基于拉曼光谱的精浆代谢指纹图谱分析揭示了可育男性间的差异性代谢谱

《Steroids》：Raman spectroscopy-based metabolic fingerprinting of seminal plasma reveals distinct profiles among fertile men

　　

传统精液分析为男性生育力评估提供了有价值的见解，但无法全面捕捉精子功能背后的完整生化复杂性。本研究利用拉曼光谱（Raman spectroscopy）分析精浆代谢组，以探索可育男性间的代谢变异性。在一项横断面设计中，研究人员收集了29名临床可育男性（n = 29）的精液样本，并依据世界卫生组织（WHO）指南进行分析。代谢物采用甲醇/水（3:1）提取，并应用拉曼光谱生成精浆的代谢指纹图谱。多变量统计分析，包括主成分分析（Principal Component Analysis, PCA）和正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis, OPLS-DA），揭示了可育男性中存在两个不同的代谢亚组。研究人员在苯丙氨酸、醇类、烷烃、醛类和酰胺等关键生化特征中发现了显著差异。OPLS-DA模型展示了出色的分类性能（R2X = 0.942， R2Y = 0.992， Q2= 0.987），表明亚组分离稳健且预测效度高。这些发现表明，即使在正常精子症个体中，精浆也表现出显著的代谢异质性。因此，基于拉曼光谱的代谢组学指纹图谱分析是一种有前景的补充诊断工具，可补充传统精液分析，为更深入地理解男性生殖生理学以及为未来生育研究中生物标志物的发现提供基础。

研究背景、问题与目的

传统精液分析是男性生育力评估的基石，但其在捕捉男性生育力的多因素复杂性方面存在局限，难以解释特发性不育或准确预测生殖结局。尽管世界卫生组织（WHO）制定了标准化指南，但全球实验室的执行情况不一，导致数据报告和诊断可靠性存在不一致性。此外，精液分析在区分可育与生育力低下男性方面的临床效用也受到质疑。精浆并非被动介质，而是由睾丸、附睾、精囊和前列腺产生的复杂分子组成的动态生物流体，参与精子成熟、获能和抗氧化等关键生理过程。因此，精浆代谢组学分析为超越传统精液评估、更深入地了解男性生育力提供了机会。代谢组学作为一种全面分析生物系统中小分子代谢物的方法，在生殖医学中展现出前景，能提供个体功能表型的高分辨率、系统水平理解。在男性生育力背景下，代谢组学研究已揭示了患有精索静脉曲张、少弱畸形精子症（Oligoasthenoteratozoospermia, OAT）、无精子症等男性精浆成分的明显改变。其中，拉曼光谱等光谱学方法因其非破坏性、获取速度快且能检测生物样本中广泛官能团而受到关注。然而，目前对可育男性自身的代谢多样性理解仍存在关键空白。大多数研究聚焦于病理状况，但即使在正常精子症个体中，精浆成分的变异性也可能反映了潜在的生理异质性。这种个体间的代谢差异可能为受精能力、对环境影响的敏感性或辅助生殖技术（Assisted Reproductive Technology, ART）反应的差异提供线索。此外，在可育个体中建立参考代谢指纹图谱，可能有助于识别生育力低下或不明原因不育病例中的细微偏差。为填补这一知识空白，本研究利用拉曼光谱技术，旨在探究29名经证实的可育男性的精浆代谢指纹图谱，并使用多变量统计工具（如主成分分析和正交偏最小二乘判别分析）来揭示该可育人群中是否存在不同的代谢亚组。这项研究顺应了将先进分子诊断技术整合到标准生育力评估方案中的趋势。

主要技术方法

本研究是一项横断面研究，样本来自29名临床可育男性（均在采样前三年内证实生育，且符合WHO 2021年正常精子症标准）。精液样本经液化后，依据WHO第六版实验室手册进行常规分析。研究人员通过离心分离精浆，用甲醇/水（3:1）混合液进行代谢物提取和蛋白质沉淀。使用配备785 nm激发激光的Almega Thermo Nicolet色散型拉曼光谱仪采集精浆提取物的拉曼光谱，光谱范围为100–4200 cm^?1。数据处理使用Spectragryph软件进行预处理，包括基线校正、平滑和归一化。统计分析主要采用SIMCA软件进行多变量分析，包括主成分分析以评估聚类模式和识别离群值，以及正交偏最小二乘判别分析以区分亚组代谢谱。模型的稳健性通过累积R²X、R²Y和Q²值、7折交叉验证和200次置换检验进行评估。此外，还进行了单变量分析（Mann-Whitney U检验）并对多重比较进行了错误发现率（False Discovery Rate, FDR）校正。

研究结果

3.1. 精浆的代谢谱

主成分分析（PCA）得分图揭示了可育男性精浆中存在不同的聚类模式，表明即使在正常精子症人群中，个体间也存在有意义的生化异质性。图中清晰地显示了两个亚组：代谢谱紧密聚类的第1组和离散度更大的第2组。正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）模型展示了出色的分类性能（R²X = 0.942， R²Y = 0.992， Q²= 0.987），支持了可育人群内存在不同代谢表型的观点。置换检验验证了模型具有高度的可预测性。

3.2. 代谢组模式

通过对官能团改变进行光谱解读进一步探索了代谢指纹。研究观察到了涉及氨基酸、脂质和氧化途径的多个官能团的明显峰值差异。研究人员在9个官能团中发现了第1组与第2组之间的显著改变。具体而言，苯丙氨酸、醇类、烷烃、含硫基团、醛类、烷烃（CH）和酰胺在第二组中均显著上调。这些发现表明两组之间存在氧化还原和脂质代谢的转变，可能反映了氧化应激状态或蛋白质周转的差异。

3.3. 精液参数

尽管所有参与者均符合WHO的生育力标准，但两组在精液量、精子计数、总活力和形态学方面仍观察到差异。例如，第1组显示出相对较高的精子活力和正常形态，并与醇类和苯丙氨酸等某些官能团水平升高相关。而第2组则显示出醛和酰胺峰的升高，可能反映了氧化还原平衡或蛋白质降解的改变。相关性分析显示，在校正多重检验后，主要光谱成分与精液参数（包括浓度、形态和活力分数）之间无统计学显著关联。

讨论与结论

本研究通过应用拉曼光谱检测精浆中的代谢组学变异，为可育男性间的生化多样性提供了新的见解。尽管所有参与者都符合临床生育力标准，但多变量分析揭示了不同的代谢谱，表明标准精液参数可能无法完全捕捉男性生殖健康的全部生理谱。研究发现的苯丙氨酸、醇类、烷烃、醛类和酰胺等官能团的显著差异，在功能上与精子膜组成、氧化过程和能量代谢相关。该研究的一个关键方法学优势在于应用了拉曼光谱技术，这是一种快速、非破坏性且需要最少样品处理的技术。精液分析结果也为生物学变异性提供了支持证据。临床上，这些结果提出了代谢指纹图谱可作为生殖评估辅助工具的可能性，即使在可育男性中也能进行分层。这种分层可能有助于预测辅助生殖技术（ART）的结局，或识别精子功能的亚临床脆弱性。然而，本研究存在局限性，主要包括样本量相对较小、缺乏独立的外部验证队列，且拉曼光谱无法提供直接的分子鉴定。未来需要在更大规模、多中心的研究中结合质谱或核磁共振（NMR）验证来确认代谢物身份并探索其机制基础。

研究结论

本研究表明，利用拉曼光谱对精浆进行代谢指纹图谱分析，可以在精液常规参数相似的可育男性中揭示不同的生化谱。特定官能团改变（尤其涉及苯丙氨酸、醇类、烷烃、醛类和酰胺）的识别，凸显了代谢组学在捕捉与男性生殖健康相关的细微生理差异方面的潜力。这些发现表明，精浆代谢组包含具有临床价值的信息，可补充标准精液分析，为更深入地理解精子功能和生育潜力提供依据。未来需要对更大规模、更多样化的队列进行多平台代谢组学验证研究，以完善这些生物标志物，并评估其在自然和辅助生殖背景下的预测效用。