姜黄素通过调节小鼠模型中中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的形成，对短期和长期颗粒物（PM10/2.5）引起的肺损伤严重程度具有保护作用

《Tissue and Cell》：Protective effects of Curcumin on Short and Long-term Particulate matter (PM10/2.5) induced lung damage severity via modulation of Neutrophil Extracellular traps (NETs) Formation in mouse model

　　迪克莎·夏尔马（Diksha Sharma）、万丹娜·索尼（Vandana Soni）、沙琳尼·辛格（Shalini Singh）、普拉尚特·库马尔·乔汉（Prashant Kumar Chauhan）、阿巴伊·库马尔·辛格（Abhay Kumar Singh）、拉什米·辛格（Rashmi Singh）
印度瓦拉纳西-221005，巴纳拉斯印度教大学（Banaras Hindu University）动物学系

**摘要**
最近的研究发现，颗粒物（PM10/2.5）暴露与肺损伤之间存在关联，这种关联与中性粒细胞胞外陷阱（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的形成及NETosis过程有关。NETs是中性粒细胞在面对病原体或炎症反应时释放出的结构。本研究旨在探讨长期和短期暴露于来自印度最古老城市之一瓦拉纳西的PM10/2.5后，肺部的损伤情况及其与中性粒细胞中NETs形成的关系。实验中，BALB/c小鼠被暴露于PM10/2.5（0.5 mg/kg，腹腔注射）2至4周，结果发现肺部湿/干组织重量比显著增加，表明存在肺水肿，且PM2.5暴露组的损伤更为严重。长期PM2.5暴露导致蛋白质含量和乳酸脱氢酶（LDH）水平显著升高，反映了肺损伤的严重程度与暴露时间的依赖性。支气管肺泡灌洗液（BALF）中中性粒细胞和巨噬细胞数量增加，这一现象通过CD11b+和Gr-1+细胞得到证实。组织病理学分析显示炎症细胞浸润增加和支气管壁增厚，并在PM2.5暴露4周后开始出现肉芽肿形成。PM暴露还引发了氧化应激，表现为活性氧（ROS）、一氧化氮（NO）和丙二醛（MDA）水平升高，同时谷胱甘肽（GSH）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）活性下降。PM10/2.5暴露后NETosis逐渐增强，其特征是肺组织和BALF中瓜氨酸化组蛋白H3（Cit-H3）和髓过氧化物酶（MPO）的共定位。中性粒细胞弹性蛋白酶（Neutrophil Elastase, NE）的表达升高也证实了NETs的形成。长期PM2.5暴露还导致CXCL1表达增强，表明中性粒细胞积聚和NETs生成。PM2.5暴露4周时，NF-κB和IL-33的表达增加，进而使炎症细胞因子IL-6和TNF-α水平升高，同时DNA氧化损伤加剧，这些过程部分由NETosis介导。鼻内给予姜黄素可减轻PM10/2.5诱导的NETs形成，这可能为缓解PM引起的肺损伤提供一种有前景的治疗方法。

**引言**
空气污染，尤其是颗粒物（PM），由于其与多种呼吸系统和心血管疾病的关联，已成为一个全球性的健康问题。根据空气动力学直径，颗粒物被分为PM10（≤10 μm）和PM2.5（≤2.5 μm），后者因其能深入呼吸道而尤为关注（Harrison等人，2016年）。PM2.5颗粒可到达肺泡甚至进入血液，可能引起全身性效应（Garcia等人，2023年）。由于空气质量差，印度多个城市在过去几十年中位列全球污染最严重的前20名，其中11个位于印度-恒河流域平原（IGP）（Garaga等人，2018年）。瓦拉纳西位于印度-恒河流域平原，该地区长期面临严重的空气污染问题（人口约150万），其PM浓度经常超过国家和国际安全标准数倍。高人口密度、严重的交通拥堵、工业活动、固体废物焚烧以及地理因素共同导致了PM的累积。尽管对PM引起的炎症已有广泛研究，但其具体的细胞机制仍不完全清楚。PM吸入会因中性粒细胞的异常聚集和功能改变而引发炎症和组织损伤（Wooding等人，2020年）。瓦拉纳西的PM成分尤其令人担忧，其中含有碳、硅、硫、氟、氮、钠、铁、钴和锰等无机元素，这些元素显著影响颗粒物的毒性（Sharma等人，2025年；Tiwari和Singh，2013年）。实验数据显示，PM10和PM2.5暴露对肺部健康和细胞功能具有负面影响。吸入后，颗粒物进入肺部系统，与上皮细胞和驻留免疫细胞相互作用。长期暴露于空气污染会持续激活NF-κB，导致组织损伤、气道重塑和全身性炎症（通过促炎细胞因子的转录）。这种相互作用迅速激活NF-κB，释放TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子，其中IL-6具有双重作用（Refsnes等人，2014年；Lan等人，2024年；Piao等人，2023年）。中性粒细胞是急性炎症中的关键反应免疫细胞，在PM2.5暴露后参与促炎细胞因子的产生。近年来的研究揭示了中性粒细胞胞外陷阱（NETs）的新功能，即活化的中性粒细胞释放由抗微生物蛋白和组蛋白组成的网状结构（Brinkmann等人，2004年）。NETs最初被看作是对抗病原体的防御机制，但NETs的异常形成（NETosis）已被证实与多种炎症和自身免疫疾病的发生有关（Lee等人，2017年）。NETosis的激活与炎症反应加剧、组织损伤及自身免疫疾病相关（Cheng等人，2020年；Radermecker等人，2019年）。在通气机诱导的肺损伤模型中，即使在出现肺部损伤生理体征之前，中性粒细胞已在肺部早期积聚。趋化因子CXCL1（KC）和CXCL2/3（MIP-2）的表达显著增加，这些因子在中性粒细胞募集和肺部炎症中起关键作用（Belperio等人，2002年）。IL-8、IL-1β和TNF-α等炎症因子可诱导中性粒细胞释放NETs（Dinallo等人，2019年；Bando等人，2021年）。然而，过度的或失调的NET形成会加剧炎症反应并导致组织损伤（Antal和Newton等人，2013年；Rhoads等人，2013年）。PM暴露会导致中性粒细胞向肺部迁移和氧化应激，这两种因素都有利于NETs的形成（Valderrama等人，2022年）。IL-33是一种在损伤、应力或感染时释放的危险相关分子模式（danger-associated molecular pattern, DAMP），其诱导的NET形成依赖于ROS（Hidalgo等人，2022年；Herre等人，2023年）。临床试验表明，抗IL-33可降低哮喘发作的发生率并改善中度至重度哮喘的肺功能（Wechsler等人，2021年）。在小鼠模型中，IL-33还被证明可促进支气管肺发育不良（Jin等人，2020年）。NETosis过程中，组蛋白通过肽基精氨酸脱亚胺酶4（Peptidyl Arginine Deiminase 4, PAD4）发生瓜氨酸化，从而促进染色质解聚，并使髓过氧化物酶（MPO）和其他颗粒蛋白释放到细胞外染色质支架上（Vorobjeva和Chernyak，2020年）。中性粒细胞弹性蛋白酶（NE）是从活化中性粒细胞中释放的关键丝氨酸蛋白酶，在NET形成中起关键作用。NETosis期间，NE转移到细胞核，与髓过氧化物酶（MPO）和肽基精氨酸脱亚胺酶（PAD4）协同作用，促进细胞外DNA结构的释放（Papayannopoulos等人，2010年）。此外，NE还参与细胞外基质的降解、上皮细胞损伤和肺部炎症反应的放大。PM暴露与呼吸系统病理中NETosis之间的关系尚未得到充分研究。

**假设与目的**
我们假设PM暴露会在肺部诱导NETosis，从而导致肺部炎症和组织损伤。此外，本研究还旨在探讨具有抗炎和抗氧化特性的多酚化合物姜黄素对PM诱导的NETosis的潜在保护作用。近年来，植物提取物和药用植物因作为合成添加剂的天然替代品而受到广泛关注（Roy等人，2022年）。这些天然产物富含生物活性化合物，如精油、生物碱、黄酮类和酚酸，具有抗菌、抗氧化、抗癌和抗炎作用（Amirteymoori等人，2021年）。姜黄素来源于姜黄（Curcuma longa L.，姜科植物），其治疗效果已被广泛研究，包括调节炎症途径和减轻氧化应激的作用（Abdollahi等人，2018年）。在多种呼吸系统疾病中，姜黄素表现出保护作用，鼻内给药方式提高了其疗效和生物利用度（Subhashini等人，2013年），但其在中PM诱导的NETosis中的作用尚未明确。本研究旨在探讨PM10和PM2.5暴露对小鼠中性粒细胞激活和NET形成的影响，并评估姜黄素预处理是否能够减轻这些影响。通过分析2周和4周的暴露效应，我们旨在揭示PM对NETosis的急性和亚慢性影响以及姜黄素的时效性保护作用。这项研究为PM引起的呼吸系统炎症和损伤的病理生理机制提供了新的见解，特别关注中性粒细胞激活和NETs形成的作用及其潜在关联。了解这些机制有助于开发针对颗粒物（PM10/2.5）暴露的不利健康影响的靶向治疗策略。

**方法**
来自印度瓦拉纳西巴纳拉斯印度教大学动物设施的Balb/c小鼠（20-25克）被用于实验。小鼠生活在特定的无病原体环境中，温度为25℃，光照周期为12小时/天，提供标准饮食和充足的水。所有实验程序均获得巴纳拉斯印度教大学动物伦理委员会（IAEC）的批准，并遵循CPCSEA指南进行。

**结果**
对照组小鼠的肺呈健康的粉红色，表明肺组织氧合正常且损伤最小。PM10暴露组的小鼠肺部颜色明显变化，粉红色褪去，转为棕色，这可能是由于呼吸系统中存在PM10颗粒所致。相比之下，PM2.5暴露组的小鼠肺部的颜色变化更为显著。

**讨论**
本研究证明了PM10/2.5引起的肺部炎症和损伤过程中NETs的形成，同时证实了姜黄素对这些病理过程的保护作用。研究揭示了PM引起的呼吸系统病理机制的一些关键见解和潜在的治疗策略。实验中使用的PM剂量高于典型环境水平，旨在模拟实际暴露情况。

**结论**
本研究为PM引起的呼吸系统炎症的病理生理机制提供了新的见解，特别关注中性粒细胞激活和NETs形成的作用。研究发现，PM10和PM2.5暴露均会引发显著的肺部炎症和NETs形成，尤其是在暴露2周和4周时观察到额外的核外纤维（DNA）。姜黄素预处理能有效减轻这些效应。

**作者贡献声明**
拉什米·辛格（Rashmi Singh）：负责写作、审稿与编辑、验证、监督、资源管理、项目管理和资金争取、概念构思。
阿巴伊·库马尔·辛格（Abhay Kumar Singh）：负责写作、审稿与编辑、软件使用、资源管理、项目管理和资金争取、概念构思。
普拉尚特·库马尔·乔汉（Prashant Kumar Chauhan）：负责软件使用、方法学设计、实验操作、数据管理和分析。
沙琳尼·辛格（Shalini Singh）：负责方法学设计、实验操作、数据管理和分析。
万丹娜·索尼（Vandana Soni）：负责软件使用、方法学设计、实验操作和正式数据分析。

**利益冲突声明**
作者声明没有已知的可能影响本研究结果的财务利益或个人关系。