综述：用于基于CRISPR-Cas12a和Cas13a的生物传感的工程化crRNA：分子设计原则与新兴架构

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：Engineering crRNA for CRISPR–Cas12a‐ and Cas13a‐based biosensing: molecular design principles and emerging architectures

　　吴英宇 | 周书宇 | 叶晓晗 | 朱涛 | 邓飞 | 杨丹婷
中国宁波大学医学院病理生理技术浙江省重点实验室预防医学系，宁波315000

摘要
基于CRISPR–Cas12a和Cas13a的生物传感器通过实现可编程、高灵敏度的核酸检测（且可能无需扩增），显著推动了分子诊断技术的发展。这些平台的核心是CRISPR RNA（crRNA），它控制着目标识别、核酸酶激活以及旁切作用的效率。因此，合理的crRNA工程设计是决定CRISPR诊断方法灵敏度、特异性和可靠性的关键因素。本文综述了CRISPR生物传感中crRNA工程策略的最新进展，重点介绍了三种互补的设计框架：crRNA的分子工程（序列级优化、结构工程、化学稳定性）、生物信息学和人工智能辅助的导向序列优化，以及用于多重检测的可编程或模块化crRNA结构。特别强调了Cas12a和Cas13a系统的独特机制特征和设计限制，并探讨了crRNA性质如何影响激活阈值、错配判别能力和信号放大效率。最后，讨论了当前可扩展的、基于机制的crRNA设计所面临的挑战及新兴机遇，重点是提高检测的可靠性、对目标变异的耐受性以及现场适用性。总体而言，这些发展为下一代基于CRISPR的诊断技术提供了一个统一的设计原则。

引言
快速、准确且经济可行的分子诊断对于早期疾病检测和 epidemic 控制至关重要。传统的核酸检测技术，如聚合酶链反应（PCR）和下一代测序（NGS），具有高灵敏度和特异性[1]。然而，这些方法通常依赖于复杂的工作流程、昂贵的仪器和受过培训的人员，限制了其在分散或资源有限环境中的应用[2]。这一未满足的需求推动了开发便携式生物传感平台的努力，这些平台能够将分子识别事件转化为具有可比精度的量化信号。包括表面等离子体共振（SPR）[3]、荧光[6]、表面增强拉曼散射（SERS）[7]、微流控系统[10]和电化学生物传感器[12, 13, 14]在内的多种生物传感技术都各有独特的分析优势，但其广泛应用仍受到的共同瓶颈包括高系统成本、有限便携性和易于受到基质干扰的问题。在复杂的生物样本中同时实现高特异性和稳健性仍然是一个重大挑战。全球对COVID-19大流行的响应进一步凸显了需要具备灵敏度、快速性和简单性的可扩展诊断系统的紧迫性，从而促进了基于CRISPR的分子诊断技术作为变革性解决方案的兴起[15, 16]。

规律间隔短回文重复序列（CRISPR）及其相关的Cas蛋白构成了细菌和古菌中的天然适应性免疫系统[17]，能够以单核苷酸精度识别和切割外来核酸[18]。CRISPR–Cas系统主要分为两大类：I类（类型I、III、IV和VII）和II类（类型II、V和VI）[19]（表1）。I类系统需要多亚基复合物，而II类系统则依赖单一多结构域蛋白[20]。自1987年在大肠杆菌中发现以来[21]，CRISPR–Cas已经发展成为精准医学[22]、作物工程[23]、食品安全[25]和分子诊断[26]的多功能工具包。特别是II类CRISPR系统——以Cas9、Cas12a（类型V）和Cas13a（类型VI）为代表——因其结构简洁性和高编程性而受到广泛关注[27, 28, 29]。其中，Cas12a和Cas13a因其独特的旁切活性而在诊断应用中尤为有价值[30]。一旦被目标核酸激活，这些核酸酶可以非特异性地切割周围的报告分子，从而放大检测信号，实现超灵敏的分子诊断，而无需复杂的扩增程序[31, 32, 33]。基于这一机制，已经开发出多种基于CRISPR的诊断平台，包括DETECTR平台（DNA内切酶靶向CRISPR报告器）[31]、HOLMES（一种一小时低成本多功能高效系统）[34]和SHERLOCK（特定高灵敏度酶报告器解锁系统）[29]。这些系统能够快速、高度特异性和灵敏地检测病毒（例如SARS-CoV-2[35]、流感[36]）、病原体（例如食源性病原体[4, 37, 38]）、游离DNA和RNA分子，甚至通过核酸适配体检测蛋白质靶标[39]。无标记信号传导和核酸纳米结构的进步进一步扩展了生物传感平台的设计空间，例如为microRNA检测定制的CRISPR-纳米材料混合系统[40]，以及基于多价DNA纳米花的适配体传感器，用于食品样本中小分子毒素的灵敏无标记检测[41]，这些成就共同凸显了下一代生物传感技术的广泛应用前景。尽管取得了这些进展，现有的基于CRISPR的诊断系统仍面临一些限制其广泛实际应用的挑战，包括严格的扩增精度要求[42]、易受交叉污染[43]、多重检测能力有限[44]、设备成本高昂[45]，以及某些实现中相对较长的检测流程[46]。解决这些限制需要更好地控制控制CRISPR识别、激活和信号产生的分子成分。

CRISPR RNA（crRNA）是这些过程的核心，它作为可编程导向器将Cas核酸酶引导至特定的核酸目标[47]。crRNA的序列组成、长度和化学结构直接影响杂交动力学[48]、目标判别[49]和核酸酶激活[50]。如果crRNA导向器设计不当，Cas12a和Cas13a会失去其特异性和催化活性[51, 52]。因此，crRNA已成为决定基于CRISPR的生物传感器分析性能的关键分子因素[53]。合理设计的crRNA可以提高检测灵敏度、改善特异性，并增强生化稳定性，同时实现多重检测[54]、实时监测[55]和精细的信号放大效率[56]。最近的研究表明，多种crRNA工程策略（包括序列优化[57, 58]、二级结构调节[59]和化学修饰[60, 61]）可以显著提升CRISPR诊断的性能[62, 63]。例如，截短或延长导向序列以提高错配判别能力[64]、化学稳定的crRNA以抵抗核酸酶降解[65, 66]，以及循环或分叉结构以实现多重检测[67, 68]。这些进展突显了crRNA分子设计在控制基于CRISPR的生物传感平台的灵敏度、特异性和操作稳定性方面的核心作用。

虽然最近有一些综述讨论了工程化的crRNA策略[40, 62, 69, 70]，但大多数研究主要关注单个Cas12a系统，或者提出了分散的工程方法分类，而没有建立一个统一的分子设计框架。此外，关于crRNA序列组成、结构组织和化学修饰如何共同调节CRISPR生物传感性能的机制见解仍不够充分整合。此外，用于合理导向RNA设计的计算工具和生物信息学方法才刚刚开始应用于CRISPR生物传感器的开发。为了解决这些不足，本文全面概述了CRISPR–Cas12a和Cas13a系统的工程化crRNA策略的最新进展。我们将现有方法置于一个 hierarchical 分子设计框架内（图1），包括：(i) 分子工程（包括序列级优化、结构工程和化学修饰）；(ii) 生物信息学和人工智能辅助设计；(iii) 组合和模块化架构。对于每种策略，我们讨论了其背后的分子机制、分析优势以及在基于CRISPR的诊断中的应用。最后，我们指出了与crRNA稳定性、特异性和可扩展性相关的剩余挑战，并概述了下一代可编程CRISPR生物传感器的未来机遇。通过建立一个系统的设计视角，本文旨在为高性能的基于CRISPR的分子诊断平台提供概念性指导，使其适用于实际临床和现场应用。

**crRNA引导的CRISPR–Cas12a和CRISPR–Cas13a系统的结构和机制基础**
在所有CRISPR–Cas系统中，crRNA是将原核生物适应性免疫转化为可编程核酸识别的分子核心。因此，理解crRNA引导的Cas激活的结构和机制基础对于合理设计基于CRISPR的生物传感系统至关重要。结构上，crRNA由一个重复序列衍生的支架组成，该支架锚定Cas效应器，以及一个通过沃森-克里克碱基配对定义目标特异性的间隔序列。

**通过长度调节进行序列级设计：调整Cas激活阈值**
crRNA的长度是一个关键参数，因为它直接影响Cas-crRNA-目标三元复合物的形成和稳定性，从而决定了旁切作用的激活阈值（表3）。除了对结合亲和力的影响外，间隔序列和重复序列的长度还通过控制R-loop传播、构象重排和核酸酶激活动力学来调节灵敏度和特异性之间的能量平衡。因此，

**CRISPR–Cas12a和CRISPR–Cas13a系统中crRNA设计的挑战和未来方向**
为了系统地概述crRNA工程策略及其应用相关性，我们构建了一个统一的 design framework（图7），该框架将设计策略、核心工程特征和代表性应用场景联系起来。这一框架展示了如何通过合理的crRNA设计来实现特定的功能成果，例如无扩增的超灵敏检测和单核苷酸判别。

**基于CRISPR的生物传感已经通过实现可编程和高灵敏度的核酸检测彻底改变了分子诊断。在CRISPR效应器中，Cas12a和Cas13a因其强大的旁切活性而特别适于快速、无需扩增的检测。在这些系统中，crRNA是中心的功能决定因素，控制目标特异性、核酸酶激活和整体检测性能。在本综述中，我们系统地总结了最近的...**

**CRRediT作者贡献声明**
邓飞：撰写–审阅与编辑。朱涛：撰写–原始草稿，监督。叶晓晗：撰写–审阅与编辑。周书宇：撰写–原始草稿。吴英宇：撰写–原始草稿。杨丹婷：撰写–原始草稿，监督，资金筹集，概念化。

**利益冲突声明**
作者声明没有可能影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

**数据可用性**
本文所述研究未使用任何数据。

**致谢**
本工作得到了浙江省自然科学基金（批准号LY23H260002）、中国国家111项目（D16013）以及宁波大学K.C. Wong Magna基金的支持。