由超声波引发的鲁米诺/抗坏血酸体系的延迟化学发光

《Ultrasonics Sonochemistry》：Delayed chemiluminescence of luminol/ascorbic acid system triggered by ultrasound

　　Koki Azegami | Fumiki Takahashi | Hirosuke Tatsumi | Jiye Jin
信州大学理学部化学系，日本长野县松本市朝日3-1-1，390-8621

**摘要**
鲁米诺的声化学发光（SCL）通常由声空化驱动的即时光发射所特征。在此，我们报告了一种新的“记忆效应”现象，称为超声诱导的延迟化学发光（DCLIU），该现象观察到在鲁米诺/抗坏血酸（H2A）/Co2+/CO32?系统中。与传统上抗坏血酸作为简单自由基清除剂的作用相反，我们证明了微量的抗坏血酸在超声照射停止后能够诱导出一个明显的二次发射峰值。机理研究表明，这种延迟对应于一个由超声触发的氧化还原循环：抗坏血酸最初通过清除空化产生的活性氧物种（ROS）来抑制发光。然而，产生的抗坏血酸自由基中间体（A•?）随后在Co2+存在下作为促氧化剂，将溶解的氧气还原为超氧化物阴离子（O2•?）并积累过氧化物阴离子（HO2?）。一旦抗坏血酸耗尽，累积的氧化剂会从鲁米诺/HO2?/Co2+/CO32?系统中产生强烈的化学发光。这种延迟发射在氮饱和溶液中不存在，证实了溶解氧的关键作用。从分析化学的角度来看，延迟时间和积分发光强度对纳米摩尔范围内的抗坏血酸浓度呈现线性响应（LOD = 1.2 nM）。该方法对常见干扰物具有高选择性，并已成功应用于商业饮料和维生素补充剂中抗坏血酸的定量分析。

**1. 引言**
化学发光（CL）因其高灵敏度、简单性和最小的背景干扰而长期以来被公认为一种有价值的分析工具。在各种CL系统中，基于鲁米诺的反应已被广泛研究并应用于化学传感、生物测定和环境监测[1][2]。当与超声照射结合时，鲁米诺可以产生声化学发光（SCL）[3][4][5][6][7]，这一现象主要归因于在声空化过程中形成活性氧物种（如羟基自由基（•OH）和超氧化物阴离子（O2•?）。抗坏血酸（H2A）作为一种众所周知的抗氧化剂，通常被认为在鲁米诺SCL系统中起到淬灭作用，因为它可以清除活性氧物种[8][9][10]。在这项研究中，我们报告了一种新现象，即在1 MHz超声照射下观察到的鲁米诺/H2A SCL系统中的超声诱导延迟化学发光（DCLIU）。与典型的淬灭效果相反，微量的H2A在超声照射停止后会在微量Co2+和碳酸根离子存在下诱导出一个明显的二次CL发射。这种延迟信号在氮饱和溶液中不存在，但在有氧条件下增强，表明超氧化物阴离子（O2•?）在发光机制中起核心作用。
本研究的目的是阐明DCLIU的潜在机制，重点关注H2A在超声反应环境中的双重抗氧化/促氧化行为。我们提出，在超声照射过程中，H2A最初通过清除空化产生的ROS来抑制即时化学发光。一旦H2A被氧化，其自由基中间体（A•?）在微量Co2+存在下促进O2•?的生成，并在延迟阶段产生过氧化物阴离子（HO2?）。H2A耗尽后，鲁米诺/HO2?/Co2+系统会产生延迟发射。此外，我们研究了DCLIU作为定量检测超微量H2A的敏感和选择性分析方法的潜力，证明了其适用于实际样品分析，包括商业饮料。

**2. 实验**
2.1. **试剂**
所有试剂均为分析纯，未经进一步纯化即使用。鲁米诺、碳酸钠（Na2CO3）、尿酸和葡萄糖购自FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation（日本大阪）。L(+)-抗坏血酸（H2A）和Co2+标准溶液（1,000 ppm）购自Nacalai Tesque（日本京都）。咖啡酸购自Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.（日本东京）。所有溶液均使用WS200蒸馏系统（Yamato Scientific Co., Japan）纯化的蒸馏水配制。
2.2. **设备和测量装置**
SCL测量系统的示意图如图1所示。一个1 MHzlead-zirconate-titanate（PZT）换能器（直径：25 mm，Honda Electronics Co., Ltd.，日本丰桥）安装在一个固定在圆柱形石英池（内径：3 cm）底部的不锈钢板上。换能器由WF1974函数发生器（NF Corporation，日本）产生的正弦信号驱动，并由T145-5015功率放大器（THAMWAY Co., Japan）放大。对于所有SCL实验，池中充满了含有0.1 M Na2CO3、10 μM鲁米诺和微量H2A以及1 μM Co2+作为催化剂的样品溶液。样品直接由PZT照射。所有测量都在防光盒内进行，以消除环境光的干扰。

**3. 结果与讨论**
3.1. 微量H2A存在下鲁米诺的SCL和DCLIU行为
图2显示了在1 MHz超声照射下，含有10 μM鲁米诺、0.1 M Na2CO3和1 μM Co2+的水溶液的SCL响应，照射时间为5秒，电输出功率为10 W。图(a)和(b)分别描述了存在和不存在100 nM H2A时的响应情况。在超声照射期间观察到了明显的SCL信号，但在H2A存在下其强度降低，表明空化产生的活性氧物种被H2A清除。停止照射后，两种情况下的CL强度都迅速衰减。令人惊讶的是，仅在H2A存在的情况下（图b），在静止的延迟期之后观察到了明显的二次CL信号，证实这种延迟发射（称为DCLIU）是由H2A特异性诱导的。为了研究这一机制，我们将超声结束与二次发射开始之间的时间间隔定义为Period I（延迟区），随后的化学发光定义为Period II。这种划分有助于逐步讨论DCLIU中的潜在反应。

首先，研究了溶解气体的影响。图3显示了在0.1 M Na2CO3中含有10 μM鲁米诺、1 μM Co2+和100 nM H2A的条件下，分别在(a)氮饱和、(b)空气饱和和(c)氮饱和条件下的DCLIU响应。每种溶液分别用相应气体冲洗20分钟。结果清楚地表明氧气对DCLIU活性至关重要。在氧气饱和溶液中，延迟时间最短，DCLIU强度最高。在空气饱和条件下的响应介于两者之间，而在氮饱和系统中未检测到DCLIU信号。我们将氧气饱和和空气饱和条件之间的差异归因于O2浓度的差异。在超声过程中，可能会形成活性氮物种（如NO2?、NO3?），并与活性氧物种或鲁米诺中间体相互作用。然而，在我们的实验条件下（照射时间较短），NO2?的贡献相对于主要的氧气衍生的自由基途径来说可以忽略不计。这些发现表明分子氧在活性氧物种（最有可能是超氧化物（O2•?）和过氧化物阴离子（HO2•?）的生成中起关键作用，这些物种随后在Period II期间氧化鲁米诺。

随后，研究了SCL和DCLIU强度对超声输出功率的依赖性，结果总结在表1中。在无超声照射的情况下未检测到DCLIU信号，且SCL和DCLIU的强度都随着输出功率的增加而增加，表明DCLIU是一个由超声驱动的过程。较高的声功率增强了空化活性，导致更多的空化事件和活性氧物种（如•OH和O2•?）的产生。对于SCL，这直接增加了瞬时化学发光强度，因为自由基生成增强。对于DCLIU，较高的声功率促进了H2A的氧化，并在Period I期间促进了活性中间体的积累。这些中间体的浓度增加随后增强了延迟的CL信号，如后文所述。

**3.2. Period I期间H2A浓度的变化**
先前的研究表明，H2A在水溶液中与ROS（如•OH、O2•?）具有独特的相互作用[9][10]。为了获得Period I中H2A活性的动力学信息，通过UV-Vis光谱法监测了H2A浓度的变化。图4(A)显示了在1 MHz超声照射5秒后，含有0.1 M Na2CO3、10 μM鲁米诺和100 μM Co2+的溶液的吸收光谱变化。在碱性介质中，H2A主要以抗坏血酸单阴离子（HA?）的形式存在，其在266 nm处具有特征性的吸收峰[11]。266 nm处的吸光度随时间逐渐降低，在1200秒后几乎检测不到，表明HA?通过与O2•?和•OH的反应被消耗。图4(B)将266 nm处的吸光度曲线与相应的CL响应作为时间函数进行了比较。消耗时间（1200秒）与相同条件下的CL延迟时间一致。这些结果表明HA?抑制了鲁米诺的CL反应[12]，导致一个无光发射的暗期（Period I）。延迟发射（DCLIU）仅在HA?完全耗尽后出现在Period II中。还注意到微量Co2+的共存催化了HA?的氧化，从而缩短了反应延迟时间（见补充数据中的图1S和图2S）。

因此，提出了Period I中反应的合理机制，如图1(A)所示。第一步，高活性物种如•OH和O2•?由超声空化产生。HA?通过从HA?到抗坏血酸自由基（HA•）的快速单电子转移有效清除这些物种[13]。由于照射时间较短（5秒），超声仅起引发剂的作用；随后的反应即使在超声停止后也会继续进行。HA•由于强酸性（pKa ≈ ?0.45）[14]迅速脱质子生成抗坏血酸自由基中间体（A•?）[15]。抗坏血酸自由基相对稳定，E0 ≈ ?1.01 V vs. NHE[16]，因此它可以在Co2+作为催化剂的存在下将溶解的氧气（E0 ≈ ?0.16 V vs. NHE）还原为O2•?，如图1(A)中的步骤2所示。再生的O2•?随后与HA?反应，生成过氧化物阴离子（HO2?）和脱氢抗坏血酸（DHA）[17]。因此，抗坏血酸和溶解氧气之间的氧化还原循环可以促进进一步的ROS生成，使其作用从抗氧化剂转变为促氧化剂[18]。整个反应序列在Period I中以HO2?作为最终的还原氧物种而结束。

由于ROS优先被HA?消耗而不是与鲁米诺反应，因此在Period I期间鲁米诺的化学发光（CL）被抑制。一旦HA?耗尽，涉及鲁米诺/HO2?/Co2+/CO32?系统的CL反应变得显著，如图1(B)所示。在碳酸根离子的存在下，DCLIU信号显著增强。在第二阶段，卢米诺尔在碱性条件下（典型的pH值大于10的CO32?溶液中）通过两电子步骤发生氧化。CO2+与HO2?形成过氧化物复合物[19]，通过类似芬顿的反应[20],[21]生成O2•?和•OH。CO32?与•OH反应生成碳酸根自由基（CO3•?），这些自由基以9×10^8 M^-1 s^-1的速率与卢米诺尔特异性反应[22]。因此，碳酸根离子在此系统中充当共催化剂。•OH和CO3•?都会氧化卢米诺尔单负离子（因为卢米诺尔是一种二ulates酸，其pKa值分别为6和13），从而形成激发的二负离子3-氨基邻苯二甲酸（3AP2?*）[23],[24]。当这种激发态物种放松时会产生光：3AP2?* → 3AP2? + hν。因此，微量CO2+和高浓度CO32?对DCLIU至关重要，因为它们促进了整体的化学发光反应。关于碳酸根离子的具体作用，补充数据中提供了更多细节（图3S和图4S）。激发态向基态的辐射衰变产生了光，在第二阶段观察到这一现象作为化学发光信号。

我们选择了1 MHz的超声频率，因为它提供了稳定且可重复的空化条件，适合进行机理研究。与较低频率相比，1 MHz的换能器产生的空化更加均匀，并且能够最小化温度升高，使其特别适用于分析应用。

3.4 DCLIU在痕量H2A定量中的分析性能
探讨了DCLIU作为新型H2A分析方法的潜力。图5显示了DCLIU响应与H2A浓度的关系。随着H2A浓度的增加，延迟时间和DCLIU强度也随之增加。延长的延迟时间反映了氧化更多H2A所需的时间更长。由于在H2A氧化的第一阶段会产生HO2?，较高的H2A浓度可能会增强第二阶段的卢米诺尔氧化，从而产生更强的DCLIU信号。观察到H2A浓度与积分DCLIU峰面积之间存在线性关系。对于50 nM的H2A（n = 10），相对标准偏差（RSD）为3.9%，检测限（LOD）估计为1.2 nM，基于信噪比大于3。结果表明，DCLIU能够准确且灵敏地定量痕量水平的H2A。通过比较抗坏血酸与潜在干扰物（咖啡酸、尿酸和葡萄糖）的响应来评估DCLIU的选择性（图6）。仅在存在抗坏血酸的情况下观察到显著的DCLIU信号，证实了其对H2A的高选择性。

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图5. 在含有10 μM卢米诺尔和1 μM Co2+的0.1 M Na2CO3溶液中，经过1 MHz超声照射5秒后，H2A浓度对DCLIU响应的影响。峰值面积是通过积分第二阶段的延迟化学发光信号获得的。具体的积分时间范围如下：65.06–532.42秒（10 nM），58.03–612.49秒（30 nM），69.81–734.02秒（50 nM），85.73–808.21秒（70 nM），以及103.19–813.11秒（90 nM）。

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图6. 干扰物对DCLIU强度的影响。在含有10 μM卢米诺尔、1 μM Co2+和1 μM H2A或干扰物的0.1 M Na2CO3溶液中，经过1 MHz超声照射5秒后测量。

为了评估实际应用性，该方法被应用于商业样品：一种柠檬饮料（标示的H2A含量为1.2 mg/mL）和维生素C片剂（每片含有167 mg）。柠檬饮料通过0.45 μm膜过滤器过滤，并用蒸馏水稀释1000倍。然后取100 μL的样品加入到含有0.1 M Na2CO3、10 μM卢米诺尔和1 μM Co2+的溶液中。片剂样品溶解在100 mL蒸馏水中，离心去除不溶性成分，然后再稀释1000倍进行检测。结果总结在表2中。DCLIU测得的浓度与标示值吻合良好，证实了该方法在实际样品分析中的准确性和可靠性。

表2. DCLIU在真实样品中测定H2A的结果

真实样品 DCLIU 推荐值 RSD (n = 3)
饮料 a) 1.15 ± 0.02 mg/mL 1.20 mg/mL 1.8%
维生素补充剂 b) 158 ± 4 mg/片剂 167 mg/片剂 2.7%

a) C.C. 柠檬（Suntory，日本）
b) 维生素C 2000（Minrak Co., Ltd.，日本）

4. 结论
在这项研究中，我们报道了一种新现象，称为“由超声诱导的延迟化学发光”（DCLIU），发生在卢米诺尔/H2A/Co2+/CO32?系统中。与传统的SCL不同，后者在停止照射后立即衰减发光，而该系统在特定延迟后表现出明显的二次发光。对反应动力学和机制的研究揭示了以下关键发现：1) 延迟期受H2A氧化消耗的控制。我们证明H2A在这种超声反应中扮演双重角色。最初，它作为抗氧化剂，通过单电子转移有效清除ROS并抑制立即发生的卢米诺尔化学发光。然而，由此产生的抗坏血酸自由基中间体表现出促氧化行为，与分子氧反应生成O2•?。这种自由基循环促进了HO2?的积累，而HO2?在H2A耗尽后成为卢米诺尔CL反应的氧化剂。2) 确认溶解氧对DCLIU现象至关重要，支持了O2•?的参与。此外，Co2+和CO32?离子是维持延迟发光的关键催化剂。DCLIU方法为定量H2A提供了一个稳健的平台。延迟时间（滞后时间）和积分CL强度都对H2A浓度表现出线性响应，范围覆盖nM级别。该方法达到了低检测限（1.2 nM），并对常见干扰物（包括咖啡酸、尿酸和葡萄糖）表现出优异的选择性。

CRediT作者贡献声明
Azegami Kokki：撰写–初稿，研究，数据分析。Takahashi Fumiki：撰写–审阅与编辑，验证，研究。Tatsumi Hirosuke：撰写–审阅与编辑，验证，数据分析。Jin Jiye：撰写–审阅与编辑，监督，项目管理，方法学，研究，概念化。