RUNX3 通过调节 Hippo 信号通路介导黄曲霉素 B1 诱导的肝细胞凋亡

《Toxicology》：RUNX3 Mediates Aflatoxin B1-Induced Hepatocyte Apoptosis through Modulation of the Hippo Signaling Pathway

　　

莫云英|姜媛媛|黄仕晗|艾莉亚·伊吉亚提|郑世雄|叶红|咸晓宇|余星宇|肖玉轩|魏金志|何芝妮

中国广州南方医科大学公共卫生学院食品安全与健康研究中心，510515

摘要

黄曲霉素B1（AFB1）是一种常见的食源性霉菌毒素，对人类和动物健康构成严重威胁，尤其是通过肝毒性作用。尽管凋亡被视为AFB1诱导的肝脏损伤中的核心事件，但相关的上游调控机制仍不完全清楚。我们之前的研究发现，runt相关转录因子3（RUNX3）表达的增加是AFB1诱导的肝细胞恶性转化中的一个关键早期事件，并证明了其作为AFB1暴露人群暴露量和生物效应生物标志物的潜力。然而，RUNX3调控AFB1诱导的肝细胞凋亡的精确机制尚不清楚。在本研究中，我们探讨了RUNX3在AFB1诱导的肝细胞凋亡中的作用，并研究了其与Hippo信号通路的功能关系，使用了两种人永生化肝细胞系THLE-2和L-02。AFB1暴露显著增加了凋亡细胞死亡，破坏了线粒体膜电位（ΔΨ_m），并改变了包括BAX、BCL2和CASPASE-3在内的凋亡相关蛋白的表达。同时，AFB1处理增加了RUNX3的表达，并伴随着Hippo通路相关信号的显著变化。沉默RUNX3显著减弱了AFB1诱导的凋亡，并部分逆转了相关的Hippo通路改变。同样，该通路的药理抑制也减少了AFB1的促凋亡效应。总体而言，这些发现表明RUNX3通过调节Hippo信号通路来介导AFB1诱导的肝细胞凋亡。这项研究为AFB1诱导的肝毒性的分子机制提供了见解，并表明RUNX3可能成为AFB1相关肝脏损伤的潜在生物标志物和干预靶点。

引言

黄曲霉素B1（AFB1）是最强效且最常见的天然黄曲霉素（Woloshuk和Shim 2013），被国际癌症研究机构（IARC）列为1类致癌物（Baan等人，2009年）。黄曲霉素污染是一个持续的全球食品安全隐患，估计有45亿人生活在低收入和中等收入国家，他们在食物链的多个环节（从生产、收获到储存和消费）长期暴露于受污染的主食中（Magnussen 2013）。2021年至2024年在中国进行的饲料监测研究表明，AFB1污染非常普遍，通常与其他污染物（如脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON）和玉米赤霉烯酮（ZEN）同时存在，对食品安全构成严重威胁（Liu等人，2025）。

肝脏是黄曲霉素毒性的主要靶器官。作为一种基因毒性致癌物，AFB1没有安全的暴露阈值（Shirabe等人，2011年；Marchese等人，2018年；Kensler等人，2011年）。凋亡是一种严格调控的、进化上保守的程序性细胞死亡形式，对于胚胎发育、组织稳态和受损细胞的清除至关重要（Kucukcakan和Hayrulai-Musliu，2015年）。越来越多的证据表明，即使是短期、低剂量的AFB1暴露也会导致肝细胞DNA加合物的形成、脂质过氧化，以及肝细胞中药物代谢和线粒体功能的受损——这主要是由氧化应激和内在凋亡通路的激活引起的——从而促进慢性肝损伤的发病机制（Zhang等人，2023年；Ou等人，2023年；Shalhout等人，2021年；Wang等人，2023年；Deng等人，2024年）。简而言之，AFB1的体内肝毒性主要是由其最终有毒代谢物AFB1-8,9-环氧物（AFBO）驱动的。从机制上看，当肝脏的解毒能力超负荷时，累积的AFBO会破坏线粒体完整性，改变Bax/Bcl-2的比例，并促进caspase-3的切割，最终导致线粒体凋亡——这是AFB1诱导的肝毒性的一个众所周知的特征（Gillies和Kuwana，2014年；Kew，2003年；Grenier和Applegate，2013年；Liu和Wang，2016年；Lv等人，2024年；Deng等人，2024年）。尽管大家都认同AFB1在肝细胞中的促凋亡效应，但其上游分子决定因素及其精确的调控层次仍不完全清楚（Zeng等人，2025年；Frangiamone等人，2024年）。因此，识别这些关键调控因子并阐明它们的机制作用对于准确的风险评估、早期干预以及开发针对AFB1相关肝脏疾病的靶向对策至关重要。

我们之前的工作在永生化人肝细胞（L-02R）中建立了AFB1诱导的恶性转化模型，其中MeDIP-seq鉴定RUNX3是癌前进展过程中最早上调的表观遗传基因之一。RUNX3在早期转化阶段表达显著增加，使其成为AFB1引发肝癌的候选驱动因素。与此一致的是，流行病学研究将外周血液或肝组织中RUNX3mRNA水平的升高与AFB1暴露状态和早期病理变化联系起来，支持其作为暴露量和生物效应双用途生物标志物的作用（Wang等人，2017年）。然而，RUNX3是否以及如何参与AFB1诱导的肝细胞凋亡仍不清楚。

RUNX3是一种Runt结构域的转录因子，是一种真正的肿瘤抑制因子，在细胞命运决定中具有多方面的功能，包括增殖抑制、凋亡诱导、血管生成抑制和谱系分化（Ito等人，2015年；Ozaki等人，2013年；Ito，2008年；Blyth等人，2005年）。在肝细胞中，RUNX3通过转录激活促凋亡因子（如Bim）并抑制抗凋亡信号来促进凋亡，并已被证明能在肝癌细胞中触发caspase依赖的凋亡（Nakanishi等人，2011年）。值得注意的是，RUNX3是肝癌中最常被表观遗传沉默的肿瘤抑制因子之一，在50-92%的临床肝癌标本中报告其mRNA下调（Mori等人，2005年）。

新的证据进一步表明RUNX3参与Hippo通路的调控：其Runt结构域直接结合TEAD转录因子的N端，从而破坏YAP–TEAD致癌复合物的形成，并促进抑制性YAP–TEAD–RUNX3三聚体的组装（Chuang和Ito，2021年）。Hippo通路是调节肝脏大小、再生和肿瘤发生的主要通路，通过保守的激酶级联调控肝细胞增殖、凋亡和分化（Machado等人，2015年；Harvey等人，2013年；Fu等人，2022年）。有趣的是，对AFB1暴露大鼠肝脏的转录组分析显示Hippo信号通路中的不同表达基因显著富集——包括MST1、LATS2和YAP1——表明其参与AFB1介导的生长抑制和凋亡（Xie等人，2021年）。然而，尚未有研究探讨RUNX3与Hippo信号通路在AFB1诱导的肝细胞凋亡中的功能相互作用。

综上所述，在基于RUNX3作为AFB1肝毒性敏感和早期反应生物标志物的基础上，本研究使用人肝细胞模型探讨了RUNX3与Hippo通路在介导AFB1触发凋亡中的机制联系。我们的发现提供了关于AFB1诱导的肝脏损伤早期分子事件的实验依据，并支持RUNX3作为预测性生物标志物和治疗调节节点的转化潜力。

部分片段

细胞培养和处理

人永生化肝细胞系L-02细胞（中国宁波明州生物科技公司）和THLE-2细胞（中国浙江梅森中国组织培养库）在标准条件下培养：37°C、5% CO?和95%相对湿度。L-02细胞在添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（Gibco，美国）的RPMI-1640培养基中培养。THLE-2细胞在添加了...

AFB1在人永生化肝细胞中诱导细胞毒性和线粒体凋亡

为了表征AFB1诱导的肝毒性，我们首先使用MTT测定法确定了其浓度依赖性对L-02和THLE-2细胞活力的影响。AFB1暴露72小时显著降低了细胞活力，呈剂量依赖性（图S2）。基于这些细胞毒性数据，后续的功能实验使用了0、0.75、1.5、3和6μg/mL的AFB1浓度用于THLE-2细胞，以及0、0.3、0.6、1.2和2.4μg/mL的AFB1浓度用于L-02细胞——涵盖了亚细胞毒性到中度毒性范围

讨论

黄曲霉素B1仍然是全球肝毒性和肝癌的主要贡献者，尤其是在饮食暴露高且监管基础设施有限的地区。虽然其致癌性已明确，但能够早期检测AFB1诱导的肝脏损伤的经验证的分子生物标志物仍然很少——这些标志物能够区分暴露和生物效应，并预测进展风险。我们之前的研究发现RUNX3持续上调

伦理批准

本文不包含任何作者进行的人类参与者或动物研究。

未引用的参考文献

（Deng等人，2025年）

资助

这项研究由Newton国际奖学金（授予编号：NIF/R5/258）和东莞市科技计划项目（授予编号：20231800939892）资助。

CRediT作者贡献声明

姜媛媛：验证、方法学、数据管理。莫云英：撰写——初稿、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念构思。黄仕晗：软件、方法学、概念构思。郑世雄：可视化、研究。艾莉亚·伊吉亚提：验证、研究、正式分析。咸晓宇：可视化、数据管理。叶红：软件、方法学。肖玉轩：方法学、正式分析。余星宇：正式分析。何芝妮：撰写——

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢参与这项研究的各位成员的支持和协助。