一种基于近红外萘酰亚胺的荧光探针，可用于实时成像活细胞中的小分子硫醇

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A near-infrared naphthalimide-based fluorescent probe for real-time imaging of small-molecule thiols in living cells

　　

马明月|王紫艺|薛冰|王明宇|陈世军|宋建星|舒伟|曾超远|池伟杰

海南大学化学与化学工程学院，热带海洋工程材料与材料评价国家重点实验室，海口，570228，中国

摘要

我们合理设计并合成了一种新型近红外荧光探针(E)-2-丁基-5-(2-(3-(二氰亚甲基)-5,5-二甲基环己-1-烯-1-基)乙烯基)-1,3-二氧-2,3-二氢-1H-苯[de]异喹啉-6-基-2,4-二硝基苯磺酸盐(NA-BH)，用于检测和监测活体系统中半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)和硫化氢(H?S)的动态变化。该探针对小分子巯基化合物(Cys、Hcy和H?S)表现出显著的荧光增强响应，而对谷胱甘肽(GSH)的响应较弱。鉴于Cys在细胞内含量更高且具有更强的病理生理相关性，本研究以Cys为代表，评估了该探针的响应机制、光谱性能和活细胞成像能力。NA-BH通过光诱导电子转移发挥作用，其发射峰位于732 nm，Stokes位移为123 nm。这些光学特性有助于深入组织渗透，并减少背景自发荧光的干扰。通过与2,4-二硝基苯磺酰基的特异性亲核取代反应，可实现Cys和H?S的检测，从而产生明显的荧光开关响应。NA-BH对Cys和H?S具有高灵敏度，响应速度快，检测限低。重要的是，细胞成像实验证实该探针能够实时动态区分和监测活细胞内内源性和外源性小分子生物硫醇的水平。这种探针为推进与Cys相关的生理和病理研究提供了可靠且高效的分子工具。

引言

生物硫醇是一类重要的内源性抗氧化剂，能有效清除活性氧(ROS)和自由基，从而维持细胞的氧化还原平衡[1]、[2]。作为活体生物体内丰富、高反应性和广泛分布的硫醇分子，半胱氨酸(Cys)在调节抗氧化信号通路中起着关键作用[3]、[4]。此外，Cys还参与细胞内蛋白质合成、代谢解毒和翻译后修饰等关键生理过程[5]、[6]。研究表明，健康人体血浆中总Cys的浓度范围约为30–200 μM[7]，异常的Cys水平与多种疾病的发病和进展密切相关。Cys不足会削弱身体的抗氧化防御系统，影响蛋白质合成和免疫功能[8]，而Cys水平升高则与代谢紊乱、结石形成、器官损伤以及心血管疾病风险增加有关[9]。因此，开发高效且选择性强的方法来定性和定量分析Cys已成为生命科学分析化学中的重要挑战。

目前，检测Cys的常用方法包括电化学分析[10]、质谱[11]、色谱[12]和光谱技术[13]。其中，荧光探针方法因其操作简便、高选择性、高灵敏度、实时快速监测和低细胞毒性而受到广泛关注[14]、[15]、[16]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。近年来，已有若干能够检测Cys的荧光探针被报道[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]。2024年，张等人设计并合成了一种新型荧光探针LN-NCS，用于靶向溶酶体中的Cys，其发射波长为560 nm，Stokes位移为140 nm，细胞毒性低，检测限为16.3 nM，选择性高[32]。2025年，侯等人开发了一种近红外荧光探针，用于检测溶酶体中的Cys，发射波长为688 nm，具有很强的特异性、高灵敏度、低细胞毒性和较快的响应时间，工作范围广[33]。然而，同时具备大Stokes位移、快速响应和高选择性的近红外Cys荧光探针仍较为罕见。大多数现有探针的发射波长较短(<700 nm)[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]，容易受到组织自发荧光和光散射的干扰，从而影响成像质量。相比之下，近红外探针具有更深的组织穿透能力和更低的自发荧光背景，从而提高信噪比和检测深度。此外，较大的Stokes位移可以减少激发光谱和发射光谱之间的串扰[34]。而且，近红外成像造成的光损伤较小，可以有效克服传统光学成像的许多限制[35]、[36]、[37]、[38]。2,4-二硝基苯磺酰基能与多种小分子巯基和硫化氢发生亲核取代反应，使NA-BH天然具有对多种生物相关硫物种的响应能力。尽管这些分析物在生理作用和浓度上存在差异，我们仍选择Cys作为主要模型，系统评估该探针的性能，并研究其对Hcy、H?S和GSH的响应。

萘酰亚胺衍生物是一类高性能荧光材料，具有较大的Stokes位移、高荧光量子产率和优良的光稳定性，使其成为构建荧光探针的理想荧光团[39]。在本研究中，我们通过对萘酰亚胺母体结构进行合理修饰，并引入2,4-二硝基苯磺酰氯基作为Cys识别单元，设计合成了一种新型近红外荧光探针NA-BH[40]。该识别基团与Cys发生特异性亲核取代反应，触发荧光开关响应。与先前报道的Cys探针相比，NA-BH具有更好的光物理和传感性能(图1和表S1)。其发射峰位于732 nm，Stokes位移为123 nm。NA-BH具有低细胞毒性、优异的选择性、快速的响应时间(30 min)和低检测限(36.8 nM)。细胞成像实验证实，NA-BH能够实时动态区分和监测活细胞内Cys水平的內源性和外源性波动。因此，这种探针为推进与Cys相关的生理和病理研究提供了可靠且高效的分子工具。

章节片段

仪器和材料

荧光光谱是在Hitachi FL4700荧光光谱仪(日本)上记录的。¹H NMR和¹³C NMR光谱使用Bruker 400 MHz NMR光谱仪获得。UV–Vis吸收光谱是用Cary 60光谱仪(Agilent Technologies, 美国)测量的。除非另有说明，所有溶剂和试剂均来自商业渠道，未经进一步纯化即可使用。

探针NA-BH溶液的制备

将探针NA-BH溶解在DMSO中，制备1 mmol/L的储备溶液。使用时...

探针与Cys相互作用的光谱分析

为了评估探针NA-BH检测Cys的准确性和效率，我们首先研究了其反应动力学。如图2a所示，探针的Stokes位移为123 nm。当向探针溶液中加入Cys后，系统在732 nm处的荧光强度迅速增强，并在30分钟内达到峰值，随后稳定下来(图2b，图S1)，表明NA-BH对Cys能快速响应。此外，在pH=7.4的PBS缓冲液中...

结论

本研究成功开发了一种新型近红外荧光探针NA-BH，该探针能够敏感地检测小分子生物硫醇Cys和Hcy以及H?S，并有效抵抗GSH的干扰。NA-BH在光学性能方面具有显著优势：其发射波长为732 nm，属于近红外区域，Stokes位移为123 nm。这不仅有助于深入组织渗透，还能有效减少生物自发荧光的干扰

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的利益冲突或个人关系。

致谢

本工作得到了国家自然科学基金(编号：32360236、22574038)、热带海洋工程材料与材料评价国家重点实验室的自助研究基金(编号：STOEM99536323)、以及海南大学化学与化学工程学院基础化学实验教学中心(编号：S202510589125、HXDC2025018)的财政支持。