超声造影剂通过声波降解和机械搅拌制备方法的比较

《Ultrasonics Sonochemistry》：Comparison of ultrasound contrast agent production by sonication and mechanical agitation

　　约瓦娜·卡特琳卡·马夫拉克 | 卢卡·鲍 | 乔塞琳·里维拉 | 亚当·C·塞德威克 | 埃莉诺·斯特拉德
牛津大学生物医学工程研究所，英国牛津

**摘要**
微生物气泡（MBs）是一种表面活性剂包覆的气体囊泡，广泛应用于超声成像，并逐渐被用于治疗领域。MBs可以通过多种方法制备，最常见的是超声处理和/或搅拌。本研究旨在比较使用珠磨机组织匀浆器、牙科汞合金搅拌器以及超声处理方法制备MBs的效果。所有方法生成的MBs具有相似的大小分布（百分位数间范围约为0.44–1.6 μm），但通过搅拌方法制备的MBs浓度更高（约10^10个/毫升），且具有更持久的超声响应。通过光谱分析研究了磷脂涂层的脂质有序性，发现三种方法制备的MBs具有相似的广义极化特性。还研究了不同搅拌频率和持续时间对MBs大小分布和浓度的影响，发现增加任一参数都会提高MBs浓度并降低平均大小，每种方法都表现出不同的极限行为。最后，研究了使用组织匀浆器生成较大MB体积的可行性，结果在2毫升和5毫升的试管中均获得了大小和浓度相当的MBs。研究结果表明，珠磨机匀浆器可以生成与牙科汞合金搅拌器制备的MBs具有相似大小分布、稳定性和壳层脂质有序性的MBs。在低脂质浓度（0.9毫克/毫升）下，两种方法的性能均优于超声处理；此外，珠磨机匀浆器的污染风险更低。与牙科汞合金搅拌器相比，组织匀浆器在MB产量和可靠性方面具有更多优势。

**引言**
超声成像是多年来在医学中常规使用的一种多功能且成本低廉的诊断手段。50多年前，研究人员发现盐水中存在气泡可以暂时增强超声图像对比度[1]。自那时起，涂覆气泡作为造影剂的开发取得了进展，目前已有几种配方在临床超声心动图和其他诊断程序中得到广泛应用[2]。最常用的造影剂类别之一是磷脂包覆的微生物气泡（MBs），这些气泡也在探索各种治疗应用[3]。磷脂涂层通过防止气体扩散和降低界面张力来增强MB的稳定性，还可以对其进行功能化处理，以便将靶向物质或治疗物质附着在气泡表面[4][5][6]。

MBs可以通过多种方法制备，包括使用低频（20–50 kHz）超声在表面活性剂溶液中分散气体[7]。这种方法能大量生成多分散的MBs，但通常需要较高的表面活性剂浓度（>4毫克/毫升）才能获得满意的产量。为了解决多分散性问题，开发了多种微流体设备来生成单分散MBs[8][9][10]。然而，这些方法的通量明显低于机械搅拌方法。尽管这两种技术在研究实验室中经常使用，但将其应用于临床却较为困难，因为它们需要专门的设备和训练有素的操作人员，或复杂的样品后处理步骤以保持MB的稳定性。因此，机械搅拌成为快速可靠地制备MBs的方法，并在临床和研究环境中得到应用[11][12]。通常使用的是改良过的牙科汞合金搅拌器，它们利用每分钟数千次的大幅度往复运动来制备MBs。不过，这些设备适用于小批量生产，仅限于固定频率运行，并且容易发生机械故障。而用于组织匀浆的珠磨机匀浆器具有类似的运动特性，频率和幅度均可调节。珠磨机结构耐用，能够适应多种尺寸的试管，每次运行可处理多个试管，并且可以在不同频率下工作。本研究的目的是比较现有的MB制备方法与使用组织匀浆器的替代机械搅拌方法，最终目标是开发出更加稳健和可扩展的制造工艺。

**实验（材料与方法）**
从Avanti Polar Lipids Inc.（美国阿拉巴马州阿拉巴斯特）购买了二棕榈酰磷脂酰胆碱（DPPC）、1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸（DPPA）和1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-[甲氧基（聚乙二醇）-5000]（DPPE-PEG5k）粉末。氯仿、甘油、丙二醇、玻璃试管的铝密封圈以及透明玻璃螺旋盖试管从Sigma-Aldrich Ltd.（英国多塞特郡吉林汉姆）购买。冷冻干燥玻璃试管（产品代码：VIA1120和VIA1122）从Scientific Laboratory Supplies Ltd（英国诺丁汉）购买。C-劳丹（C-laurdan）从Bio-Techne R&D Systems（英国阿宾顿）购买，全氟丁烷从F2 Chemicals Ltd（英国兰开夏）购买。

**2.1 磷脂悬浮液的制备**
所有实验均使用了一种类似于Definity的配方（DPPC/DPPA/DPPE-PEG5k的比例为82:10:8摩尔/摩尔，PBS/丙二醇/甘油的比例为80:10:10体积/体积）。将16毫克DPPC、1.8毫克DPPA和12毫克DPPE-PEG5k在55°C下溶解于2毫升丙二醇中20分钟后，逐滴滴加到18毫升90:10的水/甘油混合物中，并在剧烈搅拌下继续反应。得到的澄清悬浮液在-20°C下保存，并在制备后1个月内使用。

**2.2 微气泡的制备**
MBs可通过两种搅拌方案之一或超声处理制备：
- **组织匀浆器搅拌方案**：将1毫升制备好的磷脂悬浮液转移到2毫升冷冻干燥玻璃试管中（内径×高度：12.5×36.5毫米），用橡胶塞封闭并用铝盖压紧。将试管放在冰上冷却，通过21G针头和三通管连接到真空泵和装有全氟丁烷的注射器。通过4次真空/再填充循环将空气替换为全氟丁烷。然后将试管插入定制的插件（图S4）中，再放入Precellys Evolution组织匀浆器（美国马里兰州贝尔廷科技有限公司）中，以10,000次/分钟的速度搅拌45秒。搅拌完成后立即放入冰上保存待进一步使用。对于较大体积的实验，先将4毫升磷脂悬浮液转移到5毫升冷冻干燥玻璃试管中（内径×高度：20×37.3毫米），再进行气体交换和搅拌。
- **Capmix搅拌方案**：试管的准备步骤与组织匀浆器相同。气体交换后，将试管放入Capmix搅拌器（Capmix Amalgam Capsule Mixing Machine，德国巴伐利亚州3M ESPE公司）中，以4300次/分钟的固定速度搅拌39秒。制备好的MBs立即放入冰上保存待进一步使用。
- **超声处理方案**：超声处理使用与搅拌方案相同的磷脂浓度，以分离气泡形成步骤的影响。将5毫升磷脂悬浮液转移到7毫升玻璃试管中（内径×高度：9.5×60毫米）。将超声探头（Q125，探头直径3毫米，功率125瓦，频率20 kHz，QSonica公司）插入悬浮液中，以35%的振幅超声处理2.5分钟（30秒开启，1秒关闭）。然后用全氟丁烷冲洗试管上部空间，将探头重新定位到气液界面，再以85%的振幅超声处理30秒，并保持持续的气流。处理完成后立即盖上试管盖并放入冰上。

**2.3 微气泡的表征与稳定性研究**
为了表征MBs的特性，将其转移到干净的玻璃试管中，并通过18G针头和5毫升注射器转移，同时通过另一个18G针头进行排气。使用Multisizer 4e（贝克曼库尔特公司，美国印第安纳波利斯）测量MB浓度和大小分布，该仪器具有20微米的孔径。每种方法分别制备了三批MBs。

**2.4 微气泡壳层中的脂质有序性测量**
C-劳丹是一种光稳定的染料，其对环境极性具有光谱敏感性，其特征是在极性环境中发射光谱发生红移。它可以用来评估膜中脂质的侧向排列[13]。440纳米和490纳米处的发射强度可用于计算广义极化（GP）值[14]，该值随脂质有序性的增加而增加，反映了膜中水分含量的减少。为了评估MB壳层中的脂质有序性，采用了一种改进的现有技术[15][16]。简要来说，将C-劳丹溶解在DMSO中至最终浓度1毫摩尔/升。新鲜制备MBs后洗涤一次以去除残留的脂质。将MBs装入5毫升注射器中，在4°C下以300克相对离心力离心5分钟。然后缓慢下降活塞芯杆去除上清液，将MBs重新分散到1毫升PBS溶液中。染色时，将MBs稀释至每毫升10^8个颗粒的浓度，并加入5微升C-劳丹染料（总体积500微升，最终C-劳丹浓度为10微摩尔/升）。加入染料后，将MBs在冰上孵育30分钟。

成像在倒置共聚焦显微镜（LSM 780，Carl Zeiss Microscopy GmbH，德国耶拿）上进行。将10微升染色的MBs滴在玻璃载玻片上，覆盖一个0.09–0.13毫米厚的盖片，使用油浸物镜（63倍放大倍数）在MB中间平面成像。用405纳米激光激发C-劳丹，记录433.8至442.7纳米（I443）和478.3至487.2纳米（I487）之间的发射光谱。所有成像均在室温下进行。

图像处理使用定制的MATLAB脚本（R2022b，美国马萨诸塞州纳蒂克）完成。通过线性强度调整和自导过滤（邻域大小11×11像素）对荧光图像进行预处理。首先使用Otsu方法进行二值化得到初始掩膜，然后用圆盘形结构元素进行形态学开运算以去除相邻气泡之间的细颈部分。通过对反向掩膜应用欧几里得距离变换并对其进行H最小值变换（抑制深度为5）以去除多余的分割。将距离图像中位于掩膜外的所有像素值设为无穷大，然后进行 Watershed 操作（8连通性），将掩膜外的所有像素值设为零，从而得到候选气泡区域。排除圆形度低于0.5或凸面积小于直径为1微米的圆形的候选气泡。通过将图像裁剪到候选区域的边界框内，分别分析每个气泡。应用圆形霍夫变换精确定位中心和半径，计算相应圆内的径向强度分布平均值（使用3像素窗口进行移动平均）。接着计算内外壳半径，分别取最大径向强度的50%以上和以下距离。所有后续处理均在显微镜原始图像上进行，未进行任何预处理。内外壳半径用于定义壳层掩膜，进一步通过排除低于75%像素强度的像素来细化掩膜。计算每个通道的左右截断分数，即落在左右边界区域内的像素强度比例（对于n<200的情况，边界宽度为强度分布的10%–90%范围内的5%；对于n≥200的情况，边界宽度为5%–95%范围内的5%；宽度截断值为0.005）。任何通道中截断分数大于1.5%的气泡被剔除。壳层厚度超过壳层半径80%的气泡也被排除在外，因为过厚的壳层表明气泡焦点偏离赤道平面，导致圆半径与实际气泡半径不符。对于每个剩余的气泡，根据公式GP=I443-I487/I443+I487计算每个像素的GP值，并据此计算平均GP值。每种制备方法分别制备了三批MBs，每批符合GP量化标准的气泡数量介于88到1767个之间。MB声学响应的测量

使用了一个中心频率为0.5 MHz的高强度聚焦超声（HIFU）换能器（H107，Sonic Concepts Inc，美国华盛顿州Bothell），来刺激置于室温（约21°C）下脱气水浴中的2 mL Eppendorf试管中的MBs。该换能器以0.5 MHz的频率、1%的占空比和5 Hz的脉冲重复频率（PRF）工作，由函数发生器（Agilent 33250A，Keysight Technologies Inc，美国加利福尼亚州）驱动，其信号通过功率放大器（ENI 1040 RF Amplifier，ENI，美国纽约）进行放大。根据使用针状水听器进行的校准，声学信号的峰值负压力在0.2至2 MPa之间变化（水听器放置在超声焦点处，并施加24伏特电压以产生换能器的峰值负电压，然后记录并转换为峰值负压力）。MBs被稀释至最终浓度为每毫升108个颗粒，转移到2 mL的Eppendorf试管中，并暴露于超声下5分钟。每次测量都使用单独的一份MBs样本。MBs的声发射信号是由中心频率为5 MHz的非聚焦换能器（Olympus V309-SU，Evident Europe GmbH，英国Stansted）记录的。该非聚焦换能器同轴集成到HIFU换能器的切割口中。来自该换能器的信号通过1.8 MHz的高通滤波器进行过滤以去除驱动频率，然后由数字示波器（Handyscope HS3，TiePie Engineering，荷兰Sneek）放大并数字化，以便进一步分析。

第二个自定义的MATLAB脚本用于分析声发射信号。首先，将汉明窗口应用于时域信号，并使用Welch方法[17]估算功率谱密度。计算每个脉冲的声发射功率，并在整个暴露时间内计算总能量。如果总功率比函数发生器开启前记录的噪声水平高出30倍（14.8 dB）以上，则认为发生了空化现象。空化时间是通过满足此条件的脉冲长度之和计算得出的。相应的平均功率也是在检测到空化的期间内的平均功率。

2.6 统计分析

所有实验都使用三种不同的MB批次进行了重复，以比较每种制造方法。描述性统计在R（版本4.0.0）中计算，并用于总结数据；结果以平均值和标准差的形式报告。

3. 结果与讨论

3.1 微泡大小和浓度

通过三种不同方法制备的MBs的大小分布（图1B）几乎相同，分别为：超声波法制备的MBs的平均直径为0.91 ± 0.02 μm（n = 3批次），Capmix法制备的为0.91 ± 0.03 μm（n = 3批次），组织均质机法制备的为0.88 ± 0.02 μm（n = 9批次）（表1，图1C）。超声波法制备的MBs大小分布略宽，平均变异系数为87%，而Capmix和组织均质机法制备的MBs的变异系数分别为76%和72%。临床相关范围内的颗粒比例也非常相似，超声波法制备的MBs中有25%、Capmix法制备的为27%、组织均质机法制备的为26%的颗粒大于1 μm，所有三种方法的颗粒大于5 μm的比例均小于1%（补充图S1C）。为了与市售造影剂进行公平比较，在表征之前没有清洗微泡，因为清洗这种尺寸范围的微泡所需的条件（300 g下的离心）可能会影响其大小分布[18]。因此，在测量MB大小和浓度时，也会计算存在于其中的残余脂质结构，这些结构的浓度大致独立于MB浓度，这可能导致在低MB浓度时低估平均直径。分布的第90百分位数（D90）也未受残余脂质的影响，分别为超声波法制备的MBs的1.55 ± 0.06 μm、Capmix法制备的MBs的1.64 ± 0.11 μm和组织均质机法制备的MBs的1.57 ± 0.05 μm（补充图S1B）。然而，在浓度测量方面观察到了显著差异：两种搅拌方法制备的MBs浓度约为每毫升10^10个颗粒（图1D），而超声波法产生的浓度低一个数量级（约10^9个颗粒）。这可能是由于用于超声波法的磷脂浓度（0.9 mg/mL）低于通常使用的浓度（>4 mg/mL）。虽然可以通过增加磷脂浓度来获得更高的微泡浓度，但代价是每批成本相应增加，以及未嵌入的磷脂过量，这可能会对后续的功能化造成问题。尽管超声波协议对难以用标准实验室设备准确标准化的工艺参数（包括气体流速和超声探头及气体出口的位置）非常敏感，但所有方法的批次间变异都是相似的。

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图1. 用三种不同方法制备的MBs的大小表征。(A) 微泡生产方法。(B) 大小分布（实线代表3批次的平均值，阴影区域代表±SD)。(C) 浓度（误差条代表标准差).(D) 平均直径（误差条代表标准差)。(B-D) 数据来自Multisizer测量。

表1. 用不同方法制备的MBs的颗粒大小测量，使用Multisizer 4e获得。a. 大小分布的变异系数；b. 第90百分位直径；c. 大于1 μm的颗粒比例；d. 大于5 μm的颗粒比例。
方法 D[1] (μm) CV (%) D90 (μm) P(D > 1 μm) (%) P(D > 5 μm) (%) 浓度 (颗粒/ml) 气体体积 (μl/ml)
Capmix 10.9 75 1.68 26.8 0.2 7.9 × 10^9 12.7 0.9 75 1.7 28.9 0.2 1.0 × 10^10 18.6 0.8 77 1.5 24.4 0.3 7.9 × 10^9 13.9 平均值 (SD) 0.91 (0.03) 76 (1) 1.64 (0.11) 26.7 (2.2) 0.2 (0.0) 8.7 × 10^9 (1.4 × 10^9) 15.0 (3.1)
TH 10.8 73 1.6 25.0 0.2 1.4 × 10^10 20.7 0.9 69 1.6 26.8 0.1 1.6 × 10^10 20.4 0.9 65 1.6 27.5 0.1 2.0 × 10^10 23.3 0.8 73 1.5 25.2 0.2 2.2 × 10^10 35.4 0.8 78 1.4 23.9 0.3 3.4 × 10^10 62.9 0.8 76 1.5 26.6 0.3 2.8 × 10^10 51.1 0.9 76 1.6 26.3 0.3 1.7 × 10^10 31.3 0.8 69 1.5 26.7 0.2 1.9 × 10^10 25.7 0.8 72 1.5 24.9 0.2 1.6 × 10^10 23.2 平均值 (SD) 0.88 (0.02) 72 (4) 1.57 (0.05) 25.9 (1.2) 0.2 (0.1) 2.1 × 10^10 (6.4 × 10^9) 32.7 (14.9)
US 10.9 89 1.6 26.9 0.8 3.5 × 10^9 10.6 20.9 19 1.5 24.6 0.8 3.0 × 10^9 8.8 30.8 21.4 24.8 0.5 3.8 × 10^9 8.5 平均值 (SD) 0.91 (0.02) 87 (4) 1.55 (0.06) 25.4 (1.3) 0.7 (0.2) 3.4 × 10^9 (3.9 × 10^8) 9.3 (1.1)
壳体脂质有序度

壳体属性，包括表面张力，是确定微泡对超声场响应的重要参数。因此，使用广义极化作为表面属性差异的定性衡量标准来比较MB的生产方法[19]。通过C-劳丹染色研究MB壳体的脂质有序度和其大小依赖性（图2）。所有三种方法制备的MBs都显示出相似的趋势——较小的、更具临床相关性的MBs（1–5 μm）比较大的MBs具有更高的脂质有序度。这一现象在组织均质机制备的MBs中尤为明显。直径大于约7 μm的MBs显示出随着尺寸增加GP值明显下降。直径大于约10 μm的所有MBs的GP值均为负值，这是液态无序（Lα）相的特征（图2A）。Capmix法制备的MBs也表现出相同的GP反转趋势（图2C），但超声波法制备的较大MBs则没有。相反，大多数直径大于10 μm的超声波法制备的MBs的GP值与较小的MBs相似。这表明超声波法制备的较大MBs可能比搅拌法制备的更稳定；这可能部分解释了为什么超声波法产生的较大MBs浓度（0.7% >5 μm）高于搅拌法（Capmix和组织均质机分别为0.2%，补充图S1C）。

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图2. C-劳丹发射与单层流体流动性关系的示意图（A）；GP分布图（B）及GP值与平均直径的关系图（C），分别针对组织均质机Capmix和超声波法制备的MBs。GP分布指的是临床范围内的MBs（1–5 μm），用灰色显示。不同的点形状（圆、方和菱形）和线型（实线、虚线、点线）代表不同的批次。

在临床相关的MB尺寸范围内，Capmix（0.38 ± 0.05，n = 3批次）和组织均质机（0.40 ± 0.02，n = 3批次）的GP分布平均值相似，而超声波法（0.35 ± 0.02，n = 3批次）的平均值略低（图2B，补充表S1）。组织均质机和超声波法的批次间变异约为5%，而Capmix法制备的批次可重复性较差，批次间变异为14%。

3.3 不同工艺参数的影响

无论是通过超声波还是搅拌在大量脂质悬浮液中形成MBs，都是一个复杂的过程。从机制上讲，已经提出气体囊泡在气体/液体界面形成，并被推入液体中，在那里它们从界面存在的脂质或从前体脂质囊泡转移的脂质中获得稳定层[20]，[21]。因此，假设改变搅拌时间或频率，以及随后的剪切混合，会对MB的浓度和大小产生影响。

图3B和D显示了在保持搅拌频率为10000 cpm的情况下，改变搅拌时间对MB大小和浓度的影响。将搅拌时间从10秒增加到45秒，MB浓度增加了10倍，平均大小减小（补充表S2）。进一步将搅拌时间增加到90秒并没有显著影响MB的大小或浓度。接下来，在保持时间固定为45秒的情况下改变搅拌频率（图3C和D，补充表S3）。将频率从4500 cpm增加到10000 cpm（本工作中使用的组织均质机可实现的最高频率），MB浓度呈指数增长（图3A）。平均大小最初随频率增加而增加，然后减小（图3C）。

这些结果至少可以部分通过考虑搅拌过程中的湍流条件来解释。由于行程长度（3.4 cm）与烧瓶尺寸相当，液体在高频率（在10000 cpm时高达约18 m/s）下每个周期撞击两次壁面，产生飞溅和再入射射流，从而卷入气相。在这种完全湍流的流动中（雷诺数约为10^5），混沌平流会拉伸和折叠卷入的气体囊泡形成丝状区域（韧带），然后由于毛细不稳定性而被掐断形成气泡。可以合理地预期，可用于气泡形成的位置数量与气液界面面积成比例，而在这种状态下，界面面积随剪切率γ?呈指数增长。由于γ?与?成比例，而?又是速度（因此是振荡频率f）的立方，因此气泡浓度与γ?∝f^1.5成指数依赖关系，这与我们的数据一致[20]。在这种简化的图中，当韧带或较大气泡的直径d增大到使毛细数（粘性应力μγ?与界面应力σ/d的比率）低于临界阈值时，就会发生气泡形成或破碎。γ?的逆依赖性将导致直径的最大值与频率成反比（d∝f^-1.5），这又与平均直径成正比[16]。实际上，在7000 cpm到10000 cpm之间测得的平均气泡直径随频率减小，但在4500 cpm到7000 cpm之间则增加。这种异常趋势可能部分是由于在低微泡浓度下脂质与微泡的比例较高，这可能导致由于残余脂质结构而低估平均直径（见微泡大小和浓度）。其他频率依赖性因素也可能起作用：简单的f^-1.5比例没有考虑热效应和界面面积增长与表面活性剂吸附的相对时间尺度。这两种效应都会随着频率的增加而阻碍气泡的破碎：前者通过降低粘度，后者通过减少表面覆盖从而增加有效表面张力。

在固定频率下，延长搅拌时间从10秒到45秒时，MB浓度最初增加，而平均直径减小。大小的减小与现有大MBs破碎成更小气泡一致。然而，将搅拌时间进一步增加到90秒并未导致浓度或大小的显著变化，表明系统可能已经达到了稳态。这表明气泡的形成和消失速率可能受到MB浓度的影响。在45秒时间点之后没有进一步的气泡破碎也与上述黏性应力与界面应力平衡所决定的频率依赖性限制尺寸一致。热效应也可能起到了作用：虽然在搅拌前后立即将脂质溶液储存在冰上以严格控制初始和最终温度，但已知以4500 cpm的速度快速搅拌类似配方45秒会导致显著的瞬时加热[22]，并且随着搅拌时间的增加，这种加热效应可能会进一步加剧。3.4. 批量体积的影响牙科汞合金搅拌器的缺点之一是它们无法生产大于1 mL的微气泡（MB）体积，因为搅拌器中所能容纳的试瓶大小有限。为了克服这一限制，研究使用了较大试瓶的组织均质机将产量提高到4 mL。按需制造较大批量的微气泡在临床环境中（临床试验中曾向个别患者使用过最多三瓶Definity[23],[24]）和研究环境中都非常有益，因为在受控实验中较大批量可以帮助消除批次间的差异。在这项研究中，使用较大试瓶的组织均质机将产量从1 mL提高到了4 mL。微气泡的制备方法与标准小试瓶（1 mL悬浮液）相同，结果发现其大小分布相似，平均直径（变化倍数0.82）和浓度（变化倍数0.96）都与小试瓶生产的微气泡相差在20%以内（见图4A和B，补充表S4）。观察到的大小分布差异可能是由于试瓶和液体柱的几何形状不同，这预期会影响 shaken 期间的流体运动，从而影响微气泡的特性。

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图4. 使用大试瓶（4 mL悬浮液）制备的微气泡与使用标准小试瓶（1 mL悬浮液）制备的微气泡的平均大小分布（A）、浓度（B）和平均直径（C）的标准化结果。

3.5. 超声波响应由于微气泡的大小和结构会影响其动力学特性，因此研究了制造方法对声学响应的影响。通过将三种不同方法制备的微气泡暴露在0.5 MHz中心频率、1%占空比、5 Hz脉冲重复频率的超声波脉冲下（不同峰值负压力），持续2分钟，在10^8个粒子/mL的浓度下测量其声学响应。记录相应的声学发射信号，用于估计每个脉冲的宽带功率和空化时间，空化时间定义为功率超过噪声底限30倍（14.8 dB）的持续时间。如预期，随着峰值负压力的增加，所有样品的声学发射总能量都有所增加，空化时间也相应缩短。在使用不同搅拌方法制备的微气泡之间，无论是空化时间（图5A）还是声学发射能量（图5B）均没有显著差异。两种方法在空化时间上的表现均优于超声波制备的微气泡，显示出更持久的响应，并且空化时间更长：组织均质机的方法比超声波方法分别延长了2.0到2.5倍，Capmix方法则延长了2.7到4倍。每次处理结束后悬浮液均保持光学透明，表明微气泡混合均匀，证实信号消失是由完全溶解而非分层引起的。所有方法在所有驱动压力下的声学发射总能量相似，绝对变化倍数<1.5（相对于超声波方法）。

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图5. 不同方法制备的微气泡对0.5 MHz超声波（1% DC，5 Hz PRF，不同峰值负压力）响应的比较，包括（A）空化时间和（B）声学发射总能量。所有实验中使用的微气泡浓度为10^8个粒子/mL。（C）用于微气泡超声处理的实验装置示意图。

4. 结论在这里，我们比较了不同的磷脂涂层微气泡生产方法。与超声波方法相比，使用搅拌法生产微气泡有两个优势：所需的脂质浓度更低，且不需要将探针放入脂质悬浮液中，从而避免了样品污染。此外，该方法在实验室和临床环境中的实施都更为简单，对工作人员的培训要求低，设备易于使用。目前的牙科汞合金搅拌器由于每次只能生产一个样品、不适合生产大于1 mL的体积以及容易发生机械故障而用途有限。我们的目标是通过使用珠磨机均质机来克服这些限制，这种仪器在研究和临床实验室中都很常见。我们发现，使用这种方法生产的微气泡与使用牙科汞合金搅拌机和超声波方法生产的微气泡在大小分布和浓度上相似。还研究了微气泡壳层的脂质有序程度，发现新方法生产的微气泡脂质有序程度略高于超声波方法，且批次间的变异性低于牙科汞合金搅拌机方法。我们还优化了搅拌频率和时间对微气泡形成的影响，找到了一组参数，能够产生高浓度的微气泡（2 × 10^10个粒子/mL），同时保持临床相关的大小分布（约25%的微气泡直径在1–5 μm范围内）。组织均质机方法的产量成功提高了四倍（从1 mL提高到4 mL），平均直径和浓度变化很小。我们测试了微气泡的超声波响应，发现两种搅拌方法制备的微气泡在空化时间和声学发射能量方面没有显著差异，且两者在空化时间上均优于超声波方法。总之，我们的结果表明，使用组织均质机生产的微气泡具有与临床使用的搅拌机制备的微气泡相当的性能，同时在可扩展性方面具有显著优势。

CRediT作者贡献声明：
Jovana Katrinka Mavrak：撰写——原始草稿，可视化，研究。
Luca Bau：撰写——审阅与编辑，监督，方法学，研究。
Jocelyne Rivera：撰写——审阅与编辑，方法学。
Adam C. Sedgwick：撰写——审阅与编辑，监督。
Eleanor Stride：撰写——审阅与编辑，监督，项目管理，资金获取，概念化。