想的有机-无机混合纳米载体具有生物相容性，并且具有较大的表面面积，适用于酶的固定[11]。最近，混合（有机-无机）纳米花受到了更多关注，这种纳米花形状像花朵，在生物燃料[50] 和 VAC [51] 的生产中具有广泛的应用。混合纳米花 (HNFs) 的形成机制包括三个阶段：成核、发展和停止。在成核阶段，由于蛋白质（有机）与铜离子（无机）之间的配位键合，形成了初级晶体。随后，在铜离子结合位点处生长出纳米花瓣。最后，生长停止，花瓣排列形成 HNFs[52]。

3.4 功能化纳米载体

对于特定应用，可以通过引入功能基团来修改纳米载体的表面以满足要求。最常见的引入功能基团是氨基、羟基和羧基。在功能化过程中，它们在载体表面与酶形成稳定的共价键[53]。纳米载体的功能化降低了底物的传质阻力，并增加了酶对底物的可及性。它确保酶在载体上的有序排列，从而提高反应动力学[54]。Esmi 等人[55] 用氨基和醛基功能化了介孔磁性二氧化硅纳米颗粒，并用它们固定了脂肪酶。固定的脂肪酶显示出高活性，并产生了88.4%的生物柴油产量。纳米纤维是具有大表面积和强酶结合能力的优秀载体。然而，纳米纤维表面的重叠会限制酶的负载量并降低酶活性。在这种情况下，功能化可以修改纳米纤维表面并提高孔隙率，从而增强酶的负载量[56]。

4 固定效率

固定效率取决于载体与酶的相互作用、结合位置、物理组装、载体的化学组成以及它们在不同温度和时间下的稳定性[57]。由于较大的表面积、较高的负载能力和较低的传质阻力，磁性纳米颗粒是更优的载体。然而，在某些条件下，磁性纳米颗粒表面的负电荷羟基可能会对酶产生排斥力。因此，需要修改表面以提高稳定性和固定效率[58]。不同的 NBC 及其固定效率详见表1。Parandi 等人[58]将脂肪酶（2.59 mg/mL）固定在纳米复合材料上，转化率为92.7%，用于生产生物柴油，实现了97%的转化率。Chamoli 等人[70]将 β-葡萄糖苷酶固定在磁性铁纳米颗粒上，固定效率为89.7%，从而在30分钟内提高了纤维素的水解为葡萄糖的速率，发酵转化率为90%，是生物乙醇生产的有效来源。Zanuso 等人[71]将纤维素酶混合物固定在壳聚糖涂层的磁性纳米颗粒上，剂量为65 mg 蛋白质/g 载体，结合效率为70%，实现了64.4%的玉米芯糖化率。载体?空间障碍会影响固定效率，从而降低酶对底物的可及性。此外，活性位点的过度交联会导致酶变性，从而导致酶活性部分丧失[72]。表1. 固定在纳米载体上的酶及其效率。 来源/酶

固定基质

固定方法

最佳条件

结果

参考文献



Trichoderma reesei 纤维素酶

壳聚糖纳米杂化物在海藻酸盐珠子上

捕获

温度：50°C

pH：5

固定效率：80%

[59]a-c



Candida rugosa 脂肪酶

油酸涂层的磁性纳米杂化物

物理吸附

pH：7

时间：300分钟

固定效率：94%

[60]a-c



Myrothecium verrucaria 卵白酶

Cu2+ 改性的可回收磁铁矿纳米颗粒

金属亲和吸附

温度：35°C

pH：4.5

时间：30分钟

固定效率：85.2%

[61]a-c



Trichoderma asperellum 卵白酶

聚合物涂层