《Talanta》：Electrochemical viscosity correction for robust salivary ionomics via redox probe voltammetry
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平纪彦（Hironori Myochin）|罗曼纳斯·查莱基斯（Romanas Chaleckis）|上田忠晴（Tadaharu Ueda）|米格尔·冈萨雷斯·诺格拉（Miguel Gonzálvez Noguera）|张杰（Jie Zhang）|大岛纪康（Noriyasu Oh
平纪彦（Hironori Myochin）|罗曼纳斯·查莱基斯（Romanas Chaleckis）|上田忠晴（Tadaharu Ueda）|米格尔·冈萨雷斯·诺格拉（Miguel Gonzálvez Noguera）|张杰（Jie Zhang）|大岛纪康（Noriyasu Ohshima）|泉隆（Takashi Izumi）|久岛达也（Tatsuya Hisajima）|森美香（Mikaru Mori）|木村智也（Tomoya Kimura）|森正信（Masanobu Mori）
高知大学理学部化学与生命科学系，日本高知市明保野町2-5-1，邮编780-8520
摘要
在富含粘蛋白的生物流体（如唾液）中，小离子的准确定量常常受到粘度依赖性扩散效应的影响。我们提出了一种基于氧化还原探针[Fe(CN)6]3?/4?的峰电位差（ΔEp）的电化学粘度校正方法，该方法通过循环伏安法进行测量。在固定实验条件下，ΔEp值反映了样品特有的扩散行为，并被用作毛细管电泳（CE）测定的离子浓度的校正因子。使用模型粘度标准验证了ΔEp与粘蛋白浓度之间的关系，显示出在生理相关范围内的强对数相关性。与传统的归一化方法（如比重和总蛋白质校正）相比，应用ΔEp校正方法显著减少了唾液离子测量的分散。首先通过在对受试者进行冷压测试（CPT）的重复测量中检验了该方法的分析效用。此外，在12名健康参与者（6名接受冷刺激组，6名对照组）的独立队列中评估了其稳健性，其中校正后的离子谱显示出比未校正数据更清晰的区别。这种基于ΔEp的校正方法提供了一种快速、无损且样本用量低（10 μL）的分析策略，以最小化复杂生物基质中粘度引起的偏差。
引言
体液（如血液、尿液、唾液、汗液和眼泪）被广泛用作诊断基质，因为它们含有多种代谢物、电解质、蛋白质和其他生物分子，这些成分能反映生理和病理状态[1]。这些体液的分析支持多种应用，包括疾病诊断、治疗监测、营养评估和压力评估[2]。特别是，小无机离子和低分子量有机离子在维持渗透压平衡、调节细胞信号传导和支持代谢活动方面起着关键作用[3]。因此，准确量化这些离子对于临床和代谢研究至关重要。
然而，体液中的离子分析受到基质效应的干扰。蛋白质和糖蛋白等大分子通过改变离子迁移率来干扰电泳或层析分离[4]。在非牛顿流体（如唾液、痰液或滑液）中，这些效应尤为明显[5]。这类与粘度相关的偏差可能会掩盖真实的生物学差异，降低生物标志物的可靠性。
最近，唾液作为用于压力评估、传染病筛查和健康状况监测的诊断生物流体受到了越来越多的关注[6]。唾液采样是非侵入性和无痛的，因此比血液采样更适合即时检测[7]、[8]、[9]。
已经鉴定出许多唾液生物标志物，例如皮质醇[10]、[11]、[12]、α-淀粉酶[12]、[13]和分泌型免疫球蛋白A[14]、[15]、[16]，这些标志物通常通过酶联免疫吸附测定[17]、[18]、[19]、[20]、比色法[21]或质谱法[23]、[24]、[25]进行检测。由于无机离子和小有机离子的含量高且具有生理相关性，因此对其进行了研究[26]、[27]。这些离子通过毛细管电泳（CE）[28]、[29]、离子色谱[30]、[31]、离子选择性电极[32]、[33]和比色测定[34]、[35]等技术进行分析。
我们的团队开发了基于CE的唾液多离子分析方法[36]、[37]、[38]、[39]，用于监测与食物摄入[36]、吸烟[36]、摔跤手体重减轻[38]和体育锻炼[39]相关的唾液离子变化。最近，我们引入了一种三层化学修饰毛细管的CE系统，该系统能够在4分钟内有效分析唾液中的阴离子和阳离子[40]。
然而，从同一个体在相似条件下收集的唾液样本中，离子浓度可能存在变异性。这种变异归因于粘蛋白（如MUC5B和MUC7等糖蛋白）[41]，[42]，它们通过唾液酸等功能基团影响唾液粘度并与其相互作用[41]。高粘蛋白含量可能导致扩散减缓和峰宽增加，从而可能影响CE分析中离子的定量[43]、[44]。
电化学方法为小体积样本中基质效应的间接评估提供了另一种选择。在循环伏安法（CV）中，峰电位差（ΔEp）受到扩散和电子转移动力学的影响[52]、[53]、[54]。因此，ΔEp可以作为一个实用的校正因子，反映基质对电化学响应的影响，而不仅仅是对粘度的直接测量。
在这项研究中，我们使用铁氰化钾作为氧化还原探针，测定低粘度参考电解质（ΔEp,0）和添加了唾液的同一电解质（ΔEp,i）中的ΔEp。所得到的ΔEp,r = ΔEp,0 / ΔEp,i比值被用作校正因子，用于调整CE测定的唾液离子浓度。使用粘蛋白和甲基纤维素标准验证了ΔEp与粘蛋白引起的基质效应之间的关系。然后，我们将该校正因子应用于冷压测试（CPT）前后收集的唾液样本，CPT是交感神经系统急性压力的生理模型[55]、[56]。将CF方法的性能与基于SG和TP的归一化方法进行了比较，以减少样本间变异性并提高与压力相关离子的检测能力。
章节摘录
试剂和溶液
所有试剂均为分析级或生化级。电解质溶液由磷酸盐缓冲盐水（PBS）、铁氰化钾（PF）和KCl在超纯水中配制而成。粘度标准（甲基纤维素粘度400和猪胃粘蛋白）以定义的浓度溶解在电解质溶液中。详细组成和制备程序见补充材料的“第1节”。
粘蛋白浓度对CE峰面积的影响
为了研究粘蛋白引起的粘度对各种离子峰面积的影响，我们准备了含有四种不同浓度粘蛋白（0、50、100和200 mg L^-1）的混合离子标准溶液（0.01、0.05和0.1 mmol L^-1），并使用CE进行了分析。本研究共评估了14种离子：九种阴离子（Cl^-、NO2^-、NO3^-、SCN^-、HCO3^-、HPO4^2-、SO4^2-、HCOO^- 和 CH3COO^-）和五种阳离子（Na+、K+、NH4+、Mg^2+ 和 Ca^2+），这些离子在人体唾液中很常见[40]。
如图S3所示，阴离子的峰面积...
结论
我们开发了一种基于氧化还原探针ΔEp的电化学粘度校正策略，以减轻含粘蛋白生物流体中CE分析的扩散相关偏差。通过将ΔEp与样品特有的扩散行为联系起来，该方法提供了一种快速、无损且样本用量低（10 μL）的粘度相关分析偏差校正方法。
应用基于ΔEp的校正显著提高了唾液离子分析的稳健性和多变量稳定性
森正信（Masanobu Mori）： 写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资源协调、项目管理和方法学设计、研究实施、资金获取、数据分析、概念构建。木村智也（Tomoya Kimura）： 数据管理。罗曼纳斯·查莱基斯（Romanas Chaleckis）： 写作——审稿与编辑、方法学设计、概念构建。平纪彦（Hironori Myochin）： 写作——审稿与编辑、方法学设计、数据分析、概念构建。上田忠晴（Tadaharu Ueda）： 写作——审稿与编辑、数据分析，
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。
