经过治疗后，选定青霉素在山羊乳中的残留减少情况

《Small Ruminant Research》：Residue depletion profiles of selected penicillins in goat milk after therapeutic treatment

　　米里亚姆·施罗德 | 纳迪亚·耶斯贝格 | 亨里克·瓦格纳 | 埃瓦尔德·乌斯莱贝尔 | 阿克塞尔·韦伦德 | 玛德琳·普洛茨
吉森尤斯图斯-李比希大学兽医学院兽医食品科学研究所乳品科学系

**摘要**
本研究描述了山羊在细菌感染治疗后期奶中某些青霉素的定量分析结果。第1组（系统感染，n=5）通过肌肉注射阿莫西林（AMX，7 mg/kg体重，5天内分5次）进行治疗；第2组（乳腺炎，n=6）则在半个乳房内通过乳房注射奥沙西林/氨苄西林（OXA/AMP，40/20 mg，4天内分4次）进行治疗。乳房样本通过酶免疫测定法进行分析，检测限分别为：AMX为1 ng/ml，OXA为30 ng/ml，OXA/AMP混合物为2 ng/ml。治疗期间AMX残留量在1至160 ng/ml之间波动，但在停药期前1天降至1 ng/ml以下。除一个样本外，所有样本中的AMX浓度在最后一次用药后2天就已低于欧盟规定的最大残留限量（MRL，4 ng/ml）。治疗侧的乳房中OXA含量波动较大（<30 ng/ml至1.2 mg/ml）。未经治疗的乳房中的奶也含有OXA，但浓度较低（<30–410 ng/ml），并在停药期前1.5天降至MRL以下。OXA和AMP的联合分析表明，在停药期前至少1天，总残留量远低于4 ng/ml。这是首次在真实山羊养殖条件下关于OXA在奶中排泄情况的定量研究。所有分析的山羊在停药期后（OXA为4天，AMX为4.5天）的奶均符合欧盟法规要求。

**1. 引言**
对于泌乳山羊的细菌感染进行抗菌治疗以及这些抗生素通过奶排泄的问题，目前相关研究较少，尤其是在药物残留的监管方面（Richards等人，2022年）。根据欧盟法规（EU）37/2010（欧盟委员会，2009年），所有泌乳动物的奶中某些重要青霉素的最大残留限量（MRL）为4 ng/ml（阿莫西林[AMX]、氨苄西林[AMP]），异唑烷基青霉素（奥沙西林[OXA]为30 ng/ml）。此外，兽药的使用受到法规（EU）2019/6（欧盟委员会，2019年）的规范，该法规还详细规定了超出标签用途使用抗生素的规则（例如，使用未获批准用于该物种的抗生素治疗山羊）。鉴于适用于泌乳山羊的抗生素种类有限且不断变化（欧洲药品管理局，2025年），在这种情况下可能不得不使用仅适用于泌乳牛的抗生素来治疗山羊的细菌感染（Gehring等人，2006年）。根据法规（EU）2019/6第113条的规定（自2022年起生效），此时需要对奶设定比其他物种长1.5倍的停药期。如果药物或制剂未被批准用于产奶动物，则需设定7天的停药期（欧盟委员会，2019年）。目前关于青霉素等常用抗生素在山羊体内排泄情况的定量数据非常缺乏（Lianou和Fthenakis，2022年；Moon等人，2010年），尤其是在出现临床症状的动物中（Richards等人，2022年）。因此，鉴于如果产品中检测到违规药物残留会对山羊奶生产商带来的法律和经济损失，停药期是否足以确保残留物完全清除仍存在不确定性。尽管奶牛场通常会遵守抗生素的使用规定并设定停药期（Lianou和Fthenakis，2022年），但仍可能出现管理失误，或者兽医处方并未得到严格遵守（Doidge等人，2020年；Landfield等人，2018年；Lianou和Fthenakis，2022年）。目前已有针对奶中抗生素的常规检测方法（Beltrán等人，2014年；Comunian等人，2010年；Berruga等人，2016年；Sierra等人，2009a；Sierra等人，2009b）。免疫化学方法或液相色谱/质谱（LC/MS）方法虽较少用于常规检测，但在定量分析中可能较为重要（Attaie等人，2015年；El Badawy等人，2019年；Jia等人，2021年；Kress等人，2007年；Litterio等人，2020年；Lorenzutti等人，2017年；Tardiveau等人，2022年）。

在之前的一项研究中，作者描述了使用视觉侧向流动设备快速检测山羊奶中β-内酰胺类残留物的适用性（Schroeder等人，2021年）。本研究分析了因临床细菌性疾病（如乳腺炎、肺炎）而接受青霉素治疗的泌乳山羊的奶样。尽管这些检测方法灵敏度较高，但无法获得与MRL相关的定量数据。因此，本报告的重点是提供定量排泄数据，以评估这些药物在实际生产条件下的消除情况及其是否符合MRL要求。由于德国山羊养殖规模较小且缺乏像牛奶那样严格的检测体系，关于山羊奶中抗生素残留频率的数据几乎不存在。本研究旨在初步评估某些重要青霉素在山羊奶生产中的使用是否会造成残留问题，尤其是停药期是否能为实际生产提供足够的安全保障。

**2. 材料与方法**
**2.1. 山羊奶样本**
奶样采集自德国两家商业奶牛场（共600只和130只泌乳山羊），历时四个月（Schr?der等人，2021年），这些样本可用于本研究。纳入研究的动物均为兽医诊断为细菌感染并需接受抗生素治疗的山羊。根据具体疾病类型，奶样分为两组：第1组（n=5）为患有系统感染的动物，第2组（n=6）为患有乳腺炎的动物。这些动物属于斑点德高羊（BDE）和白德高羊（WDE）或杂交品种（KRZ），体重在40–50公斤之间。部分动物信息见表S1。山羊每天挤奶两次，每次采集两侧乳房的奶样。

挤奶使用挤奶机进行，因此无法获得个体产奶量数据。对照奶样在开始治疗前立即采集（样本0-0），持续采集至停药期后3天。采集后的奶样立即冷冻并储存在-18°C。残留分析在采集后4–6周内完成。鉴于所有研究中的青霉素在-18°C存储时稳定性良好（Riediker等人，2004年），我们认为残留物降解可以忽略不计。

第1组的所有动物均接受了阿莫西林（Betamox Injection?，Norbrook，北爱尔兰）的肌肉注射（超出标签用途），这是德国用于泌乳牛系统感染治疗的常用制剂。该注射液每毫升含172.2 mg阿莫西林三水合物（相当于150 mg AMX）。对山羊的使用剂量与牛、羊和猪相同（7 mg/kg体重，即每10公斤体重使用0.5 ml注射液）。连续五天每天注射一次，每次注射间隔24小时。这种制剂的牛奶停药期为3天。由于超出标签用途使用，根据法规（EU）2019/6第113条，山羊奶的停药期为4.5天（欧盟委员会，2019年）。

第2组（n=6）的动物中有一侧乳房被诊断为卡他性乳腺炎，仅对该侧乳房进行乳房注射治疗（使用Totocillin?，Bayer，勒沃库森）。治疗时，这是德国唯一获准用于山羊乳腺炎的乳房注射制剂。每支注射器含440 mg奥沙西林钠（相当于400 mg OXA）和231 mg氨苄西林三水合物（相当于200 mg AMP）。注射在每次挤奶后立即进行，每日四次。停药期为4天。

**2.2. 酶免疫测定法（EIAs）**
所有奶样均使用先前开发的竞争性微量滴定板ELAs进行定量分析，这些方法适用于牛奶检测。AMP、OXA和AMX的标准品购买自Sigma-Aldrich和Merck（德国）。奶样加热至25°C后，取2 ml样本在3,000 rpm下离心15分钟。脂肪部分用于ELAs检测，稀释比例为1:2、1:10（AMP）、1:2（AMX）和1:2、1:3（OXA），稀释液为不含抗菌剂的10%脱脂奶粉。每个稀释比例的微滴定板系统分析四个重复孔。

对于第1组的AMX残留量测定，以及第2组的AMX和OXA联合测定，使用了通用的竞争性直接ELAs方法（Strasser等人，2003年）。该检测方法也曾用于检测山羊奶中的青霉素G残留（Kress等人，2007年）。该抗体可检测所有含有β-内酰胺-噻唑烷环结构的青霉素，但不能检测头孢菌素。如果奶样中仅含有一种特定青霉素（如第1组中的AMX），即使标准品曲线上未包含该青霉素，该方法仍可用于残留量测定。表S2总结了使用AMX或AMP/OXA标准品的通用青霉素ELA的检测参数。对于第1组的AMX测定，使用AMX标准品曲线，其截断值为0.6 ng/ml。对于同时含有AMP和OXA的第2组奶样，虽然使用了AMX标准品曲线（截断值0.35 ng/ml），但由于OXA的交叉反应较低，当OXA:AMP比例为2:1时会导致实际残留量被低估约50%（表S3）。因此该方法仅用于半定量分析。对于第2组中OXA的特异性测定，使用了另一种能特异性检测异唑烷基青霉素的ELA系统（Usleber等人，1994年；Dietrich等人，1996年），该系统使用OXA标准品曲线，截断值为15 ng/ml。所有检测方法均通过重复分析添加了三种抗生素的脱脂山羊奶样进行验证，其浓度接近或达到相应的MRL。

**3. 结果**
**3.1. ELA检测评估**
AMX的检测限为1 ng/ml（表S1），在4 ng/ml和8 ng/ml濃度下表现良好（相对标准偏差RSD 25%），接近MRL（4 ng/ml，见表S3）。OXA的检测限为30 ng/ml，符合MRL要求，在40 ng/ml和60 ng/ml浓度下的相对标准偏差分别为17%（表S2和S3）。由于该方法是基于OXA在奶中的30 ng/ml检测限设计的，无法检测低于MRL的残留量，且第2组奶样中同时含有AMP和OXA，因此通用青霉素ELA仅用于估算停药期结束时这两种物质的联合残留量。当奶样中AMX和OXA的比例为1:2（与注射悬浮液相同）时，该方法的回收率略高于50%，但OXA的交叉反应较低（RSD 5.4%）。因此，该方法适用于停药期前后山羊奶的质量控制分析。**第1组：肌肉注射AMX后的排泄情况**
系统性地给予五次每公斤体重7毫克的AMX肌肉注射后，在整个治疗期间，所有山羊的牛奶中均检测到了AMX残留物，平均浓度为10-50 ng/ml（见图1和表1）。不同山羊之间的差异显著：其中两只山羊（G6、G9）的残留物水平较低（接近最低残留限量MRL），另外两只山羊（G2、G8）的残留物水平中等偏高；而山羊G7的其中一个乳房的残留物水平异常高，超过了MRL达100倍。有四只山羊的两个乳房之间的AMX浓度差异相对较小（平均RSD为17-35%），而G7的两个乳房之间的平均RSD为107%。G7的右侧乳房在最后一次AMX注射后的排泄时间也最长（见表1）。最后一次治疗后，所有山羊的牛奶中AMX浓度在五次挤奶后均降至MRL以下（2.5天内），第六次挤奶后所有样本的AMX浓度均呈阴性（<1 ng/ml）。

**图1.** 五只山羊（分别检测左右乳房）在接受每次7毫克/公斤体重的Betamox注射液?重复肌肉注射后的平均AMX残留物水平（ng/ml）。X轴表示相应的挤奶次数。0-0表示治疗前对照样本。牛奶中AMX的MRL为4 ng/ml。EIA检测限为1 ng/ml。

**表1.** 在接受每次7毫克/公斤体重的重复肌肉注射后，山羊牛奶中AMX残留物水平的EIA检测结果（ng/ml）。

**第2组：乳房内注射AMP和OXA后的排泄情况**
图2和表2显示了乳房内注射OXA的山羊牛奶样本的结果。在治疗期间的四天内，受治疗乳房中的OXA浓度达到了非常高的水平，其中一只山羊G4的一个样本中OXA浓度高达1.2 mg/ml。然而，不同山羊之间的残留物降解量差异巨大，最高相差达10,000倍。五只山羊在第一次注射后的第一次挤奶中检测到了药物残留物；而山羊G14则是在第三次挤奶时才检测到OXA。另一方面，G14的OXA浓度降至MRL（30 ng/ml）需要五次挤奶的时间比其他山羊长2-3次挤奶间隔。五只未受治疗乳房的牛奶在特定EIA系统中检测出OXA阳性结果，但只有G14的样本始终低于30 ng/ml的检测限。此外，通过通用青霉素EIA检测，两个样本中发现了低水平的OXA/AMP组合，浓度分别为4.7 ng/ml和13 ng/ml。与受治疗的乳房相比，未受治疗乳房的OXA浓度至少低一个数量级。在接近OXA EIA检测限的样本中，OXA和AMP的总残留量（OXA+AMP）显示，在停药期结束前的最后一次挤奶时，所有乳房的样本均呈阴性（<1 ng/ml）。

**图2.** 六只山羊（分别检测左右乳房）在接受每次7毫克/公斤体重的Totocillin?乳房内注射后，牛奶中的OXA（ng/ml）以及OXA+AMP（ng/ml）的平均残留水平。X轴表示相应的挤奶次数。OXA和AMP的MRL分别为30 ng/ml和4 ng/ml。OXA EIA的检测限为30 ng/ml，通用青霉素EIA（OXA+AMP）的检测限为1 ng/ml。

**讨论**
本研究首次提供了在实际商业奶牛场条件下，患有细菌性疾病泌乳山羊牛奶中药物残留的数据。目前尚无完全可比的研究。使用健康山羊进行的已发表研究也非常少（Richards等人，2022年），且这些研究使用的是不同的抗生素、剂量或给药途径。
本研究的一个主要局限在于牛奶样本来自两个商业养羊场（分别有600只和130只泌乳山羊），这些样本仅是在山羊因特定临床诊断需要接受抗生素治疗时获得的。两个养羊场的整体健康状况较好，因此在四个月的研究期间只有少数山羊发病。具体来说，仅有五只（第1组）和六只（第2组）山羊的牛奶可以进行分析。此外，由于所有山羊都使用标准挤奶机挤奶，因此无法获得个体产奶量的数据。出于统计原因，如欧洲药品管理局等监管机构在其指导方针中要求，如果需要计算停药期，则每个组至少需要使用20只（或更多）山羊（EMEA，2000年；Ferrini等人，2010年；Schmerold等人，2023年）。然而，本研究的目的是初步了解当前抗菌治疗做法（欧洲委员会，2019年）是否会导致牛奶中药物残留的风险。尽管目前已有适用于山羊牛奶的定性现场检测方法（Sierra等人，2009a、2009b；Comunian，2010年；Beltran等人，2014年；Berruga等人，2016年；Schr?der等人，2021年），但关于临床患病山羊牛奶的定量数据仍缺失。

**结论**
本研究首次提供了在商业养羊场条件下，山羊牛奶中AMX、OXA和AMP残留的定量数据，涵盖了整个给药和停药期。数据显示，即使在同一时间点，不同山羊之间的药物残留水平也存在很大差异。在研究的所有山羊中，停药期结束时均未检测到违规的药物残留量。结果表明，只要严格遵循剂量、给药和停药期的指示，这些抗生素在患有细菌性疾病山羊中的使用不会增加牛奶中违规残留的风险。