长期耕作土壤中有机碳固存的机制：微生物作用的重要性超过活性矿物保护作用

《Soil and Tillage Research》：Mechanisms of organic carbon sequestration in long-term tilled soils: The primacy of microbial over active mineral protection

　　尹小雷|姜明|陈捷|克里斯·弗里曼|于晓飞|卢先国|秦磊|邹园春
中国科学院东北地理与农业生态研究所吉林省长白山湿地与生态联合重点实验室及星开湖湿地生态系统国家野外观测与研究站，长春130102，吉林省，中国

**摘要**
在当前的土壤碳循环模型中，微生物和矿物质驱动的有机物动态对于维持农业环境的可持续性至关重要。然而，在调节农业土壤中有机质（SOC）积累方面，矿物质和微生物的重要性可能存在较大差异。本研究利用一个耕地耕作时间序列（土壤有机质（SOC）含量为22.1–49.8克/千克）的数据，分析了碳利用效率（CUE）、周转时间、微生物呼吸速率（qCO?）、微生物死尸碳（MNC）以及碳积累的矿物质驱动因素。结果表明，随着SOC的流失，活性矿物结合有机质（bound OC）的数量也显著减少，且bound OC与矿物质的摩尔比显著下降。与碳贫瘠的土壤相比，碳富集的土壤表现出更高的微生物碳利用效率（CUE，0.47对比0.28）和更低的微生物代谢商（qCO?）。微生物死尸碳（MNC，占SOC的28.9–61.6%）在整个降解梯度上呈现共变模式。不同SOC浓度的土壤之间微生物吸收效率没有差异，但低碳土壤中的qCO?显著较高。这些发现表明，土壤CUE的下降主要是由于qCO?的增加所致。我们强调，在土壤耕作过程中，活性矿物质含量（Fed, Ald）并不是bound OC积累的限制条件，而微生物产生的碳含量减少是导致土壤bound OC含量降低的根本原因。总体而言，微生物生理特性（CUE, qCO?）和微生物产生的碳与土壤碳积累的关联度高于活性矿物质。对于未来农业土壤中碳封存的研究，应进一步探讨微生物群落的碳周转功能，以寻找潜在的土壤环境改进措施，从而提高其碳积累速率。

**1. 引言**
维持农业土壤的碳库功能已被认为是对全球气候问题和粮食安全的有效响应（Ma等人，2023；Nazir等人，2024）。然而，连续的耕作活动和环境退化导致了一系列退化过程，如有机质的流失和农业土壤中微生物群落的不稳定（Coban等人，2022）。另一方面，与自然生态系统不同，农业土地受到人为干扰（施肥、耕作和灌溉），导致土壤矿物质（Fe, Al）含量的显著变化（Zhang和Han，2023）。中国东北的黑土区是世界上三大黑土区之一，多年的连续耕作导致黑土层变薄，有机质含量逐渐减少（Peng等人，2023）。近年来，黑土区的持续农业耕作使土壤有机质含量减少了三分之一（Wang等人，2023）。目前碳循环模型中，微生物和矿物质驱动的有机物动态是维持土壤环境可持续性的核心（Xiao等人，2023；Li等人，2024b）。然而，关于土地退化过程中生物和非生物因素在调节SOC积累方面相对重要性的研究较少，这阻碍了对SOC如何响应环境干扰的预测。

长期以来，人们认识到土壤微生物产生的碳是土壤碳库的重要组成部分，其生产和固定是由微生物生理特性（如碳利用效率（CUE）和微生物生物量周转时间）以及活性矿物质（Fe, Al等）驱动的复杂过程（Liang等人，2017；Cai等人，2022）。其中，微生物CUE代表了用于微生物生长的同化碳的比例，是土壤碳封存的重要指标（Wang等人，2021；Tao等人，2023）。微生物生长速率（qGrowth）和周转时间决定了微生物死尸碳（MNC）的积累水平（Wang等人，2021）。活性矿物结合有机质（bound OC）主要来源于吸附在土壤矿物质表面的微生物残余碳；因此，微生物生理特性可以通过影响土壤微生物产生的碳量来影响bound OC的积累（Wang等人，2022）。矿物质对MNC的吸附可以减缓MNC的分解，这是微生物产生的碳在总土壤有机质中占比较高的重要原因（Zhou等人，2024）。大多数土壤中活性矿物质与有机物质的结合处于未饱和状态（Georgiou等人，2022；Begill等人，2023），表明bound OC的积累主要受微生物驱动的碳输入控制。另一方面，土壤矿物质对碳的固定形式多样，OC与矿物质的摩尔比可以反映bound OC的形态和稳定性（Wagai和Mayer，2007）。比率大于1表示土壤中矿物质和碳以共沉淀形式结合，这是一种相对稳定的结合形式。此外，OC与矿物质的较高摩尔比也表明矿物质对碳的固定效率更高（Longman等人，2022）。总体而言，微生物和土壤矿物质都对土壤中有机碳的稳定和积累有贡献，这一点在不同生态系统中的研究得到了证实。Xiao等人（2023）提出了一个关于矿物质和微生物协同作用促进碳积累的理论模型，补充了“微生物碳泵”理论中的非生物部分。值得注意的是，土壤微生物产生的碳和部分植物产生的碳可以通过“矿物碳泵”在土壤中稳定下来，这一过程是可持续的。然而，一些当前的研究提出了不同的观点，认为土壤微生物和矿物质在不同环境中对碳积累的贡献不等，它们对碳动态的贡献存在较大差异（Craig等人，2022；Wang等人，2024；Zhu等人，2024）。研究表明，在土壤风化梯度上，增强矿物质保护而非微生物死尸碳生产决定了矿物结合有机碳的积累（Zhu等人，2024）。在另一项大陆尺度研究中，当考虑不同的碳输入条件时，微生物生理特性并不影响矿物结合碳的积累，微生物驱动的碳积累也与微生物生理特性脱钩（Craig等人，2022）。鉴于微生物死尸产物的产生不足以解释死尸碳的积累，在精细化有机碳模型时有时需要分别对微生物生理特性和微生物死尸碳进行建模。为了解决这些不确定性，我们在中国东北的Mollisols土壤上进行了一个耕作时间序列（0–100年）的野外调查。这种时空相结合的方法使我们能够研究土壤碳库及其潜在驱动因素在降解强度梯度上的共同演变。本研究的具体目标是：（1）量化这一时间序列中土壤有机质（SOC）、微生物产生的碳（微生物死尸碳、微生物生物量碳）、矿物结合有机质（Bound OC）、微生物生理特性（碳利用效率、微生物呼吸商、死尸积累系数）以及活性矿物质（Fe, Al）的变化；（2）评估这些微生物和矿物质驱动因素与SOC及其保护组分动态之间的关联强度。

在长期耕作的土壤中，土壤有机质的流失通常伴随着土壤微生物结构的破坏和碳封存功能的下降。基于已建立的“微生物碳泵”和“矿物碳泵”的概念框架，以及农生态系统中矿物质吸附位点的普遍未饱和状态，我们提出以下假设：在土壤退化过程中，微生物过程（CUE、呼吸作用和死尸积累）是土壤碳积累的主要驱动因素，而活性矿物质并非SOC封存的关键限制因素。

**2. 方法**
2.1. 研究区域特征
本研究位于中国东北黑龙江省三江平原中部的宝清县（46°20′ N, 132°12′ E），海拔约70米。该地区具有温带大陆性季风气候，年平均气温为4.6°C，年平均降水量约为500毫米。地形较为平坦，这是三江平原典型的地貌特征，便于选择地形条件相对可比的试验地点。根据USDA土壤分类法，这些土壤被归类为Mollisols，其特征是有机质含量较高，粉砂含量约为50–60%（表S1）。在农业开垦之前，该地区主要被自然湿地覆盖，包括以Phragmites australis和Deyeuxia angustifolia为主的芦苇湿地和湿草甸湿地。这些自然湿地生态系统是当前农田的原始土地覆盖类型，因此为解释长期耕作对土壤有机质（SOC）动态的影响提供了生态基准。在过去一个世纪中，该地区的大片自然湿地逐渐被开垦为农田，尤其是在1950年至1990年间。这种从湿地到农田的长期转换导致土壤结构发生显著变化，SOC大量流失，使宝清县成为研究长期耕作Mollisols中SOC损失和稳定机制的代表性场地（Li等人，2022；Li等人，2024a）。

2.2. 耕作时间序列建立和土壤采样
为了研究长期耕作土壤中有机碳封存的机制，我们采用时空替代方法建立了耕地时间序列。在同一耕作区域选择了9个具有0、20、30、40、50、60、80、90和100年耕作历史的地点。选择这些地点是为了确保主要背景因素尽可能相似，包括土壤类型、土壤质地、地形位置和长期耕作制度，从而尽量减少地点异质性的干扰。0年地点代表未开垦的自然湿地土壤，作为开垦前的参考。每个地点的耕作年龄根据农场开垦记录和当地田间管理人员提供的信息确定。此外，补充材料中提供了土壤养分状况、土壤水分含量、粒径分布和pH值等背景土壤环境变量，以进一步记录所选地点的环境背景。

为了减少农艺管理差异的影响，所有耕作地点都持续种植玉米（Zea mays L.），采用大致相同的本地管理措施。玉米通常在5月份播种，10月份收获。农场采用传统的垄作系统，每年进行一次耕作，收获后清除所有地上作物残余物。该地区的施肥方式随时间有所变化。20世纪80年代之前，农业生产主要依靠有机肥料和作物残余物，几乎不使用合成肥料。自20世纪80年代以来，随着化学肥料的广泛应用，管理方式逐渐转向有机肥料和合成肥料的结合使用。在当前标准化耕作系统下，合成肥料的施用量大约为每公顷200公斤氮（N）、75公斤五氧化二磷（P2O5）和60公斤钾（K2O）。所有作物都在无灌溉的雨养条件下生长。这些大致相似的农艺措施确保了观察到的地点间差异主要由耕作持续时间而非近期管理变化引起。采样地点的基本土壤性质见补充表1。

土壤样本采集于2023年4月，在作物种植前进行，以避免植物根系和碳输入对实验的干扰。在每个研究地点随机设置了三个10米×10米的样方（间距50米），从每个样方采集10个0–25厘米深的土壤样本并混合。采集后的土壤样本在低温下运输到实验室，并移除了岩石和植物根系。土壤被分成两部分。**附件说明：**

- 文档包含表格数据和图表，建议使用支持查看PDF格式的软件进行阅读和下载。
- 若需要将图片下载为高分辨率或全尺寸版本，请根据提示操作。
- 文中提及的统计分析和方法部分使用了特定的统计软件（如R、Agilent、Thermo Scientific等），具体软件名称和版本信息在文档中未详细列出。

**主要内容概括：**

本研究通过对土壤样品进行处理和实验分析，研究了土壤碳库的变化规律、微生物碳的利用效率以及微生物与土壤矿物质的相互作用。主要发现包括：
- 土壤有机碳（SOC）含量随栽培时间增加而增加，但结合态有机碳（Bound OC）和微生物生物量碳（MBC）的含量有所下降。
- 低碳土壤的微生物碳利用效率（CUE）较低，且微生物衍生碳（FNC、BNC、MBC）的含量与SOC呈正相关。
- 微生物生物量与微生物死亡物质碳（NAC）之间存在正相关关系。
- 细菌和真菌的死亡物质碳含量与微生物碳利用效率显著相关。
- 土壤矿物质的性质对碳库成分和微生物生理特性有重要影响。

**具体数据展示：**

- 土壤有机碳（SOC）范围为22.1–49.8克/千克，平均值为30.4克/千克。
- 结合态有机碳（Bound OC）含量为2.1–7.8克/千克，占SOC的9.5–26.7%。
- 微生物生物量碳（MBC）含量为0.7–3.3克/千克，微生物死亡物质碳（NAC）含量为7.0–23.3克/千克。
- 随着栽培时间的延长，土壤MBC含量下降，微生物死亡物质碳积累系数增加。

**结论：**

土壤栽培过程中SOC和结合态有机碳减少，而微生物生物量碳和死亡物质碳的含量有所变化。微生物碳利用效率和微生物生物量之间的正相关关系表明，它们共同促进了微生物死亡物质碳的积累。此外，土壤矿物质性质对碳库成分和微生物生理特性有显著影响。这些发现为改进土壤管理提供了理论依据。在我们的研究中，土壤微生物控制了结合态OC与(0.5Fe+Al)的摩尔比，该比例随着微生物碳利用效率(CUE)和微生物衍生的碳（MNC、MBC）的增加而增加（p < 0.05）（图5）。相反，随着氮吸附碳(NAC)的增加，结合态OC与(0.5Fe+Al)的摩尔比降低（p < 0.05）。结合态OC与(0.5Fe+Al)与土壤中的Fe和Al含量呈线性负相关（R2 = 0.71和R2 = 0.56）（图5）。

**图4. 土壤中金属结合态OC的驱动因素。**(A-B) 微生物生理特征对结合态OC的影响。(C-D) 微生物死细胞碳对结合态OC的影响。(E-F) 微生物生物量碳对结合态OC的影响。(G-H) 总氮(TN)和pH值对结合态OC的影响。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

**图5. 土壤中结合态OC与(0.5Fe+Al)的驱动因素。**(A-B) 微生物生理特征对结合态OC与(0.5Fe+Al)的影响。(C-D) 微生物死细胞碳对结合态OC与(0.5Fe+Al)的影响。(E) 死细胞积累系数对结合态OC与(0.5Fe+Al)的影响。(F-G) 活性金属矿物对结合态OC与(0.5Fe+Al)的影响。(H) pH值对结合态OC与(0.5Fe+Al)的影响。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。**

**3.5. 确定土壤碳积累的关键因素**
在这项研究中，我们探讨了退化土壤中有机碳(SOC)和结合态OC的矿物和微生物驱动过程（图6、7）。结果表明，土地耕作过程伴随着SOC的流失和结合态OC的显著减少。结合态OC与(0.5Fe+Al)的摩尔比显著降低（图1）。路径分析显示，土壤耕作导致微生物CUE和MNC含量的显著减少，这是影响土壤碳积累的主要因素。即使由于耕作增加了活性矿物，也没有提高土壤碳的固定能力。活性矿物的增加是结合态OC与(0.5Fe+Al)摩尔比显著下降的主要原因。为了进一步分析土壤有机碳积累的驱动因素，我们采用了变异分解分析。变异分解分析表明，土壤性质和微生物共同解释了SOC池中93.2%的变异（图6D）。这些结果表明，在解释土壤耕作过程中的有机碳动态方面，微生物驱动的作用强于活性矿物。总体而言，显著较低的土壤CUE是土壤耕作期间SOC流失的主要原因。MNC含量的减少和活性矿物的增加导致了矿物固定碳效率的下降。

**图6. 土壤耕作过程对**(A) SOC、(B) 结合态OC以及**(C) 结合态OC与(0.5Fe+Al)的影响（偏最小二乘路径模型分析）。微生物衍生的碳(BNC、FNC、MBC)、土壤性质（pH、水分含量）和微生物生理特征（CUE、周转时间、qGrowth、qUptake）对土壤碳积累的影响。*表示p < 0.05，**表示p < 0.01。

**图7. 本研究的概念模型图，展示了土壤耕作过程中微生物和矿物对有机碳积累的影响。(A) 与碳贫瘠的土壤相比，碳富集的土壤具有更高的CUE和MNC浓度以及更低的qCO2。(B) 微生物生理特征通过调节MNC的产生在控制土壤碳积累中起着更大的作用。微生物驱动了更多的有机碳变化，而活性矿物则更多的影响了矿物结合态有机碳的形成。**

**4. 讨论**
**4.1. 土壤耕作过程中微生物和微生物生理特性**
当前的土壤碳循环模型表明，微生物控制着土壤碳的输入和排放，较高的CUE和MNC有利于土壤有机碳的积累（Kallenbach等，2015；Kang等，2024）。我们的结果支持碳富集土壤具有比低碳土壤更高的CUE和MNC含量的理论（图2）。这些发现表明，在土壤耕作过程中，微生物驱动了有机碳的积累。不同SOC含量的土壤中微生物吸收效率没有差异，但低碳土壤中的qCO2显著更高。这些发现表明，微生物的碳吸收能力在不同有机碳含量的土壤中没有变化，低碳土壤中CUE的降低主要是由于qCO2的增加。根据微生物生理权衡理论，在有机物含量较低的土壤中，微生物能量投资的增加会导致生长速率的下降（Manzoni等，2012；Malik等，2018）。这种微生物生理特性的变化在以往的研究中已有充分记录（Malik等，2018）。我们的研究证实，土壤微生物死细胞碳（MNC）是SOC的主要组成部分（平均占44.2%），这一比例与全球报告的高值范围一致（Liang等，2019），强调了即使在退化条件下，微生物衍生碳在维持土壤有机碳库中的关键作用。MNC的这一重要贡献支持了“微生物效率-矩阵稳定”框架，即微生物衍生的碳控制着矿物相关有机物的积累，更高的微生物生长效率促进了更多的结合态OC形成（Cotrufo等，2013）。因此，我们的结果表明，MNC不仅代表了一个重要的碳库，还直接调节了矿物结合态碳的含量，将微生物生理效率与耕作土壤中的长期碳稳定联系起来。

土壤氮吸附碳(NAC)被定义为每单位微生物生物量积累的MNC（Hou等，2024）。Han等（2024）通过元分析验证了NAC与土壤碳含量之间的正相关关系。然而，这一正相关关系在我们的研究中并未得到证实（图2C）。由于土壤耕作过程中微生物残留物和活性生物量的不对称减少，MBC比MNC更快地减少，以及活性微生物对外部环境变化的更敏感反应，导致NAC与SOC之间的脱钩。在土壤耕作过程中，MNC/SOC和结合态OC/SOC之间没有显著差异（图S2），这表明土壤碳的损失是一个涉及不同碳组分的过程，而MNC和结合态OC作为周转较慢的有机碳也容易受到环境变化的影响。

总之，微生物对土壤有机碳动态的影响远远超出了它们作为死细胞来源的直接贡献。作为土壤碳循环的基本调节器，微生物生理特性决定了碳在矿化途径和稳定途径之间的分配（Tao等，2023）。观察到的碳利用效率(CUE)下降和代谢商(qCO?)增加表明了这种调节功能的恶化。这种变化不仅直接减少了微生物死细胞——SOC的主要组成部分——的产量，还限制了有机输入在土壤基质内转化和稳定的整体途径。因此，微生物死细胞碳(MNC)与SOC损失之间的强相关性反映了由于微生物碳代谢受损而引起的级联效应，而不仅仅是简单的碳库替代。尽管植物衍生的碳形式有助于SOC的积累，但它们的分解、转化和最终稳定同样受到这种总体微生物代谢的控制。我们的研究表明，维持土壤微生物群落的调节能力对于维持农业生态系统的碳汇功能至关重要。

**4.2. 退化土壤中碳积累的矿物与微生物驱动因素**
先前的研究已经证明了活性矿物对土壤碳积累的积极作用，并指出矿物和微生物在土壤碳固定中都起着重要作用（Xiao等，2023）。我们强调了微生物生理特性和MNC积累在调节土壤碳动态中的重要性，更重要的是，我们没有发现活性矿物对土壤碳积累有正面影响。这些发现与一些先前研究的结果不一致（Jeewani等，2021；Wang等，2024）。这是因为我们的研究基于田间耕作序列，而耕作土壤的特点是有机物的流失；通常，土壤微生物群落的功能也会受到干扰，这影响了微生物的CUE以及微生物驱动的碳生产。因此，矿物和微生物在碳固定中的协同效应发生了变化。耕作将富含矿物的下层土壤带入耕作层，直接增加了活性矿物的储量并暴露了新的矿物表面。耕作后的环境——具有增强的水渗透性、通气性以及温度和湿度的波动——加速了这些表面的风化，促进了结晶Fe/Al相向更活泼的非晶形式的转化（Zhu等，2024）。此外，长期的耕作管理实践和自然淋溶作用促进了碱金属离子(K、Na、Ca、Mg)的流失，同时相对富集了不易移动的Fe和Al氧化物，从而加速了土壤中Fe/Al的富集过程（Zhang和Han，2023）。随着耕作序列的变化，生物和非生物因素的反向变化可以使我们的假设更加令人信服。另一方面，大多数土壤矿物对碳固定是不饱和的，这种不饱和在农业土壤中尤为明显（Georgiou等，2022）。结合态OC的产生可能在很大程度上受到MNC输入量的控制，当微生物CUE降低或MNC积累减少时，增加的活性矿物不会促进结合态OC的积累。在水稻土壤中的研究证实了这一推测，当土壤结合态OC不饱和时，微生物代谢控制着矿物相关碳的积累（Li等，2024c）。我们的结果显示，结合态OC随着SOC的流失而减少，这表明活性矿物浓度的增加并没有导致结合态OC含量的增加。

结合态OC与(0.5Fe+Al)的摩尔比从碳富集土壤显著降低到碳贫瘠土壤（6.3–0.6），表明活性矿物和碳的结合形式从共沉淀变为吸附。研究表明，对于相同的碳铁比，共沉淀物的化学稳定性高于吸附复合体，共沉淀物具有更大的碳固定潜力（Chen等，2014）。结合态OC与(0.5Fe+Al)摩尔比的变化是由于两个因素：活性矿物浓度的增加和MNC含量的减少。因此，当土壤矿物未饱和吸附碳时，活性矿物的增加对矿物结合态有机碳的影响更大。总体而言，我们的发现揭示了土壤退化过程中微生物和活性矿物作用的明显权衡：微生物生理特性主要控制碳的输入和积累，而活性矿物影响矿物结合态碳的结合形式。为了解释这些差异，我们提出了一个概念模型（图6）。活性矿物浓度的增加并没有阻止MNC降低时结合态OC的分解。因此，土壤微生物是导致土壤耕作过程中有机物损失的主要驱动因素。改善土壤环境以增强微生物群落的碳周转功能有助于增加农业土壤中的有机碳积累。上述结果可能为“矿物碳泵”和“微生物碳泵”概念的整合提供理论支持。

**5. 结论**
我们比较了不同SOC含量土壤中微生物生理特性、微生物衍生的碳和活性矿物对碳积累的影响。结果表明，随着SOC的流失，活性矿物结合态有机碳（结合态OC）的量也显著减少，结合态OC与矿物的摩尔比显著降低。与碳贫瘠土壤相比，碳富集土壤具有更高的CUE（0.47 vs. 0.28），并且微生物CUE驱动了MNC的积累。微生物生理特性与土壤碳积累的关系比活性矿物更强。虽然微生物过程在控制SOC积累量方面比活性矿物起更大的作用，但活性矿物主要决定了矿物结合态碳的结合效率，如结合态OC与(0.5Fe+Al)的摩尔比所示。这项研究的结果为农业土地利用期间的生物和非生物过程提供了宝贵的见解。对于未来关于农业土壤中碳封存的研究，应进一步探讨微生物群落的碳周转功能，以找出能够改善土壤环境的潜在途径，从而提高其碳积累速度。

CRediT作者贡献声明：
余晓飞：撰写、审阅与编辑，监督工作；
克里斯·弗里曼（Chris Freeman）：监督工作、软件使用指导；
陈骥（Ji Chen）：正式数据分析；
姜明（Ming Jiang）：监督工作；
邹园春（Yuanchun Zou）：撰写、审阅与编辑；
卢贤国（Xianguo Lu）：监督工作；
秦磊（Lei Qin）：撰写初稿、数据整理；
尹小蕾（Xiaolei Yin）：撰写初稿。