蜱唾液中前列腺素E?的阶段依赖性变化决定了其免疫抑制作用

《The Journal of Organic Chemistry》：Stage-dependent changes in prostaglandin E? in tick saliva determine its immunosuppressive effects

　　中村隼人 | 路易斯·费尔南多·帕里齐 | 山北贞树 | 冈川智宏 | 池畑真理 | 威萨·蒂亚马尼 | 渡圭 | 施韦·耶·温 | 前川直也 | 村田白 | 大桥和彦 | 卡洛斯·洛古略 | 伊塔巴贾拉·达席尔瓦·瓦兹 | 冈奈智郎
日本北海道大学兽医学院疾病控制系，札幌

**摘要**
蜱虫的唾液含有生物活性分子，这些分子可以调节宿主的免疫反应并促进吸血过程。其中，前列腺素E2（PGE2）被认为具有免疫抑制作用，但其在吸血过程中的时间动态及其功能相关性仍不清楚。在这项研究中，我们量化了不同吸血阶段Rhipicephalus microplus蜱虫唾液中的PGE2浓度，并评估了其对牛巨噬细胞的免疫调节效应。唾液中的PGE2水平呈阶段依赖性变化，在吸血中期时检测到最高浓度。PGE2以浓度依赖的方式抑制了由LPS和IFN-γ刺激的巨噬细胞产生的TNF-α。值得注意的是，内源性PGE2浓度较高的唾液样本对TNF-α的抑制作用更强。此外，通过选择性地激活PGE2受体EP2和EP4的激动剂，也验证了PGE2的免疫抑制作用，这表明其作用机制可能与受体介导有关。此外，通过药理学阻断EP受体可以显著逆转唾液对TNF-α产生的抑制作用。我们的研究结果表明，蜱虫吸血过程中唾液中PGE2浓度的增加与其对宿主巨噬细胞活性的抑制有关。这些结果表明，PGE2在蜱虫吸血过程中的免疫调节活动中起着重要作用。

**1. 引言**
蜱虫是专性吸血的外寄生虫，它们已经发展出复杂的策略来抑制宿主的免疫反应以延长吸血时间。如Rhipicephalus microplus这样的硬蜱，其吸血过程可以分为两个明显阶段：缓慢吸血阶段（持续数天，以体重逐渐增加为特征）和快速吸血阶段（发生在吸血的最后12–36小时内，体重突然增加）。在这个过程中，蜱虫唾液在调节宿主防御机制中起着关键作用。蜱虫唾液含有多种免疫抑制剂，包括唾液抑制剂（Sajiki等人，2020）、丝氨酸蛋白酶（Coutinho等人，2020；Berger等人，2024）、金属蛋白酶（Guo等人，2009）和脂运蛋白（Fredslund等人，2008）。前列腺素E2（PGE2）是一种在蜱虫唾液中发现的生物活性脂质介质（Poole等人，2013；Sajiki等人，2021），它可调节巨噬细胞的活化、树突状细胞的成熟和T细胞的功能（Poole等人，2013；Kalinski，2012）。PGE2主要通过EP2和EP4受体发挥其免疫抑制作用，这些受体激活cAMP途径，抑制NF-κB依赖性的促炎细胞因子产生，并使巨噬细胞向抗炎表型转变（Serezani等人，2007；Vleeshouwers等人，2021）。已在多种蜱虫物种的唾液中检测到PGE2，包括Ixodes scapularis、Haemaphysalis longicornis、Rhipicephalus sanguineus和Amblyomma sculptum，它在这些蜱虫中对宿主免疫调节有贡献（Ribeiro等人，1985；Inokuma等人，1994；Sá-Nunes等人，2007；Oliveira等人，2011；Esteves等人，2019）。在我们之前的研究中，我们发现R. microplus唾液中的PGE2可以诱导免疫检查点分子（如程序性死亡-1（PD-1）和PD-Ligand 1（PD-L1）的表达，从而抑制宿主T细胞的活化（Sajiki等人，2021）。这些发现凸显了PGE2作为蜱虫诱导的免疫调控的关键因素。

随着吸血过程的进行，蜱虫唾液中的蛋白质表达谱会发生变化，这一过程被称为“唾液组型转换”（Karim和Ribeiro，2015；Mans，2023）。这些动态变化是由多种因素引起的，包括发育阶段、吸血的速度和持续时间、宿主的生理特性以及微生物感染的存在（Tirloni等人，2017；Maldonado-Ruiz等人，2019；Nuttall，2023），使蜱虫能够根据吸血部位的免疫环境调整其唾液成分（Ribeiro和Mans，2020）。对R. microplus唾液的转录组和蛋白质组分析显示，在吸血过程中特定蛋白质家族的分泌存在显著变化，这表明免疫调节成分的分泌也可能随吸血阶段而变化（Tirloni等人，2020；da Silva Vaz Junior，2024）。这些阶段依赖性的唾液分泌变化可能代表了一种适应性策略，使蜱虫能够在不同吸血阶段逃避宿主的免疫反应。

尽管先前的研究报告了PGE2的免疫调节作用，但其吸血过程中的产生时间动态及其对牛巨噬细胞功能的直接影响仍不清楚。在这项研究中，我们量化了不同吸血阶段收集的R. microplus蜱虫唾液中的PGE2浓度，并研究了其对巨噬细胞活化的影响以及EP2/EP4受体信号通路在这一过程中的作用。

**2. 材料与方法**
2.1. 蜱虫采集
Rhipicephalus microplus蜱虫（Porto Alegre品系，不含巴贝斯虫和无形体）来自实验室维持的种群（Reck等人，2009）。来自无蜱区的Hereford小牛被感染了10天大的R. microplus幼蜱。在吸血期间，将部分吸血的雌蜱小心地从小牛身上移除，并根据其体型和体重进行分类。根据之前描述的方法（da Silva Vaz Junior，2024），将蜱虫分为7组（组1–6）。完全吸血的雌蜱（组7）在自然脱落后被收集起来。随后，根据吸血阶段将蜱虫重新分类为三个组：缓慢-早期（组1–2）、缓慢-晚期（组3–4）和快速吸血（组5–7）。实验所用动物饲养在巴西南里奥格兰德州立大学（UFRGS）的兽医学院。所有操作均遵循UFRGS动物实验伦理委员会制定的伦理和方法指南。实验方案（编号27559和45209）获得了UFRGS动物使用伦理委员会（CEUA）的批准。

2.2. 唾液采集
用无菌水清洗蜱虫，轻轻用纸巾擦干，然后用胶带将其背面固定在玻璃载玻片上。通过将5 μL 2%盐酸皮罗卡品（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）溶解在PBS（pH 7.4）中的溶液注射到蜱虫右下腿的腹侧区域来刺激唾液分泌，使用的是Hamilton注射器（Hamilton Company，美国内华达州里诺）。唾液在28°C的潮湿环境中收集约3小时后，使用移液管头采集，并储存在-80°C直至进一步使用。

2.3. 血液采集
从北海道大学北方生物圈野外科学中心（日本札幌）饲养的临床健康的成年荷斯坦奶牛身上采集外周血样本。使用Percoll（GE Healthcare，美国伊利诺伊州芝加哥）通过密度梯度离心法分离外周血单核细胞（PBMCs）。使用牛血样本的实验获得了北海道大学兽医学院伦理委员会的批准（批准编号17–0024和22–0038）。

2.4. 细胞制备
为了从牛PBMCs中分离CD14+细胞，将PBMCs与抗牛CD14单克隆抗体（mAb）（CAM36A；华盛顿州立大学单克隆抗体中心，美国华盛顿州普尔曼）在25°C下孵育30分钟。然后将细胞与抗鼠IgG1 MicroBeads（Miltenyi Biotec，德国贝吉施格拉德巴赫）在25°C下孵育30分钟。孵育后，使用MS柱和MiniMACS Separator（Miltenyi Biotec）对CD14+细胞进行分选。使用SA3800（SONY，日本东京）或FACS Verse（BD Biosciences，美国新泽西州弗兰克林莱克斯）确认CD14+细胞的纯度（>90%）。

2.5. CD14+细胞培养
通过磁分选分离出的CD14+细胞悬浮在RPMI1640培养基（Sigma–Aldrich）中，培养基中含有10%热灭活的FBS（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）、200 IU/mL青霉素、200 μg/mL链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific）。接下来，将CD14+细胞用牛M-CSF（50 ng/mL；Kingfisher Biotech，美国明尼苏达州圣保罗）培养6天，每48小时更换一次培养基。分化后，细胞在LPS（1 μg/mL；Sigma-Aldrich）和牛IFN-γ（25 ng/mL；Kingfisher Biotech）的存在下进行24小时刺激，同时加入合成PGE2（10 nM、100 nM、1 μM；Cayman Chemical，美国密歇根州）、EP2激动剂（1 μg/mL，Butaprost；Cayman Chemical）或蜱虫唾液（1:100稀释），该稀释度与之前研究蜱虫唾液免疫调节活性的实验所用相同（Sajiki等人，2021）。作为唾液的阴性对照，加入等体积的PBS或DMSO。对于受体阻断实验，细胞在刺激前用EP2拮抗剂（10 μM，AH6809；Cayman Chemical）和EP4拮抗剂（10 μM，ONO-AE3–208；Cayman Chemical）预孵育1小时。对于细胞内细胞因子检测，在染色前4小时加入Brefeldin A（10 μg/mL）。收集细胞培养上清液，并通过ELISA测量TNF-α的浓度。通过流式细胞术对细胞进行巨噬细胞表型分析。

2.6. ELISA
使用Mabtech（瑞典Nacka Strand）的ELISA Flex试剂盒双倍测定巨噬细胞培养上清液中的TNF-α水平。使用Prostaglandin E2 Express ELISA Kit（Cayman Chemical）测定不同吸血阶段蜱虫唾液中的PGE2浓度。波长450 nm处使用微孔板读数器（MTP-900；Corona Electric，日本东京）测定吸光度。

2.7. 流式细胞术
通过流式细胞术评估巨噬细胞的极化情况。细胞（1 × 10?）先用含有10%热灭活山羊血清（Thermo Fisher Scientific）的PBS在25°C下预孵育15分钟，以阻断Fc受体介导的非特异性结合。然后使用Lightning-Link PerCP/Cy5.5标记的抗CD80抗体（IL-A159；Bio-Rad，美国加利福尼亚州赫拉克勒斯）和Fixable Viability Dye Olive（Thermo Fisher Scientific）在25°C下染色20分钟。表面染色后，细胞用含有0.5% BSA、2 mM EDTA和0.1%亚硝酸钠的PBS冲洗。使用BD Cytofix/Cytoperm（BD Biosciences）固定和通透化细胞，并用PE标记的抗TNF-α抗体（CC327；Bio-Rad）染色。CC327使用Zenon Mouse IgG2b标记试剂盒（Thermo Fisher Scientific）预标记。使用SA3800（SONY）进行分析。

2.8. 数据处理
对于PGE2处理的实验，CD80表达和TNF-α生成量以未刺激（NS）对照组为基准进行归一化，并以相对值表示（补充图1）。对于EP2/EP4激动剂处理的实验，CD80表达量以原始值表示。所有流式细胞术数据使用FlowJo v10.4（BD Biosciences）或SA3800软件（SONY）进行分析。

2.9. 统计分析
使用R软件（版本4.3.1）进行统计分析。为了比较不同吸血阶段的唾液PGE2浓度，采用Steel–Dwass测试进行多组比较。对于使用来自同一动物的CD14?细胞衍生的巨噬细胞的体外实验，使用Friedman测试分析反复测量数据（超过两个条件），随后使用Wilcoxon符号秩检验进行后续成对比较。对于两个相关组的比较，使用Wilcoxon符号秩检验。P值<0.05被认为具有统计学意义。

**3. 结果**
3.1. 吸血中期蜱虫唾液中的PGE2浓度增加
根据体型和大小，将单个R. microplus蜱虫分为7组（组1–7）。从每只蜱虫中收集唾液（图1A），并通过ELISA测定唾液中的PGE2浓度。在7组中，组3和组4的唾液PGE2浓度相对较高（图1B）。为了进一步评估吸血阶段与PGE2生成之间的关系，将缓慢吸血阶段（即初始的长期吸血阶段）细分为缓慢-早期和缓慢-晚期，分别对应组1–2和组3–4，而组5–7被归类为快速吸血阶段。比较这些吸血阶段的PGE2浓度发现，吸血中期的蜱虫PGE2水平显著高于早期或晚期阶段（图1C）。对不同吸血阶段收集的唾液样本的进一步分析证实了类似的趋势，支持吸血中期PGE2浓度达到峰值（图1D）。综合这些发现表明，R. microplus蜱虫唾液中的PGE2浓度随着吸血过程的进行而逐渐增加，在吸血中期达到最大值，随后在吸血结束时下降。

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**图1.**在Rhipicephalus microplus吸血过程中唾液中PGE2浓度的动态变化。(A) 从受蜱虫感染的牛身上收集的R. microplus雌性蜱虫的代表图像，并根据体重和大小分为七组（第1组至第7组）。(B) 从第1组至第7组的蜱虫中单独收集的唾液中的PGE2浓度（第1组n = 4；第2组至第7组n = 5）。(C) 不同吸血阶段之间PGE2浓度的比较。这七组被重新分为缓慢早期、缓慢晚期和快速吸血阶段。第1组至第2组对应于缓慢早期，第3组至第4组对应于缓慢晚期，第5组至第7组对应于快速吸血阶段。(D) 使用从不同蜱虫群体中收集的混合唾液样本来验证这种与吸血阶段相关的模式。*P < 0.05（Steel Dwass检验）。3.2. PGE2抑制牛巨噬细胞产生炎症细胞因子为了研究蜱虫唾液中PGE2浓度的变化如何影响宿主的免疫反应，研究人员用合成PGE2或蜱虫唾液处理牛巨噬细胞，并分析了它们的细胞因子反应。从健康牛的PBMCs中分离出的CD14?单核细胞使用M-CSF分化为巨噬细胞。分化后，巨噬细胞在LPS和IFN-γ的刺激下诱导炎症反应，随后用逐渐增加浓度的合成PGE2进行处理（图2A）。测量培养上清液中的TNF-α水平发现，合成PGE2以浓度依赖的方式抑制了TNF-α的产生（图2B）。接下来，为了检查这种抑制作用是否可以通过使用吸血中期（以高PGE2浓度为特征的第3组至第4组）或吸血完全饱和时（以低PGE2水平为特征的第7组）收集的蜱虫唾液来复现，在LPS和IFN-γ存在的情况下进行实验（图2C）。与使用完全饱和蜱虫唾液处理的细胞相比，使用吸血中期收集的蜱虫唾液处理的细胞显示TNF-α水平显著降低（图2D）。下载：下载高分辨率图像（315KB）下载：下载全尺寸图像图2. PGE2和蜱虫唾液对牛巨噬细胞产生TNF-α的影响。(A) 实验设计的示意图。从牛PBMCs中分离出的CD14?单核细胞使用M-CSF分化为巨噬细胞，然后在合成PGE2或蜱虫唾液（1:100稀释）存在的情况下用LPS和IFN-γ进行刺激。(B) 巨噬细胞培养上清液中TNF-α浓度在用逐渐增加浓度的合成PGE2处理后的变化（n = 8）。(C) 从吸血中期蜱虫（PGE2高；第3组至第4组）和完全吸血饱和蜱虫（PGE2低；第7组）收集的唾液样本中PGE2浓度的比较。(D) 在含有不同PGE2浓度（1:100稀释）的唾液处理的巨噬细胞培养物中的TNF-α水平（n = 8）。*P < 0.05（Friedman检验后进行Wilcoxon符号秩检验）。3.3. PGE2抑制M1巨噬细胞的极化为了进一步评估PGE2引起的表型变化，在相同的炎症和合成PGE2条件下通过流式细胞术分析了巨噬细胞的极化。细胞被染色以显示CD80（促炎M1巨噬细胞的表面标记物）和细胞内TNF-α表达（图3A，补充图1）。PGE2处理导致CD80表达降低（图3A-C，补充图1A，B）。此外，CD80?TNF-α?巨噬细胞的频率显著减少（图3D，E，补充图1C）。这些发现表明PGE2抑制巨噬细胞向M1表型的极化并调节炎症细胞因子的产生。下载：下载高分辨率图像（570KB）下载：下载全尺寸图像图3. PGE?抑制M1巨噬细胞的极化。(A) 表示在LPS和IFN-γ存在的情况下用合成PGE2处理的巨噬细胞上CD80表达强度的代表性直方图。(B) 相对于未刺激（NS）对照的相对CD80 MFI（n = 8）。(C) 相对于NS对照的CD80?巨噬细胞的相对频率（n = 8）。(D) 表示CD80和TNF-α共表达的代表性流式细胞术图表。(E) 相对于NS对照的CD80?TNF-α?巨噬细胞的相对频率（n = 8）。*P < 0.05（Friedman检验后进行Wilcoxon符号秩检验）。3.4. EP2和EP4受体信号传导介导PGE2诱导的巨噬细胞抑制为了确定PGE2的免疫抑制作用是否通过其受体介导，在LPS和IFN-γ存在的情况下，用EP2和EP4受体的选择性激动剂而不是合成PGE2处理巨噬细胞（图4A）。EP2或EP4激动剂均显著减少了巨噬细胞培养上清液中的TNF-α产生（图4B）。流式细胞术分析进一步显示，用这两种激动剂处理后CD80?巨噬细胞的比例显著降低（图4C–E）。下载：下载高分辨率图像（363KB）下载：下载全尺寸图像图4. EP2和EP4受体信号传导介导PGE2和蜱虫唾液引起的巨噬细胞抑制。(A) 实验设计的示意图。用EP2或EP4激动剂处理CD14+细胞衍生的巨噬细胞。(B) 上清液中的TNF-α浓度（n = 6）。(C) 巨噬细胞中CD80表达的代表性直方图。(D) 巨噬细胞中CD80的MFI总结（n = 6）。(E) CD80?巨噬细胞频率的总结（n = 6）。(F) EP受体阻断的实验设计示意图。在LPS和IFN-γ存在的情况下，先用EP2/EP4受体拮抗剂处理巨噬细胞，然后再进行刺激。（G) 用EP2/EP4受体拮抗剂处理的巨噬细胞培养上清液中的TNF-α浓度（n = 9）。条形图代表平均值±标准差。*P < 0.05（Friedman检验后进行Wilcoxon符号秩检验）。为了进一步检查蜱虫唾液的免疫抑制活性是否可归因于PGE2，使用针对EP2和EP4的拮抗剂进行了抑制实验。在LPS和IFN-γ存在的情况下，先用EP受体拮抗剂处理巨噬细胞，然后再用蜱虫唾液进行刺激（图4F）。在用拮抗剂处理的巨噬细胞的培养上清液中，唾液介导的TNF-α抑制作用显著逆转，TNF-α水平恢复到与载体对照组相似的水平（图4G）。这些发现表明PGE2通过EP2和EP4受体信号通路抑制巨噬细胞激活。4. 讨论本研究揭示了R. microplus唾液中PGE2浓度在吸血周期中的显著变化。此外，吸血中期的蜱虫唾液含有比吸血早期或晚期的蜱虫唾液高得多的PGE2。高PGE2或合成PGE2的唾液抑制了TNF-α的产生并减少了CD80? M1巨噬细胞。此外，EP2和EP4激动剂再现了这些效应，表明PGE2通过EP2/EP4信号传导途径介导巨噬细胞的抑制。蜱虫吸血过程中唾液中PGE2水平的动态变化可能反映了其合成和功能的生理调节（Ribeiro等人，1985；Inokuma等人，1994）。蜱虫具有合成前列腺素所需的酶，包括磷脂酶A?、环氧化酶和PGE2合成酶，这些酶依次将花生四烯酸转化为PGE2（Tirloni等人，2020；Bowman等人，1996）。然而，蜱虫生成花生四烯酸的能力有限，前列腺素生物合成所需的底物主要来自宿主血液中的脂质（Bowman等人，1996；Aljamali等人，2002）。在吸血早期，血液摄入量有限，导致花生四烯酸供应不足（Madden等人，1996），尽管存在酶途径，PGE2的产生仍然较低。随着吸血的进行和血液摄入量的增加，花生四烯酸水平上升，使PGE2合成途径达到最大化，从而在吸血中期观察到PGE2水平达到峰值。相比之下，在接近饱腹的快速吸血阶段，PGE2水平下降。虽然潜在机制尚不清楚，但这可能与蜱虫的唾液成分持续变化（即所谓的“唾液组合物切换”）有关。这种唾液蛋白的动态调节可能有助于防止宿主在长期附着期间的免疫适应。吸血中期PGE2的这种时间调控性增加可能代表了R. microplus逃避宿主免疫防御并维持长时间吸血的关键适应性机制。M1巨噬细胞是早期炎症反应的主要驱动者，在皮肤中产生高水平的促炎细胞因子如TNF-α和IL-1β，并表达共刺激分子如CD80（Lawrence和Natoli，2011；Murray等人，2014）。这些细胞有助于病原体控制并激活下游的适应性免疫。此外，它们强大的细胞因子产生还生成了不利于外部寄生虫附着的炎症微环境（Strobl等人，2022）。因此，抑制M1相关细胞因子的产生是一种有效的策略，可以限制蜱虫吸血部位的早期炎症。利用这种与吸血阶段相关的模式表明，R. microplus产生大量PGE2正是为了维持长时间的附着。除了PGE2之外，花生四烯酸级联还产生多种生物活性脂质介质，包括白三烯和特殊的促进缓解介质，其中许多具有强大的免疫调节功能（Bannenberg和Serhan，2010；Schebb等人，2022）。由于蜱虫从宿主体内获取花生四烯酸，除了PGE2之外，吸血依赖性的变化也可能影响其他脂质介质（Tirloni等人，2020；Madden等人，1996）。例如，在蜱虫唾液腺和唾液中发现了其他前列腺素如PGD2、PGF2α和PGA2/PGB2（Ribeiro等人，1992；Pedibhotla等人，1997），这些前列腺素在哺乳动物系统中已知具有免疫调节作用（Luo等人，2024；Harris等人，2002）。然而，这些前列腺素在蜱虫唾液中的功能作用仍需进一步研究。对蜱虫唾液的全面脂质组学分析将有助于确定是否有其他脂质衍生物与PGE2一起重塑吸血部位的炎症环境。已知蜱虫唾液含有复杂的生物活性分子混合物，可以调节宿主的免疫反应。除了PGE2，先前的研究还报告了蜱虫唾液中含有其他免疫调节因子。例如，嘌呤核苷腺苷可以抑制宿主的免疫反应（Oliveira等人，2011），而唾液蛋白如Salp15可以抑制树突状细胞和CD4? T细胞的活化（Hovius等人，2008；Tomás-Cortázar等人，2017）。Cystatin家族的成员，包括sialostatin L和sialostatin L2，也能抑制树突状细胞活化和炎症反应（Sajiki等人，2020；Kotsyfakis等人，2006；Sá-Nunes等人，2009）。因此，蜱虫唾液的总体免疫调节活性可能反映了多种唾液成分的联合效应。尽管如此，目前的结果表明，PGE?是本研究中观察到的巨噬细胞TNF-α产生抑制的主要贡献者。含有较高PGE2浓度的唾液样本抑制了更强的TNF-α产生（图2D），并且这种效应可以通过药理学阻断EP受体来逆转（图4G）。这些发现表明PGE2在介导蜱虫唾液对巨噬细胞炎症反应的抑制作用中起核心作用。总之，这些数据表明R. microplus唾液中的PGE2水平在吸血阶段受到严格调控，并在吸血中期达到峰值。通过将蜱虫衍生的脂质介质的时间动态与宿主先天免疫反应的调节定量联系起来，我们的发现揭示了R. microplus创造有利于长时间吸血环境的一种先前未被认识到的机制。资助这项工作得到了科学研究补助金（项目编号JP19KK0172、JP22K19232、JP23K23768、JP23KK0124给S.K.，JP19K15993、JP22K15005、JP24K01918给T.O.，JP24KJ0303给N.H.）、日本农业、林业、渔业和食品工业科学技术研究促进计划（编号26058BC给S.K.）、生物导向技术研究促进机构（区域发展战略特别计划；项目编号16817557给S.K.和通过开放创新补助金的研究和实施促进计划；JPJ011937给T.O.和S.K.）、日本医学研究与发展机构（AMED）（JP223fa627005给S.K.）、国家分子昆虫学科学技术研究所、国家科学技术发展委员会（CNPq，编号465678/2014-9；441057/2023-3；401737/2023-3给I.S.V.）、高等教育人员改进协调会（CAPES，资金代码001给I.S.V.）的支持。资助者在研究设计、数据收集和解释或决定提交工作发表方面没有发挥作用。CRediT作者贡献声明中村隼人：撰写——原始草案、可视化、项目管理、方法学、研究、数据分析、概念化。Luís Fernando Parizi：资源、方法学、研究。Yamato Sajiki：方法学、研究。Okagawa Tomohiro：撰写——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取。Ikehata Mari：研究。Wisa Tiyamanee：可视化、研究。Watari Kei：研究。Shwe Yee Win：撰写——审稿与编辑、可视化。Maekawa Naoya：撰写——审稿与编辑、监督。Murata Shiro：撰写——审稿与编辑、监督。Ohashi Kazuhiko：撰写——审稿与编辑、监督。Carlos Logullo：撰写——审稿与编辑、监督。伊塔巴哈拉·达席尔瓦·瓦兹（Itabajara da Silva Vaz Jr）：写作——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理工作、方法论制定、资金筹措、概念构思。康奈·萨托鲁（Satoru Konnai）：写作——审稿与编辑、监督、资源协调、项目管理工作、资金筹措、概念构思。