《Toxicology and Applied Pharmacology》：Regionally specific dysregulation of gut microbiota and host–metabolite interface in podophyllotoxin-induced enterotoxicity based on the toxicological evidence chain concept
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姜涛|孙佳星|刘传新|孙宇涵|陈合涛|刘冬霞|陈瑞燕|王艳秋|于毅|段佳佳中国河南省科学技术大学临床医学院附属第一医院临床实验室，洛阳斑马鱼毒理学研究重点实验室，血液系统疾病移植与免疫学研究重点实验室，洛阳 471003摘要鬼臼毒素（PPT）通过破坏肠道微生物群引发肠毒性；然而，
姜涛|孙佳星|刘传新|孙宇涵|陈合涛|刘冬霞|陈瑞燕|王艳秋|于毅|段佳佳
中国河南省科学技术大学临床医学院附属第一医院临床实验室，洛阳斑马鱼毒理学研究重点实验室，血液系统疾病移植与免疫学研究重点实验室，洛阳 471003
摘要
鬼臼毒素（PPT）通过破坏肠道微生物群引发肠毒性；然而，肠道区域特异性对毒性的影响仍不清楚。本研究利用毒理学证据链框架，调查了PPT诱导的肠毒性在不同肠道段的特异性变化。雄性Sprague-Dawley大鼠每日口服PPT（10、15或20mg/kg），持续4天。通过组织病理学和定量实时聚合酶链反应分析紧密连接蛋白及促炎细胞因子来评估肠道毒性。对小肠、盲肠和结肠的内容物进行16S rRNA测序和代谢组学分析。利用Spearman相关性分析和K均值聚类方法分析微生物-代谢物相互作用。结果表明，PPT暴露导致显著的肠毒性，表现为腹泻、绒毛损伤、杯状细胞丢失、屏障功能受损和炎症。16S rRNA测序显示有益菌属Romboutsia、Lombactobacillus和Turicibacter的数量显著减少，而致病菌属Escherichia-Shigella在所有肠道段均有所擴增。代谢组学分析揭示关键代谢途径的严重紊乱。值得注意的是，涉及维生素B6、组氨酸和色氨酸代谢的潜在协同保护轴发生改变，其中核心代谢物如4-吡哆酸和β-丙氨酰-L-组氨酸的表达显著下调。更重要的是，这些微生物和代谢变化在空间上表现出明显的差异。网络分析表明，有益菌减少与保护性代谢物下调之间的相关性在盲肠和结肠中比在小肠中更强。综上所述，这些发现提供了系统证据，表明PPT诱导的肠毒性与肠道微生物群-代谢物网络的区域特异性紊乱有关，这可能成为缓解PPT诱导的肠道损伤的潜在靶点。
引言
鬼臼毒素（PPT）是一种选择性木脂素，最初从Podophyllum peltatum和Sinopodophyllum hexandrum Royle等植物的根茎中分离出（Canel等人，2000年；Hartwell和Schrecker，1951年）。由于其显著的生物活性，PPT一直是药理学研究的重点。先前的研究表明，PPT家族具有广泛的治疗特性，包括抗菌、抗炎、解痉、降脂、免疫抑制、抗氧化、抗肿瘤和镇痛作用（Yu等人，2017年）。然而，临床应用中PPT可能引发全身性不良反应，主要表现为胃肠道毒性、神经毒性和骨髓抑制（Shah等人，2021年；Kao等人，1992年）。我们之前的研究证实PPT在Sprague-Dawley（SD）大鼠中可引起肠毒性，表现为腹泻等肠道损伤。值得注意的是，腹泻的发生与肠道微生物群密切相关（Li等人，2021年），其特征是Proteobacteria的数量增加，而Bifidobacterium和Lactobacillus的数量减少（Ma等人，2011年；Solano-Aguilar等人，2013年；Monira等人，2012年）。
哺乳动物肠道中的微生物群种类繁多且组成多样，其在整个肠道内的密度和组成存在梯度变化，在局部微环境中发挥着不同的功能（Ryan等人，2021年）。肠道微生物群通过其代谢物调节免疫、维持黏膜屏障、抑制病原体过度生长，并提供维生素和能量，从而在维持宿主稳态中起关键作用（Tlaskalová-Hogenová等人，2011年；B?ckhed等人，2012年）。肠道微生物群的组成在一定范围内动态变化，但这些生理波动通常不会损害正常功能。相比之下，菌群失调被认为是许多疾病的中心或驱动因素。数百种内源性和外源性因素可影响个体的肠道微生物群，其中药物是最重要的环境因素之一（Weersma等人，2020年）。我们之前的研究表明，接受PPT处理的SD大鼠会出现结肠菌群失调，这与肠毒性密切相关。然而，大多数研究仅聚焦于单个肠道段，常忽视不同肠道段之间微生物变化的相关性。因此，本研究全面分析了PPT暴露的SD大鼠小肠、盲肠和结肠中肠道微生物群组成和丰度的差异与重叠。
来自肠道微生物群的代谢物作为微生物群与宿主之间的关键分子中间体。微生物组成的变化可以改变细菌的代谢组（Burnard等人，1983年）。驻留的肠道微生物群能够合成、调节和降解多种生物活性代谢物，在碳水化合物、脂质、蛋白质、氨基酸、维生素和胆酸的代谢中发挥重要作用（Dai等人，2023年）。例如，来自肠道微生物群的色氨酸代谢物对肠道稳态至关重要。其中，色氨酸的代谢产物吲哚通过上调维持上皮细胞结构和功能的基因表达来改善肠道上皮屏障（Bansal等人，2010年；Shimada等人，2013年）。
我们团队于2019年首次提出的毒理学证据链框架（Liu等人，2020年）被用于本研究，通过整合多组学方法系统阐明PPT的肠毒性机制。该框架包括四个关键要素：有害成分证据（HIE）用于识别潜在的有毒成分，损伤表型证据（IPE）用于识别毒性损伤的表现，不良结果证据（AOE）用于确认目标器官的显著损伤，以及毒性事件证据（TEE）。在本研究中，给SD大鼠施用不同剂量的PPT，随后对小肠、盲肠和结肠进行了全面的组织病理学评估。此外，还测量了紧密连接蛋白和炎症细胞因子的mRNA表达水平。为了进一步阐明PPT诱导毒性的潜在因素，采用16S rRNA测序和代谢组学分析相结合的方法，从肠道微生物群-代谢物相互作用的角度，研究小肠、盲肠和结肠中与PPT暴露相关的候选靶点和途径。这种综合方法揭示了与PPT诱导的肠毒性相关的微生物群-代谢物变化的区域特异性模式，为未来基于细菌或代谢物的干预措施提供线索。
片段
动物实验设计及样本采集
本研究获得了河南科技大学附属第一医院的批准（科学伦理批准号2023-D-H0010）。实验遵循中华人民共和国科技部颁布的实验室动物管理规定进行。实验使用的雄性SD大鼠体重为150±20克，年龄6-8周，购自Vital River Laboratories（北京，中国）。大鼠被饲养在受控环境中
PPT诱导肠道毒性（IPE和AOE）
PPT干预导致肠道毒性症状，如腹泻。PPT组的粪便样本显示粪便呈糊状附着在大鼠体表，而对照组的粪便表面干净（图1A）。此外，PPT组的粪便中性脂肪含量（BSFS）高于对照组（5.3±0.3 vs 3.6±0.16）（图1B）。值得注意的是，PPT加重了大鼠的体重下降（图1C）。为进一步评估PPT对肠道的毒性作用，
讨论
先前的研究（Duan等人，2024b）证实PPT暴露可引起肠毒性，并改变肠道微生物群的组成和功能以及代谢组。然而，以往的研究仅关注结肠，未能揭示PPT对整个胃肠道微生物-代谢网络的区域性影响。本研究创新性地对包括小肠、回肠和结肠在内的整个肠道进行了全面分析。
CRediT作者贡献声明
姜涛：撰写——初稿撰写、研究、数据整理。孙佳星：撰写——初稿撰写、研究、概念构思。刘传新：研究、数据整理。孙宇涵：研究、数据整理。陈合涛：研究、数据整理。刘冬霞：撰写——审稿与编辑、研究。陈瑞燕：撰写——审稿与编辑、研究。王艳秋：撰写——审稿与编辑、研究。于毅：项目管理、概念构思。段佳佳：
伦理审批与参与同意
本研究获得了河南科技大学附属第一医院的批准（科学伦理批准号2023-D-H0010），并遵循中华人民共和国科技部颁布的实验室动物管理规定进行。
资助
本工作得到了国家自然科学基金（编号：82404774）和河洛青年人才支持计划（编号：2025HLTJ45）的支持。
