对用于靶向与非靶向液相色谱-质谱代谢组学分析的固相萃取策略的全面评估

《Talanta》：A comprehensive evaluation of solid-phase extraction strategies for targeted and untargeted liquid chromatography – mass spectrometry metabolomic analysis

　　

Eva Cífková|Miroslav Lísa|Zdeňka Neuerová|Ond?ej Kereste?

克拉科夫赫拉德茨大学理学院化学系，Rokitanského 62号，50003 克拉科夫赫拉德茨，捷克共和国

摘要

样品制备仍然是液相色谱-质谱（LC-MS）代谢组学分析中最关键和最具挑战性的步骤之一，因为它直接影响到代谢物的回收率以及分析的准确性和可靠性。在这项研究中，我们系统比较了用于血清样品制备的固相萃取（SPE）策略，包括在靶向和非靶向代谢组学方法中的应用。共分析了71种具有不同结构和极性特征的代谢物，使用了多种SPE格式，如含有多种吸附剂的分散型SPE、SPE旋蒸柱、SPE吸头和传统的SPE卡盘。同一种萃取方式下的不同吸附剂获得了相似的结果。亲水性相互作用液相色谱吸附剂在广泛的极性范围内表现最佳，而反相吸附剂则更适合中等极性的化合物。离子交换吸附剂由于对pH值的强烈依赖性，在广泛覆盖代谢物方面存在局限性，但与其他吸附剂结合使用时可以提高可电离化合物的回收率。尽管不同的SPE格式具有相似的萃取效率，但其重复性有所不同，其中旋蒸柱的表现优于传统卡盘。与蛋白质沉淀（PPT）相比，SPE在靶向分析中更能减轻基质效应，尤其是在处理高极性代谢物时。虽然PPT在非靶向分析中效率更高，但SPE可将特征覆盖范围提高50%。在商业产品中，亲水-疏水平衡（HLB）吸附剂表现出更优的效率和重现性，HLB填充的旋蒸柱为LC-MS代谢组学分析提供了最通用且稳健的性能。

引言

代谢组学致力于对生物系统中的低分子量化合物（即代谢物）进行全面研究。代谢组与表型密切相关，并反映了生物体在疾病或环境因素影响下的生理状态。因此，代谢物的变化被广泛研究作为各种状况的潜在生物标志物。液相色谱-质谱（LC-MS）已成为代谢组学分析的主要分析平台，具有广泛的代谢组覆盖范围和高灵敏度¹。尽管技术取得了显著进展，样品制备仍然是代谢组学研究中的关键步骤，因为它影响结果的准确性和可靠性。

选择合适的样品制备策略取决于分析目的。对于靶向代谢组学而言，萃取效率尤为重要，尤其是对于痕量水平的代谢物。相反，非靶向（全局）代谢组学需要尽可能广泛地覆盖整个代谢组²。在这两种方法中，有效去除干扰性大分子和基质成分对于减少电喷雾离子化（ESI）过程中的离子抑制以及确保可靠定量至关重要。此外，在样品制备过程中必须严格避免对代谢组的人工改变。

对于尿液或唾液等较简单的生物液体，可以使用缓冲液进行简单稀释³。然而，这种方法不适用于富含蛋白质的样本，如血清或组织。蛋白质沉淀（PPT）仍是基于LC-MS的代谢组学中最常用且最多功能的样品制备技术^(3),(4),(5)。该技术通常涉及添加极性有机溶剂，如甲醇（MeOH）^{(4),(6),(7),(8),(9),(10),(11)}、乙醇⁵或乙腈（ACN）^{(5),(12),(13)}，以及甲酸（FA）¹⁴和三氯乙酸¹⁵。得到的上清液可以直接分析或进一步处理。液-液萃取通过基于甲基叔丁基醚¹⁶、氯仿^{(17),(18),(19)}或二氯甲烷²⁰的混合物，根据极性将代谢物分离到两个相中。这种方法产生的提取物适用于脂质组学和代谢组学分析，但由于代谢物在相间的分配受其分配系数和萃取混合物组成的影响，其萃取效率可能低于PPT。

固相萃取（SPE）被广泛用于靶向代谢组学³。SPE可以实现样品预浓缩， compared with 液-液萃取，减少溶剂消耗，并具有较高的自动化潜力，从而降低样品制备误差²¹。传统的SPE使用装有吸附剂颗粒的卡盘，溶剂流动由真空或正压驱动。此外还出现了其他SPE格式，包括集成到离心过滤装置中的吸附剂²²或以整体相位形式存在的吸头^23),(24)，以及膜盘²⁵。分散型SPE（dSPE）相比商业产品具有优势，因为它允许根据目标分析物的特性选择合适的吸附剂²⁶。在这些替代格式中，溶剂流动和吸附剂颗粒的分离通常通过离心完成²⁷。无论采用哪种具体的SPE格式，在靶向和非靶向代谢组学中，选择具有足够萃取效率或代谢组覆盖范围的吸附剂都是关键因素。

在代谢组学中应用了多种吸附剂，包括反相（RP）、亲水性相互作用液相色谱（HILIC）、离子交换（IEX）和混合模式（MM）材料。为了提高覆盖率和回收率，经常结合使用具有互补特性的吸附剂。例如，RP相（C18或C8）与聚苯乙烯-二乙烯基苯^(25),(28)或IEX吸附剂（阴离子²⁹或阳离子³⁰）。亲水-疏水平衡（HLB）⁵和MM²⁹吸附剂也被用来扩展极性范围。

尽管已有几项研究比较了蛋白质沉淀与传统SPE卡盘在全局代谢组学中的效果^{(31),(32),(33),(34)}，但没有研究将它们与替代的SPE微萃取格式进行对比。这些方法可能相对于PPT和基于卡盘的SPE提高代谢物覆盖率，并且还能减少样品和溶剂的消耗³⁵。dSPE、吸头和旋蒸柱程序的应用主要集中在特定的目标分析物组，如精神活性物质³⁶、蜕皮激素³⁷、酮胺代谢物³⁸或儿茶酚胺³⁹，而不是全面的代谢组谱分析。迄今为止，还没有系统研究在统一条件下比较各种SPE格式在靶向和非靶向LC-MS代谢组学中的应用。本研究通过评估广泛的吸附剂化学性质和SPE格式，并使用标准化的工作流程来识别具有稳健性能和广泛代谢物覆盖率的萃取策略，从而填补了这一空白。

章节片段

化学物质和材料

ACN、MeOH、丙烷-2-醇（2-PrOH）、甲酸铵（AmF）和氢氧化铵（≥25%）均从Honeywell（美国北卡罗来纳州夏洛特）购买。LC-MS级水从Merck（德国达姆施塔特）购买。表1中列出的SPE吸附剂、旋蒸柱、吸头和卡盘分别从Affinisep（法国勒乌尔姆）、Agilent Technologies（美国圣克拉拉）、United Chemical Technologies（美国宾夕法尼亚州布里斯托尔）和Thermo Fisher Scientific购买

结果与讨论

本研究的主要目的是评估SPE在靶向和非靶向LC-MS代谢组学分析中的样品制备性能。为此，测试了多种使用商业产品的SPE格式，包括17种用于dSPE的吸附剂、4种SPE旋蒸柱、2种SPE吸头和4种传统SPE卡盘（表1）。所有SPE程序遵循相同的方案（图1），包括相同的样品、萃取步骤、LC-MS条件和数据

结论

本研究旨在评估各种SPE方法作为LC-MS基于的代谢组学分析样品制备过程的性能。HILIC吸附剂对极性到中等极性的代谢物表现出优异的效率，而RP吸附剂对中等极性化合物的回收率更好。IEX吸附剂对pH值有很强的依赖性，这限制了其在广泛覆盖代谢物方面的应用。然而，IEX吸附剂与其他吸附剂结合使用可以增强

CRediT作者贡献声明

Ond?ej Kereste?：研究。Zdeňka Neuerová：研究、数据管理。Miroslav Lísa：撰写——初稿、监督、项目管理、方法学、资金获取、概念化。Eva Cífková：撰写——审阅与编辑、可视化、方法学、研究、数据管理、概念化

利益冲突声明

?作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的财务利益或个人关系。

致谢

捷克科学基金会资助的项目编号22-13967S支持。作者感谢克拉科夫赫拉德茨大学（理学院，SV2110-2024）的支持。作者还非常感谢Tereza Olivová在样品制备方面的帮助。