基于纳米脂囊的镁叶绿素递送系统在农业中的光动力灭活应用

《Small Science》：Nanovesicle-Based Delivery of Magnesium Chlorophyllin for Photodynamic Inactivation in Agriculture

　　摘要

光动力灭活为农业提供了一种广谱的抗病原体策略，但需要有效地将光动力活化剂传递到目标位置才能发挥其效果。在此，我们证明了基于十二烷基苯磺酸钠（SDBS）和溴化十六甲基三甲铵（CTAB）的纳米囊泡，通过添加改性剂来增强或降低双层膜的稳定性，可以封装并改善叶绿素镁盐（Mg-chl）的功能性。这些纳米囊泡的尺寸小至约90纳米，Mg-chl的封装效率可超过60%。在纳米囊泡膜中引入不饱和改性剂后，可以在重新湿润时触发Mg-chl的释放；而引入疏水基团则通过更受扩散控制的机制显著减缓Mg-chl的释放。在模拟的田间条件下，这些纳米囊泡能够显著提高对植物病原体丁香假单胞菌（P. syringae）的光激活杀灭效果，在暴露于纳米囊泡后五分钟内即可观察到快速的结合和/或细菌摄取。此外，纳米囊泡还促进了Mg-chl在植物根部的渗透。这种增强抗菌活性和可调光敏剂摄取能力的组合，为提高作物保护提供了希望。

缩写



aPDI
抗菌光动力灭活



CTAB
溴化十六甲基三甲铵



CFU
菌落形成单位



CLSM
共聚焦激光扫描显微镜



EE
封装效率



Mg-chl
叶绿素镁盐



PALS
相分析光散射



PEG
聚乙二醇



ROS
活性氧



SDBS
十二烷基苯磺酸钠



TEM
透射电子显微镜



1 引言

抗菌光动力灭活（aPDI）利用光敏分子在光照下与氧气反应产生细胞毒性活性氧（ROS），这些活性氧能够氧化细胞内的多种生物分子，导致各种结构成分（如膜、细胞器和细胞骨架）严重受损，从而几乎立即杀死微生物[1, 2]。由于其针对真菌、细菌和病毒（包括耐药菌株）的广谱作用，aPDI在医学领域引起了极大的兴趣[3]。最近，由于许多相同的原因，aPDI在农业应用中也受到了越来越多的关注：目前可用的杀虫剂类别相对较少，能够有效对抗多种病原体[4]；耐药菌株的治疗变得越来越具有挑战性[5]；而且aPDI对细菌造成的广泛损伤限制了植物微生物发展出耐受性或抗性的可能性[6]。然而，大多数光敏分子快速的光降解、有限的溶解度和通常较低的生物利用度，给aPDI在农业中的应用带来了重大挑战。更具体地说，由于ROS产生的位置靠近病原体对于其功能至关重要，而ROS的短寿命导致扩散距离有限，因此光降解和低溶解度大大降低了光敏剂接近目标病原体以实现有效杀灭的概率[7]。此外，革兰氏阴性细菌通常对aPDI的敏感性较低，因为它们的不透性外膜限制了阴离子和中性分子的渗透，通常需要同时施用破坏膜的物质，如金属螯合剂[8, 9]、肽[10]或阳离子分子[11, 12]才能实现有效杀灭[13]。通过谨慎选择光敏剂，可以在一定程度上解决这些挑战。在这方面，从天然存在的叶绿素衍生的环状四吡咯类光敏剂最具前景，因为它们能够吸收太阳光照射范围内的大部分光子[14]。叶绿素镁盐（Mg-chl, E-140）特别值得关注，因为它是一种半合成的水溶性叶绿素衍生物，在阳光激活下能有效生成单线态氧（1O2）[15, 16]，从而在体外对植物病原菌和真菌具有高杀灭效果。然而，Mg-chl在田间的实际应用受到多种因素的阻碍：(a) Mg-chl的光和化学稳定性相对较低，在阳光下暴露6小时后，其活性损失超过90%[17]；(b) 由于其卟啉分子的固有两亲性，其水溶性有限，严重阻碍了其在植物中的吸收和生物利用度，限制了有效利用的剂量选择[18, 19]；(c) 自由Mg-chl产生的单线态氧在激活后迅速生成，这使得难以实现与典型农民喷洒计划更兼容的长期抗菌效果[20]。因此，开发改进的Mg-chl溶解、稳定和传递策略对于其在农业中的实际应用至关重要。工程纳米粒子作为一种有效的策略，已经出现，用于解决农业中传统和新兴生物活性物质有效利用的多种挑战[21]。纳米粒子可以保护生物活性物质免受恶劣环境条件的化学降解[22]，降低生物活性物质的植物毒性[23]，并改善脂质或两亲性有机农药的水分散性，从而提高吸收、生物利用度和靶向控制传递[23, 24]。已经报道了多种不同类型的纳米材料，包括金属纳米粒子（如金或银）[26]、氧化金属纳米粒子（如MgO、CaO、ZnO和TiO2）[27-29]、碳纳米管[30, 31]、聚乳酸-羟基乙酸共聚物纳米粒子[32]、壳聚糖纳米凝胶[33, 34]、脂质体[35]以及基于表面活性剂的纳米胶束[36, 37]，这些纳米材料能够传递各种农药来控制不同的植物疾病和/或促进植物生长。由两亲性物质（如磷脂或表面活性剂）自组装形成的纳米囊泡也已被报道能够传递多种药物、营养物质和生物活性化合物[38, 39]。与其他载体相比，纳米囊泡特别适合同时装载亲水（在水核中）和疏水（在双层膜中）的生物活性物质[40]，这对于传递像Mg-chl这样的低溶解度生物活性物质特别有利。此外，纳米囊泡与细胞膜的相似结构有助于提高纳米粒子进入细胞的效率，有利于增加植物内部ROS产生的生物利用度[41, 42]。据报道，在特定环境条件（如光照、热量或pH值）下，纳米囊泡可以可控地解体[43]，从而实现靶向传递，使ROS生成物在感染部位释放。我们之前报道了基于阴离子十二烷基苯磺酸钠（SDBS）和阳离子十六甲基三甲铵（CTAB）的表面活性剂混合纳米囊泡的制备，这两种商业上高稳定性且价格低廉的表面活性剂可用于将铜叶绿素传递到植物中，由于纳米囊泡封装作用，显示出改善的光稳定性、持续释放和显著提高的生物活性物质在植物中的渗透性[44]。在此，我们采用这种策略开发了改进的混合纳米囊泡，用于有效封装和传递Mg-chl，以实现农业应用中的光动力灭活（图1）。通过调节纳米囊泡膜的稳定性，使其削弱（类型I）或增强（类型II）双层膜的稳定性，我们证明了纳米囊泡在植物吸收和根除革兰氏阴性植物病原体丁香假单胞菌pv tabacci方面的功能性。我们预计，SDBS-CTAB混合纳米囊泡可以作为有效的纳米载体，既能在较长时间内向植物传递光动力活性的Mg-chl，又能增强生物活性物质在植物中的渗透，从而提高Mg-chl的抗菌效果。更具体地说，我们证明了基于表面活性剂的纳米囊泡可以封装光敏剂，而不影响其光动力特性，同时增加光敏剂在组织中的渗透性，为提高光敏剂的有效病原体控制能力提供多功能优势。

图1：展示两种类型改性的表面活性剂混合纳米囊泡的示意图。类型I：改性剂掺入纳米囊泡中以削弱膜双层包装，从而促进生物活性物质的释放；类型II：改性剂掺入纳米囊泡中以增强表面活性剂尾部的包装，从而减少生物活性物质的释放。

2 材料与方法

2.1 材料

叶绿素镁盐（Mg-chl）购自有机草本公司（中国长沙）。十二烷基苯磺酸钠（SDBS）、溴化十六甲基三甲铵（CTAB）、胆固醇、Brij 10和Tween 20购自Sigma–Aldrich（加拿大安大略省奥克维尔）。聚乙二醇（PEG）酯（PEG-3、5和10）由Croda加拿大有限公司（加拿大安大略省沃恩）提供。所有实验均使用MilliQ超纯水净化系统（EMD Millipore，美国马萨诸塞州比勒里卡）净化的水。

2.2 表面活性剂混合纳米囊泡的制备

制备表面活性剂混合纳米囊泡的方法改编自我们之前的工作[44]。分别制备了10 mM的SDBS和CTAB溶液（pH值调至7.5的10 mM磷酸盐缓冲液中）。将0.1%（w/w）的Mg-chl在SDBS溶液中完全溶解，并在300 rpm的磁力搅拌下孵育15分钟，然后按照之前确定的4:1优化混合摩尔比加入CTAB溶液，以避免对植物的植物毒性[44]。为了制备改性纳米囊泡，随后将改性剂成分（聚乙二醇酯、胆固醇、Tween 20或Brij C10）与表面活性剂混合物在300 rpm下混合，直到所有前体表面活性剂完全分散。然后在9000 rpm下（T25数字ULTRA-TURRAX，美国北卡罗来纳州威尔明顿的IKA Works Inc.）均质化7分钟，随后在冰浴中使用高强度探针超声仪（Qsonica Q700，美国康涅狄格州纽敦）以700 W功率和20 kHz频率超声处理2分钟（静态间隔：2秒）以生成纳米囊泡。未负载的纳米囊泡采用相同方法制备，但不包含Mg-chl成分。所有纳米囊泡都储存在氮气环境下，置于4°C下的玻璃小瓶中，并在制备后一周内进行测试。

2.3 纳米囊泡的特性分析

2.3.1 粒径分布

使用动态光散射（Model 90 Plus，美国纽约州霍尔茨维尔的Brookhaven Instruments）在640 nm激光波长和90°散射角度下测定纳米囊泡的强度加权流体力学直径和多分散性。将第2.2节制备的纳米囊泡悬浮液在10 mM磷酸盐缓冲液（pH 7.5）中稀释10倍，并在25°C下进行测量。进行了五次重复测量，误差条代表这些测量的标准偏差。

2.3.2 Zeta电位

使用相分析光散射（PALS）（Model 90 Plus，美国纽约州霍尔茨维尔的Brookhaven Instruments）测定纳米囊泡的Zeta电位，方法是将制备的纳米囊泡悬浮液在10 mM磷酸盐缓冲液中稀释10倍，并在25°C下使用60 mW激光功率和25 V/cm的电场进行测试（每个样本重复5次，误差条代表标准偏差）。

2.3.3 粒子形态

通过透射电子显微镜（TEM）测量装载了生物活性物质的纳米囊泡的形态。将纳米囊泡悬浮液在10 mM磷酸盐缓冲液中稀释10倍，然后将一滴悬浮液滴在Formvar涂层的200目Cu/Pd网格上并静置10分钟。小心地从边缘吸干多余的纳米囊泡分散液，并用50 μL的1%（w/w）醋酸铀水溶液负染色20秒，然后轻轻吸去多余的染色剂。使用JEOL JEM 1200EX透射电子显微镜（JEOL，美国马萨诸塞州皮博迪）在80 kV的加速电压下进行成像。

2.3.4 封装效率

通过量化封装后的自由和总生物活性物质含量（μg）来确定Mg-chl在纳米囊泡中的封装效率（EE）。为了测量自由（未封装）的生物活性物质，将1 mL的表面活性剂纳米囊泡悬浮液在360,000 × g的Sorvall WX90+超速离心机（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州瓦尔瑟姆）中离心40分钟，以分离未封装和封装的生物活性物质。上清液（未封装的生物活性物质）被去除，并在10 mM磷酸盐缓冲液中稀释20倍，然后使用微板读数器（Infinite M1000 PRO，瑞士M?nnedorf）通过紫外分光光度法进行分析，特别跟踪Mg-chl吸收谱中最显著的峰值（400 nm）[45]。为了验证峰值波长，对Mg-chl进行了完整的UV–vis扫描（图S1），结果显示在400 nm和654 nm处有两个吸收峰；由于400 nm峰的强度较高（使得浓度测量更加灵敏），因此选择了400 nm峰作为测量吸收波长。使用吸收值与自由生物活性物质浓度的校准曲线来确定自由生物活性物质的浓度（μg/mL）。为了排除Mg-chl在水相中降解可能带来的复杂效应，每天在新鲜制备的样本上立即测量封装效率（EE）。实验重复三次，误差条对应于重复样本的标准偏差。纳米囊泡中的封装效率（EE）根据公式（1）确定。