一种用于硝化还原酶的近红外荧光探针，具备I型光动力效应和药物释放能力

《Talanta》：A near-infrared fluorescent probe for nitroreductase with type I photodynamic effect and drug release capability

　　

韩增|严林|华曼丽|王宏宇|王静波|彭思远|侯世聪

中国农业大学理学院，北京100193，中华人民共和国

摘要

将化疗与光动力疗法结合使用受到了关注，因为这种组合通常比单一疗法具有更好的治疗效果。在这项研究中，我们合成了一种前药型硝基还原酶荧光探针CB。当CB未发生反应时，几乎不发出荧光信号；与NTR反应后，它会释放出具有近红外I区发射（708 nm）的光敏剂CB-OH以及吲哚美辛。该探针具有较快的响应时间（36分钟）、较低的检测限（46.16 ng/mL）和良好的生物相容性。光敏剂CB-OH的I型光动力效应使其在缺氧的肿瘤环境中发挥更高效的作用。这表明CB探针不仅具有优异的成像性能，还具有结合光动力化疗的潜力。

引言

缺氧是实体肿瘤组织的重要特征。由于肿瘤组织的生长速度远超过血液供应能力，肿瘤组织内的血管排列混乱，部分组织距离血管较远，血液流动缓慢[1]，[2]。因此，实体肿瘤中常见缺氧区域。研究表明，肿瘤的缺氧状态与肿瘤增殖、侵袭和药物抗性密切相关[3]，[4]。因此，检测肿瘤中的缺氧程度对于早期肿瘤评估和进展评估具有重要意义。在缺氧条件下，细胞会过度表达某些在正常氧条件下不存在的还原酶[5]，[6]，[7]，[8]，[9]，[10]，[11]，[12]，这些还原酶成为检测细胞缺氧水平的可靠标志物。硝基还原酶（NTR）是一类以黄素单核苷酸（FMN）或黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）作为辅基的还原酶。在β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）或β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸2'-磷酸（NADPH）等电子供体存在下，NTR可以将硝基芳香化合物和硝基杂环衍生物的硝基还原为氨基或羟胺基[13]，[14]，[15]。研究表明，NTR的浓度与细胞缺氧程度密切相关，是评估细胞缺氧的可靠生物标志物[16]，[17]，[18]，[19]，[20]，[21]，[22]，[23]。荧光探针因其操作简便、灵敏度高、对生物样本损伤小以及在活体系统中可实现可视化等优点，已成为检测生物标志物的有效方法[24]，[25]。

光动力疗法（PDT）通过光敏剂在光照下生成高度氧化的活性氧物种（ROS）来达到杀细胞的效果[26]，[27]，[28]，[29]。根据ROS的生成类型和机制，光敏剂可分为I型和II型。II型光敏剂主要生成O₂，其效果依赖于氧气浓度；而I型光敏剂主要生成·OH和·O₂^-，其效果对氧气浓度的依赖性较低。鉴于实体肿瘤组织的缺氧特性，I型光敏剂的应用潜力大于II型光敏剂[30]，[31]，[32]。然而，单独使用光动力疗法的效果常常受到光漂白和肿瘤微环境对ROS生成抑制等因素的限制。因此，结合化疗和光动力疗法的策略受到了研究人员的广泛关注[33]。研究表明，肿瘤细胞中COX-2的表达水平升高，与肿瘤迁移和血管生成密切相关[34]，[35]，[36]，[37]。吲哚美辛是一种非甾体抗炎药，可以抑制COX介导的前列腺素E2的合成，从而缓解肿瘤微环境的免疫抑制作用并抑制肿瘤进展[38]，[39]，[40]。受此启发，我们旨在将吲哚美辛化疗与光动力疗法结合，以增强肿瘤抑制效果。

在这项研究中，基于传统的药物传递骨架2,6-双（羟甲基）-对甲酚，我们成功合成了一种前药型荧光探针CB，该方法将光敏剂CB-OH、COX抑制剂吲哚美辛和硝基还原酶识别基团连接在一起。与NTR反应后，该探针会释放出具有近红外I区发射的光敏剂CB-OH和吲哚美辛。近红外I区的发射使探针信号具有很强的抗干扰能力和组织穿透能力[41]，[42]。I型光动力效应对氧气的依赖性较低，从而在缺氧的肿瘤环境中产生更好的杀细胞效果。释放出的吲哚美辛可抑制COX-2的表达，进而抑制肿瘤的血管生成和迁移，实现化疗和光动力疗法的联合效果。

片段

实验方法

探针CB的合成步骤和表征详见支持信息。

探针CB的设计和光谱特性

我们设计了一种对硝基还原酶响应的前药型荧光探针CB，将环氧化酶抑制剂吲哚美辛、光敏剂CB-OH和NTR识别基团连接到药物释放骨架2-羟基-5-甲基苯-1,3-二甲醇上。当CB与NTR反应时，通过一系列自毁裂解作用释放出吲哚美辛和CB-OH。

我们研究了CB的基本荧光特性。首先，对其UV-Vis吸收光谱进行了研究。

结论

总之，我们成功合成了一种可被NTR激活的前药型荧光探针CB。该探针具有近红外I区（708 nm）发射、高灵敏度和良好的生物相容性以及强的抗干扰能力。经NTR激活后，探针释放出光敏剂CB-OH和COX抑制剂吲哚美辛。EPR光谱表明，CB-OH通过I型光动力机制生成自由基，这一过程对氧气浓度要求较低。

作者贡献声明

华曼丽：软件和资源支持。韩增：撰写初稿、方法设计和实验研究。严林：方法设计、实验研究和数据分析。彭思远：方法设计、实验研究和数据分析。侯世聪：撰写、审稿与编辑、项目管理和资金申请。王宏宇：方法设计、实验研究。王静波：方法设计、实验研究

利益声明

无

资金来源

本工作得到了中国农业大学的支持[项目编号：69194031]。

利益冲突声明

作者声明没有已知的利益冲突或个人关系可能影响本文的研究结果。