环亮氨酸通过调节基因表达和代谢来干扰猪塞托利细胞系的生理功能

《Theriogenology》：Cycloleucine disturbs functions of porcine Sertoli cell line via modulating gene expression and metabolism

　　

杨彩霞| 方婷| 王芳| 杜志强

中国湖北省荆州市长江大学动物科学技术学院，434025

摘要

环亮氨酸（CL）是一种甲基供体抑制剂。我们之前的研究表明，CL可以通过降低核酸N⁶-甲基腺苷（m⁶A）的表观遗传修饰水平来影响猪卵母细胞的减数分裂成熟和发育潜力。然而，CL对猪雄性生殖的影响尚不清楚。在本研究中，我们发现CL处理猪睾丸支持细胞系（SCL）会以剂量依赖的方式降低细胞活力。CL处理（40mM，36小时）还抑制了细胞增殖，促进了晚期凋亡，增加了细胞内活性氧（ROS）的水平，降低了核酸N6-甲基腺苷（m⁶A）、H3K4me3、H3K27ac和H4K16ac的水平，并增加了H3K9me2的水平。ELISA检测显示，CL（40mM，36小时）降低了乳酸的产生，但抗苗勒氏管激素的水平没有变化。RNA-seq和代谢组学分析确定了1212个差异表达基因（DEGs）（536个上调和676个下调）以及67个显著不同的代谢物（SDMs）（45个上调和22个下调），这些变化是由CL（40mM，36小时）处理猪SCL引起的。这些DEGs和SDMs参与了多种途径，包括PI3K-Akt、细胞周期、铁死亡、FoxO和氨酰-tRNA生物合成。对一些DEGs的验证表明，CL（40mM，36小时）显著降低了HMGCS1和P4HA1的表达，但增加了IGFBP5在mRNA和蛋白质水平的富集。转录组和代谢组的联合分析揭示了一些DEGs与SDMs之间的高度相关性。总体而言，这些发现表明CL可以通过改变表观遗传修饰来影响猪SCL的功能，从而改变基因表达和代谢，为理解表观遗传修饰如何影响猪SCL的功能提供了见解，并有助于调节猪雄性生殖。

引言

动物睾丸中的支持细胞通过紧密的细胞间连接形成血-睾屏障，为精子发生创造了一个独立的免疫和营养环境[1]，[2]。支持细胞是决定哺乳动物睾丸中精原干细胞数量和生态位的关键体细胞群体[3]，能够产生生长因子[4]、抗苗勒氏管激素[5]、抑制素B[6]和乳酸，以调节自身和精细胞的 functions、基因表达和代谢。研究表明，环境毒素对哺乳动物睾丸（特别是支持细胞）具有毒性[7]，包括镉[8]、玉米赤霉醇[9]、单(2-乙基己基)邻苯二甲酸酯[10]，这为保护雄性生殖能力提供了重要的见解。

环亮氨酸（CL）是甲硫氨酸腺苷转移酶（MAT）的抑制剂[11]，可防止S-腺苷甲硫氨酸（SAM）的生成[12]，[13]。SAM参与甲基/硫/氨基丙基的转化，对蛋白质、核酸、神经递质、磷脂和维生素的合成以及多胺和谷胱甘肽的转化至关重要[14]。CL和SAM已成为治疗多种疾病的潜在有效策略，包括癌症[15]，[16]，[17]，[18]。据报道，CL还通过改变Mat2a的表达和活性、SAM水平、核酸甲基化和组蛋白甲基化来影响细胞增殖、凋亡和氧化应激[19]，[20]，[21]。转录组测序显示CL对家禽肌生成具有剂量依赖性的抑制作用[22]。然而，CL对支持细胞的影响和分子机制仍不清楚。

在本研究中，我们评估了通过体外培养未成熟的猪支持细胞系（SCL）外源性补充CL后的细胞功能，包括细胞活力、增殖、凋亡、氧化应激和表观遗传修饰。然后进行了转录组学和非靶向代谢组学分析，以分析CL改变的猪SCL的基因表达和代谢。最后，进一步验证了一些与关键途径相关的重要mRNA和蛋白质的表达水平。

部分摘要

细胞培养和CL处理

猪睾丸细胞系最初从妊娠80至90天的胎儿睾丸中分离获得，购自美国典型培养收集中心（ATCC?CRL-1746?），该细胞系被鉴定为未成熟的支持细胞[23]。猪SCL在含有10%胎牛血清（Clark，澳大利亚）和1%青霉素-链霉素（Gibco，美国）的最低必需培养基（MEM，HyClone，美国）中培养，培养条件为5% CO2 incubator和37°C。使用环亮氨酸（CL，A48105）进行处理。

环亮氨酸通过抑制增殖和促进凋亡降低猪SCL的活力

为了评估CL对猪支持细胞系细胞活力、增殖和凋亡的影响，使用不同浓度的CL（0、20mM、40mM和80mM）处理细胞不同时间（0小时、12小时、24小时、36小时和48小时）（图1A），并检测细胞活力。结果表明，细胞活力以剂量和时间依赖的方式降低（图1B）。20mM CL处理48小时能显著降低细胞活力（1.75 vs 1.92；P<0.001），而12小时、24小时和36小时的处理则没有变化。

讨论

CL可以抑制MAT的活性，从而降低SAM的水平。SAM是核酸和组蛋白甲基化的甲基供体，因此影响表观遗传修饰和基因表达[29]，[30]。先前的研究表明，CL可以在黑色素生成肿瘤细胞、猪脂肪细胞和卵母细胞中以剂量依赖的方式降低m⁶A的水平[31]，[32]，[33]。本研究还表明，CL降低了未成熟猪支持细胞中核酸的m⁶A全局修饰水平

结论

环亮氨酸（40mM，36小时）处理猪SCL抑制了细胞增殖，促进了凋亡，改变了表观遗传修饰（核酸m⁶A、H3K4me3、H3K9me2、H3K27ac和H4K16ac）的全局水平，并降低了乳酸的产生。CL（40mM，36小时）调节了许多DEGs/SDMs及其相关信号通路，从而影响了猪SCL的功能。这些发现为理解表观遗传修饰如何影响猪SCL的功能提供了见解。

CRediT作者贡献声明

杨彩霞：写作——审稿与编辑，撰写原始草稿，监督，概念构思。方婷：撰写原始草稿，可视化，验证，调查，正式分析，数据管理。王芳：软件，方法学，正式分析。杜志强：写作——审稿与编辑，软件，资源。

利益冲突声明

作者声明没有竞争性财务利益。

数据可用性

RNA-seq数据已存储在NCBI GEO仓库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），访问编号GSE307766）。代谢组数据已存储在EMBL-EBI（欧洲分子生物学实验室-欧洲生物信息学研究所）数据库（https://www.ebi.ac.uk/metabolights/search），访问编号MTBLS12990）。

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

作者感谢刘晓英帮助将转录组和代谢组数据上传到数据库，并感谢杨教授和杜教授团队的其他成员提供的支持。