通过超声辅助提取技术结合天然深共晶溶剂，从红高粱叶片鞘中提取出3-脱氧花青素，并提高了其提取效率及功能性特性

《Ultrasonics Sonochemistry》：Enhanced extraction and functional properties of 3-deoxyanthocyanidins from red sorghum leaf sheaths via ultrasound-assisted extraction with natural deep eutectic solvent

　　奥斯卡·扎努（Oscar Zannou）| 曼苏里·M·托西夫（Mansuri M. Tosif）| 埃利夫·阿伊谢·埃尔杜安·埃卢兹（Elif Ay?e Erdo?an Eliuz）| 古尔登·戈克森（Gulden Goksen）| 雷扎·塔赫尔戈拉比（Reza Tahergorabi）
土耳其梅尔辛塔尔苏斯大学技术科学职业学院食品技术系，梅尔辛塔尔苏斯工业园区，33100

**摘要**
红高粱（Sorghum bicolor L. Moench）的叶鞘是一种植物废弃物，由于含有如芹菜素素苷（APG）和木犀草素素苷（LUT）等生物活性3-脱氧花青素，因此具有稳定的红色。本研究采用超声波辅助提取（UAE）结合天然深共晶溶剂（NADES）的多重优化方法，以最大限度地提取红高粱叶鞘中的3-脱氧花青素。初步实验表明，APG和LUT的含量分别为2.25 ± 0.01–31.59 mg/g和1.36 ± 0.01–30.44 mg/g。在比较不同溶剂组合时，氯化胆碱：乙酸（CHAC）组的提取效果最佳。通过中心复合设计优化NADES组分的组成后，APG和LUT的含量分别提高到39.15 ± 0.58 mg/g和37.89 ± 0.86 mg/g。进一步利用Box-Behnken设计优化提取条件，当提取时间为29.93分钟、振幅为89.86%以及NADES用量为27.95 mL时，APG和LUT的提取量分别达到54.97 ± 0.96 mg/g和48.62 ± 0.44 mg/g。富含3-脱氧花青素的提取物表现出显著的抗氧化活性：ABTS法为1117.07 ± 21.92 μmol TE/g，DPPH法为837.36 ± 16.60 mmol TE/g，FRAP法为5151.03 ± 39.44 mmol ISE/g。与水提取物相比，CHAC提取物具有更高的体外生物利用度、抗糖尿病活性和抗菌性能。

**1. 引言**
红高粱（Sorghum bicolor L. Moench）属于禾本科（Poaceae），在生长阶段比其他主要谷物作物具有更强的抗旱性和耐高温性[1]。红高粱的谷粒是全球广泛使用的粮食作物，可用于制作多种食品，尤其在传统社区中。其不同部位还被用于民间医药、食品着色剂、染料和牲畜饲料。在某些传统文化中，红高粱的叶鞘被加工成面粉，用于制作粥、糕点、汤料、库斯库斯、肉饼、塔津饭和饼干[2]。此外，红高粱的叶鞘还可用于制作热饮或冷饮。尽管红高粱的谷粒被广泛利用，但其叶片等部分却未能得到充分开发。当前的健康、经济、粮食安全和食品安全挑战促使人们寻求减少食品和植物废弃物产生并实现农业废弃物再利用的解决方案，这符合联合国设定的可持续发展目标（SDGs），旨在到2030年解决全球性问题并推动可持续发展。红高粱叶鞘的利用为相关利益方创造更多收入，有助于实现SDGs 1、2和8，即消除一切形式的贫困、减少浪费、防止饥饿和促进经济增长。从红高粱叶鞘中提取生物活性化合物有助于实现SDGs 3、12和13，倡导负责任的消费和生产方式，保护消费者健康和环境。

红高粱叶鞘是3-脱氧花青素的丰富来源。这类花青素的flavylium阳离子脱质子化常数较高，C环上的C-3位置缺乏羟基，使其对pH变化更为稳定。3-脱氧花青素因耐pH变化、耐漂白剂和热处理而受到食品工业的关注[2][3][4][5][6]，同时具有多种健康益处，如抗氧化、抗炎、抗菌、抗糖尿病和抗癌作用[7][8][9][10][11]。研究表明，芹菜素素苷（APG）和木犀草素素苷（LUT）是红高粱叶鞘中的主要3-脱氧花青素[12][13]。传统提取方法（如热辅助提取[3][14]和搅拌辅助提取[9][15][16][17]已被用于提取这些化合物。Santana等人[18]成功应用加压液体萃取法从红高粱谷粒中提取3-脱氧花青素。目前，常用的溶剂包括水、甲醇、乙醇、丙酮和乙醚[9][17][19]。Serrano等人[19]比较了热辅助提取和超声波辅助提取（UAE）在提取3-脱氧花青素方面的效果，发现UAE的效果更佳。不过需优化UAE条件以增强细胞破裂效果、提高传质效率和提取产量。虽然有机溶剂常用于提取3-脱氧花青素[15][17]，但过量使用可能对健康和环境造成危害[20]。因此，应选择绿色可持续的替代溶剂来高效提取这类化合物。天然深共晶溶剂（NADES）是一种高效提取植物活性化合物的环保选项[21][22]，由氢键供体（HBD）和氢键受体（HBA）组成[22]。

**2. 材料与方法**
2.1. 原料与试剂
将红高粱（S. bicolor）的干叶鞘磨碎，通过415微米筛网过滤后置于-20°C下保存以备后续使用。2,2-二苯基-1-吡啶肼（DPPH）和2,2′-偶氮双(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸）（ABTS）购自Sigma Aldrich Chemical Co.（美国密苏里州圣路易斯）。甲醇和乙醇购自Honeywell（美国印第安纳州）。乙酸、乳酸和乙二醇由Carlo Erba（德国埃门丁根）提供。甘油（纯度≥99.5%）购自Kimyalab（土耳其伊斯坦布尔）。氯化胆碱（纯度≥98%）由Aromel Kimya Medikal（土耳其）供应。模拟口腔液（SOF）、模拟胃液（SGF）和模拟肠液（SIF）所用试剂均购自Sigma-Aldrich。胆汁提取物（B8631, 031MO106V）及其他试剂均购自Sigma-Aldrich。所有酶活性测定均按照Brodkorb等人[26]的方法进行预处理。

2.2. 方法
2.2.1. NADES的制备
二元NADES由氯化胆碱（氢键受体）与乳酸、乙酸、甘油、尿素和乙二醇（氢键供体）以1:2摩尔比混合，加热至80°C持续2小时。分别将其称为CHAC、CHGLY、CHUR和CHEGLY。

2.2.2. 超声波辅助提取3-脱氧花青素
提取过程参照Zannou等人的方法[27]稍作调整：将0.5克红高粱叶鞘粉末与20毫升NADES及常规溶剂（蒸馏水、乙醇和甲醇）混合，置于超声波处理器（Sonics and Material, Inc, 美国纽敦）中，设定频率50 Hz、功率750 W、温度25°C、振幅40%，提取时间10分钟。

2.2.3. 3-脱氧花青素的测定
利用UV-5500PC分光光度计（上海元分析有限公司，中国）通过pH差分法测定木犀草素素苷和芹菜素素苷的含量[28][29]：取50微升提取物与2毫升pH 1的醋酸钠缓冲液混合，另取50微升提取物与pH 4.5的醋酸钠缓冲液混合，分别在482 nm和700 nm处测量吸光度。APG和LUT的总含量（mg/g）通过以下公式计算：
`APGorLUT(mg/g) = A × MW × DF × 1000 ∈ × l`
其中A为468/482 nm处的吸光度减去700 nm处的吸光度，pH 1.0；MW分别为APG和LUT的分子量255.24 g/mol和271.24 g/mol；DF为稀释因子；l为光程（cm）；ε分别为APG和LUT的迁移率30.400和31700 L/mol。

2.2.4. NADES组分的优化
采用三水平中心复合设计（Design-Expert软件13.0）优化NADES组分（包括氢键供体乙酸和水分含量）。设计变量包括X1（CHAC摩尔比）和X2（水分含量%），响应变量为APG和LUT。实际值和编码值见表1。

表1. 中心复合设计的独立变量实际值和编码值

**表1. 独立变量的实际值和编码值**
| 编码值 | 实际值 |
| ---- | ---- |
| X1 | 1.5 | 2.0 | 0.9 |
| X2 | 10.0 | 9.8 | 11.5 | 14.5 |
| ... | ... | ... | ... |

组合不同的CHAC和水分含量比例（如1:0.98、1:1.5、1:2.75、1:4.52），生成多个实验点（见表2）。通过方差分析（ANOVA）验证回归模型的统计显著性，并利用p值检验变量间的交互作用。响应变量的二次多项式方程为：
`Y = β0 + ∑i=1kβiXi + ∑i=1kβiiXii + ∑i=1k-1∑i+1kβijXiXj`

**表2. 中心复合设计的实验点和响应值**
| X1（摩尔比） | X2（水分含量%） | LUT (mg/g) | APG (mg/g) |
| ---- | ---- | ---- | ---- |
| 1.5 | 35.8 | 19.5 | 15.3 | 22.7 | 25.1 | 26.4 |
| 2 | 35.8 | 19.5 | 15.3 | 22.7 | 27.5 |
| 3 | 27.5 | 10.0 | 38.0 | 41.2 | 14.4 | 14.5 | 27.2 |
| 4 | 35.8 | 28.4 | 35.8 | 22.4 | 15.1 | 46.7 | 38.4 |

2.2.5. 提取条件的优化
采用三水平Box-Behnken设计（Design Expert软件13.0）的响应面法优化提取参数（时间、振幅和NADES用量）。X1（时间，分钟）、X2（振幅，%）和X3（NADES用量，mL）为自变量，APG和LUT为响应变量。实际值和编码值见表3。

**表3. Box-Behnken设计的独立变量实际值和编码值**
| 编码值 | 实际值 |
| ---- | ---- |
| X1 | 5 | 30 | 10 | 0 | 17.5 | 60 | 25 |
| X2 | 10 | 90 | 40 |
| X3 | 25 | 10 | 30 | 40 | ... |

**2.3. 其他提取方法**
2.3.1. 高速均质辅助提取（HSHAE）
将红高粱叶鞘粉末（0.5克）与20毫升NADES混合，置于高速均质机（HZ1, LABTron, 韩国）中，在室温下以15000转/分钟的速度匀质29.50分钟。

2.3.2. 搅拌辅助提取（SAE）
将红高粱叶鞘粉末（0.5克）与20毫升溶剂混合，用磁力搅拌器（Velp Scientifica, 意大利）以250转/分钟的速度搅拌29.50分钟。

2.3.3. 抗氧化活性测定
DPPH自由基清除活性按Zannou[29]方法测定；ABTS自由基清除活性按Kong[30]方法测定；FRAP活性按Benzie & Strain[31]方法测定。

**2.4. 抗糖尿病活性测定**
采用Perumal[32]方法测定α-淀粉酶抑制活性（稍作修改）。简而言之，粗提物的系列稀释范围为0.1 mg/mL至40 mg/mL。将500 μL的粗提物与600 μL的0.1 M PBS（pH 5）混合，然后加入200 μL的1 U/mL α-淀粉酶（来自Aspergillus oryzae），并在37°C下孵育15分钟。之后，向混合物中加入500 μL的0.25%淀粉，继续在37°C下孵育15分钟。通过加入200 μL的1 M盐酸来停止酶-底物反应，然后再次在75°C的热水浴中孵育5分钟。最后，向混合物中加入500 μL的碘试剂，并在620 nm处读取吸光度。使用DMSO作为阴性对照。为了制备提取物空白组，将500 μL的粗提物与2000 μL的DMSO混合。α-淀粉酶的抑制百分比通过以下公式表示：(6)抑制百分比(%)= ΔAbs(E) - Abs(N) / ΔAbs(E) × 100其中：Abs(N)表示阴性对照的吸光度，ΔAbs(E)表示粗提物和空白组的吸光度差。

2.2.10 抗微生物活性分析
样品的抗微生物活性针对包括单核细胞增生李斯特菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌在内的微生物进行了评估。在测试之前，将细菌菌株接种在胰蛋白酶大豆琼脂（TSA）上，并在37°C下孵育24小时。孵育后，从琼脂平板上挑选出单个分离的菌落进行进一步测试。对于悬浮液的制备，每种微生物的过夜培养物以1:100的稀释比例接种到胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）中。在37°C下振荡条件下孵育，直到达到指数生长阶段。然后将600 nm处的光密度（OD600）调整到0.1–0.2，以标准化微生物浓度。这些标准化的悬浮液随后用于Erdo?an Eliuz [33]描述的纸片扩散试验和细菌生长抑制百分比实验。

纸片扩散法：使用涂布平板技术将标准化的微生物悬浮液均匀地涂布在Mueller-Hinton琼脂（MHA）平板上。将直径为6 mm的无菌滤纸圆片浸入每种测试样品30 μL中，然后小心地放置在接种的琼脂平板表面。使用无菌蒸馏水作为阴性对照，同时准备抗生素圆片（氨苄西林和氟康唑）浓度为125 μg/mL，作为阳性对照。所有平板在37°C下孵育24小时。孵育后，通过测量每个圆片周围的抑制区直径（以毫米为单位）来评估抗微生物活性。所有测试重复三次，结果表示为平均值±标准偏差。

细菌生长抑制百分比实验：使用基于微量稀释的生长抑制试验在96孔ELISA微孔板上进一步评估样品的抗微生物活性。按照前面的方法制备标准化的微生物悬浮液（OD600 = 0.1–0.2）。将每种细菌悬浮液的50 μL体积加入到无菌平底96孔ELISA板的各个孔中。测试样品以定义的浓度（50 μL）加入孔中，并使用胰蛋白酶大豆肉汤（TSB）调节每个孔的最终体积至200 μL（用于细菌）和SDB（Sabouraud葡萄糖肉汤）（用于真菌）。阴性对照是仅含有肉汤的微生物悬浮液（无测试样品）。微孔板用无菌盖子覆盖，在37°C下孵育24小时。孵育后，通过使用微孔板分光光度计测量600 nm处的光密度（OD600）来量化细菌生长。

细菌生长抑制百分比使用以下公式计算：(6)生长抑制百分比% = (OD样本 - OD对照) / OD对照 × 100其中：• OD样本 = 测试提取物的吸光度 • OD对照 = 无提取物的阴性对照的吸光度

结果表示为三次独立测量的平均值±标准偏差。

2.2.11 3-脱氧花青素的体外生物可利用性测定
富含3-脱氧花青素的提取物使用Brodkorb等人[26]和[34]开发的INFOGEST协议进行体外消化。消化过程包括口腔阶段、胃阶段和肠道阶段。在口腔阶段，将提取物放入50 mL的离心管中，然后加入模拟唾液液和根据协议计算量的CaCl2溶液（0.3 M）。将块茎放入旋转器中，在37°C下以150 rpm的速度搅拌2分钟。在胃阶段，将模拟胃液与口腔消化物（1:1 v/v）混合，并使用HCl（1 M）调整pH值至3，然后加入猪胃蛋白酶（2000 U/mL）。然后将试管放入旋转器中，在37°C下搅拌120分钟。之后，在肠道阶段，将胃消化物溶解在模拟肠道液（1:1, v/v）中，并加入CaCl2溶液和胆盐（最终浓度为10 μM），并用NaOH（0.1 M）调整pH值至7.0。然后，将胰酶（100 U/mL）与肠道阶段混合。将试管放入旋转器中，在37°C下搅拌120分钟。使用特定酶抑制剂（Pefabloc?，Sigma Aldrich）停止消化，并使用液氮快速冷冻样品。体外生物可利用性百分比使用以下公式获得：(7)生物可利用性(%) = 未消化提取物中的花青素含量 / 消化后提取物中的花青素含量 × 100

2.2.12 热稳定性测试
将5 mL的水性或NADES提取物放入密封的玻璃管中，在60、80和100°C下分别保持60分钟和120分钟。在每个温度和时间设置后，立即冷却提取物，并测定APG和LUT的含量。降解的一阶动力学模型使用以下公式计算：(8)ln(C0/t) = -k·t。其中；C0是初始含量（t=0）；C是时间t时的含量；t是时间（分钟）；k表示降解速率常数（min^-1）。半衰期（t1/2）使用降解速率常数通过以下公式计算：(9)t1/2 = -ln(0.5)·k·Ea / (R·ln(k·k0)^(1/T)。ΔG = -R·T·ln(k·HB)·T(10)·ΔH = Ea - (R·T)·(ΔH/ΔS)。在这些公式中，Ea是活化能（kJ/mol）；R是通用气体常数（8.314 J/mol·K）；T是绝对温度（K）。使用降解速率常数和活化能（Ea）计算降解的热力学参数，如Gibbs自由能（ΔG）（kJ/mol）、焓（ΔH）和活化熵（ΔS）（kJ·mol·K^-1）。

2.3 统计分析
所有结果表示为三次重复实验的平均值±标准偏差。采用Duncan的多范围检验进行单因素方差分析（ANOVA），p<0.05的差异被视为统计学上显著。

3. 结果与讨论
3.1 溶剂的选取
研究了NADESs从红高粱叶鞘中提取色素3-脱氧花青素（APG和LUT）的能力，并与常规溶剂进行了比较。所研究的NADESs包括CHAC、CHGLY、CHUR和CHEGLY，而常规溶剂包括蒸馏水、甲醇和乙醇。色素的提取是通过超声辅助提取（UAE）进行的，结果如图1所示。可以看出，溶剂类型对APG和LUT的提取有显著影响（p<0.05）。APG和LUT的含量分别在2.25±0.01–31.59±0.09 mg/g和1.36±0.01–30.44±0.11 mg/g的范围内。先前的一项研究报告了红高粱叶鞘中APG的含量为31.30 mg/g，而LUT的含量较低，为1.20 mg/g [9]。Petti等人[35]报告了红高粱叶鞘中APG和LUT的含量较低，分别为0.421 mg/g和1.768 mg/g。红高粱叶鞘中3-脱氧花青素含量的这些变化是由于原材料的来源和提取条件的不同所致。

在目前的研究中，CHAC的3-脱氧花青素含量最高（APG = 31.59±0.09 mg/g，LUT = 30.44±0.11 mg/g），其次是甲醇、乙醇、CHEGLY和CHUR。类似地，在先前的研究中，酸化或水溶性甲醇提取物也被发现含有高量的3-脱氧花青素 [9]，[35]。然而，在目前的研究中，CHAC显示出对APG和LUT的强亲和力。据报道，CHAC在提取花青素和甜菜素等色素方面具有很强的能力 [36]，[37]。CHAC能够高效提取色素是因为其具有强大的分子内结构。此外，CHAC中存在的多个氢键结合位点与3-脱氧花青素产生了强烈的相互作用，从而促进了它们的提取。同样，NADESs与酚类化合物及色素之间的现象也有类似报道 [37]，[38]，[39]。此外，CHAC的低pH值（pH≈2）促进了从红高粱叶鞘中提取APG和LUT。因此，选择CHAC进行进一步研究。

3.2 CHAC组分的优化
3.2.1 模型拟合
NADES中的摩尔比和水含量是影响其提取生物活性化合物效率的关键因素 [40]，[41]。在本研究中，优化了CHAC的摩尔比和水含量，以确定适合从红高粱叶鞘中最大程度提取APG和LUT的CHAC组成。中心复合设计的数据表明，APG和LUT的含量分别为15.34–41.29 mg/g和19.58–38.00 mg/g。最低的APG和LUT含量出现在运行1（摩尔比1:1.5和含水量35.80%）时，而最高的含量出现在运行3（摩尔比1:2.75和含水量10.09%）时。由于CHAC具有亲水性和低粘度 [37]，[41]，它能够高效提取APG和LUT，且所需的水量较少。ANOVA结果显示p<0.0001，拟合度不显著（p>0.05），R2和调整后的R2约为0.99（表5），表明实验值和预测值高度相关，模型拟合良好。此外，模型的系数变异百分比范围为1.66%至1.97%，表明具有良好的再现性和可靠性。

表5. NADES组分优化的ANOVA结果
来源 LUT APG
平方和 F值 p值 平方和 F值 p值
模型 294.04 28 1.21 < 0.0001
X1-摩尔比 0.12 87 0.61 56 0.46 82 2.26 < 0.0001
X2-含水量 140.09 66 9.86 < 0.0001
X1×X2 83.77 40 0.55 < 0.0001
X1 15.22 72 72 0.00 44 52 0.001
X2 235.17 16 8.17 < 0.0001
17.22 61 46 0.00 5 18 1.53 < 0.0001
残差 1.05 1.40 0.48 53 0.57 74 0.68
总残差 1.05 1.40 0.57 30 0.32 80 0.19
纯误差 0.56 0.31 0.89 0.10 81 0.89
C.V. % 55.34 65.72 88 1.66 1.97

3.2.2 摩尔比和含水量对APG和LUT的影响
线性项、交互项和二次项对APG有显著影响（p<0.0001–0.0011），除了摩尔比的线性项（X1；p=4.290）（表5）。APG模型的回归系数显示，APG受到交互项X1X2和二次项X2X2的更大影响（方程（13）。（13）APG = 26.70 - 0.16×X1 - 7.89×X2 + 3.57×X1×X2 - 1.49×X1^2 + 1.75×X2^2。线性项、交互项和二次项对LUT也有显著影响（p<0.0001–0.0004），除了摩尔比的线性项（X1；p=4.4682）（表5）。LUT模型的回归系数显示，LUT受到交互项X1X2和二次项X2X2的更大影响（方程（14）。（14）LUT = 26.99 - 0.13×X1 - 4.18×X2 + 4.58×X1×X2 - 1.64×X1^2 + 2.50×X2^2）。如图2所示，水含量和摩尔比的组合对APG和LUT有显著影响，这种效果在水含量增加到14.50%时最为显著，且随着摩尔比的增加而增强。摩尔比的增加促进了H键供体的有效性，有利于CHAC和色素之间形成更强的氢键网络。类似的现象也在其他研究中报道过，其中摩尔比的增加促进了生物活性化合物在NADESs中的溶解，提高了提取收率 [42]，[43]，[44]。

3.2.3 CHAC组分的优化验证
通过考虑目标函数来确定CHAC组分的最佳条件，在该函数中保持自变量在指定范围内并最大化响应。预测的CHAC最佳条件为摩尔比1:1.5和含水量14.50%，得到APG和LUT的含量分别为38.58 mg/g和36.73 mg/g。在这些条件下进行了进一步实验，结果分别为39.15±0.58 mg/g和37.89±0.86 mg/g。这些预测值和实验值接近，证实了优化过程的可靠性。我们的结果得到了先前研究的支持，该研究报道APG的最高含量为45.8 mg/g [9]。

3.3 提取条件的优化
3.3.1 开发模型的分析
使用Box-Behnken设计优化了提取条件，考虑了提取时间、振幅和NADES含量等因素，以充分从红高粱叶鞘中回收APG和LUT。结果表明，APG和LUT的含量分别为2.55–52.38 mg/g和2.15–43.16 mg/g。APG的最低值出现在第5次实验中（提取时间为17.5分钟，振幅为90%，NADES含量为10毫升），而最高值出现在第7次实验中（提取时间为30分钟，振幅为90%，NADES含量为25毫升）。对于LUT，最低值出现在第6次实验中（提取时间为30分钟，振幅为30%，NADES含量为25毫升），最高值同样出现在第7次实验中（提取时间为30分钟，振幅为90%，NADES含量为25毫升）。这些发现表明，提取条件对APG和LUT的影响各不相同。类似地，先前的研究也报告了这些因素会影响花青素和甜菜红的个别成分[36][45]。ANOVA模型的结果显示出p值<0.0001，并且拟合优度为1.29，表明模型是显著的。此外，R2和调整后的R2值均高于0.98（表6），表明实验值和预测值之间有高度相关性，且模型拟合效果良好。

表6. 提取条件优化的ANOVA结果。

来源
平方和 F值 p值
平方和 F值 p值
Model 2283.98 2402.73 < 0.0001
2501.05 145.06 < 0.0001
X1-时间 1.93 18.29 0.0079 69.25 36.15 0.0018
X2-振幅 2.87 27.14 0.0034 18.15 9.47 0.0275
X3-NADES含量 0.17 571.66 0.2536 702.20 366.55 < 0.0001
X1X2 156 2.30 1479 1.74 < 0.0001
274.38 143.23 < 0.0001
X1X3 323.10 3059.08 < 0.0001
75.05 39.18 0.0015
X2X3 155.77 1474.85 < 0.0001
87.90 45.89 0.0011
X12 220 1.24 1905.32 < 0.0001
140.23 73.20 0.0004
X22 8.92 84.43 0.0003
35.39 18.47 0.0077
X32 27.38 259.28 < 0.0001
1013.64 529.12 < 0.0001
残差 0.52 819.58
拟合欠佳 0.3479 1.29 0.4653
7.38 2.24 0.3236
纯误差 0.18 022.20
总合 2284.50 2510.62

3. APG和LUT的提取效果
所建立模型的线性、交互项和二次项对APG有显著影响（p值<0.0001–0.0077）（表6）。回归系数显示，APG受到X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X1X1和X2X2的正面影响，而X3X3项具有负面影响（公式15）。
(15) APG = 29.11 + 2.94X1 + 1.51X2 + 9.37X3 + 8.28X1X2 + 4.33X1X3 + 4.69X2X3 + 6.16X12 + 3.10X22 - 16.57X32

线性、交互项和二次项对LUT也有显著影响（p值<0.0001–0.0079），NADES含量的线性项除外（X3；p值=0.2536）（表6）。LUT模型的回归系数显示，X1、X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3和X2X2项有正面影响，而X1X1和X3X3项具有负面影响（公式（16）。
(16) LUT = 27.95 + 0.49X1 + 0.60X2 + 0.15X3 + 19.76X1X2 + 8.99X1X3 + 6.24X2X3 - 7.38X12 + 1.55X22 - 2.72X32

独立变量的交互效应在图中显示……可以看到，提取时间和振幅的组合对APG和LUT有显著影响，振幅呈现出连续效应，而提取时间在10–15分钟达到峰值后开始下降。提取时间和NADES含量的交互作用对APG和LUT都是正向且连续的，尽管NADES含量的影响更为明显（图3）。同样，振幅和NADES含量的组合也持续促进了APG和LUT的提取（图3）。我们的结果与先前的研究一致，这些研究表明提取时间、超声波振幅和NADES含量显著影响了从各种原材料中提取生物活性化合物的效果[46][47][48]。

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3.3. 提取条件优化的验证
基于满意度函数，并保持独立变量在合理范围内并最大化响应，预测的最佳条件分别为提取时间29.93分钟、振幅89.86%和NADES含量27.95毫升。在这些条件下，预测的APG和LUT含量分别为53.87 mg/g和45.74 mg/g。为了验证这些条件，进一步进行了分析，结果分别为54.97 ± 0.96 mg/g和48.62 ± 0.44 mg/g。预测值与实验值相似，证实了优化过程的可靠性。

3.4. 提取方法的比较
使用CHAC和UAE获得的最佳提取条件与高速均质辅助提取（HSHAE）和搅拌辅助提取（SAE）技术进行了比较，以确定提取APG和LUT的最有效方法。不同提取技术的结果如图4所示。可以看出，不同的提取方法对APG和LUT的提取有显著影响（p值<0.05）（图4）。UAE的APG和LUT含量分别为54.97 ± 0.96 mg/g和48.62 ± 0.44 mg/g，HSHAE分别为50.53 ± 0.41 mg/g和43.80 ± 0.35 mg/g，SAE分别为47.52 ± 0.48 mg/g和41.65 ± 0.59 mg/g。对于APG和LUT，UAE的提取效果最好，其次是HSHAE和SAE。此外，先前的研究发现，UAE结合NADESs对从橄榄渣中提取生物活性化合物非常有效[49]。此外，UAE和均质辅助提取还显示出从金克利巴（Kinkeliba）中高效提取酚类化合物[50]和从苏木（sumac）中提取花青素的效果[51]。UAE提取性能的提高与声空化现象及其产生的气泡有关，这些气泡会破坏细胞壁[49][51]。空化现象还导致样品孔隙膨胀和增大，从而便于溶剂渗透，提高提取效率[52]。HSHAE通过高速电机驱动的旋转内切割器产生强大的剪切力，破坏细胞壁并将固体材料与溶剂混合[49]，这促进了溶质和溶剂之间的传质，提高了提取效率。

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3.5. 3-脱氧花青素富集提取物的抗氧化活性
使用ABTS、DPPH和FRAP法测定了通过UAE、HSHAE和SAE获得的3-脱氧花青素富集提取物的抗氧化活性（表7A）。可以看出，不同的提取方法对红高粱叶鞘中3-脱氧花青素富集提取物的抗氧化活性有显著影响（p值<0.05）。UAE的抗氧化活性最高，ABTS法为1117.07 ± 21.92 μmol TE/g，DPPH法为837.36 ± 16.60 μmol TE/g，FRAP法为5151.03 ± 39.44 μmol ISE/g。其次是HSHAE，ABTS法为892.36 ± 16.44 μmol TE/g，DPPH法为829.06 ± 8.30 μmol TE/g，FRAP法为4667.87 ± 29.58 μmol TE/g。SAE提取物的抗氧化活性最低，ABTS法为744.38 ± 10.96 μmol TE/g，DPPH法为746.07 ± 8.30 μmol TE/g，FRAP法为4658.01 ± 19.72 μmol IE/g。与我们的结果相反，先前的研究报道红高粱叶鞘的酒精或水提取物抗氧化活性较低[9][53]。Kayodé等人[9]发现红高粱叶鞘的抗氧化活性为3.76–5.58 mmol/g（ABTS法）和0.35–1.06 mmol/g（FRAP法）。Tugli等人[53]发现红高粱叶鞘的抗氧化活性范围为0.957–2.452 mmol/g（FRAP法）。本文中的较高值可能与使用了NADES有关，这不仅提高了APG和LUT的提取量，还提高了其他抗氧化化合物的提取量。此外，新兴提取技术如UAE、HSHAE和SAE有助于从红高粱叶鞘中提取色素，并提高了抗氧化活性[37][54][55][56]。

表7. 3-脱氧花青素富集提取物的抗氧化活性；不同细菌菌株的抑制圈直径（mm）；从红高粱叶鞘中提取的LUT和APG的体外生物可利用性。

表7B
提取方法 抗氧化活性
ABTS (μmol TE/g) DPPH (mmol TE/g) FRAP (mmol ISE/g)
UAE 1117.07 ± 21.92a 837.36 ± 16.60a 5151.03 ± 39.44a
HSHAE 892.36 ± 16.44b 829.06 ± 8.30a 4667.87 ± 29.58b
SAE 744.38 ± 10.96c 746.07 ± 8.30c 4658.01 ± 19.72b

表7C
细菌 抑制圈直径（mm）
CHAC提取物 水提取物
L. monocytogenes 96.32 ± 0.31a 38.27 ± 0.27e
S. aureus 92.16 ± 0.84b 35.47 ± 0.30f
P. aeruginosa 80.37 ± 0.30d 26.24 ± 0.20g
E. coli 82.45 ± 0.20c 21.75 ± 0.10h

表7
溶剂 相位 LUT APG
含量（mg/g） 生物可利用性（%）
蒸馏水 口服 0.46 ± 0.02d 5.79 ± 0.22d 0.61 ± 0.01d 7.61 ± 0.11d
胃 0.30 ± 0.00d 3.78 ± 0.00e 4.61 ± 0.11e
肠 0.16 ± 0.00e 2.00 ± 0.00f 0.15 ± 0.01f
CHAC 口服 37.35 ± 0.08ba 76.83 ± 0.16a 38.56 ± 0.04a 70.15 ± 0.08a
胃 17.89 ± 0.05b 36.80 ± 0.11b 17.80 ± 0.15b 32.38 ± 0.28b
肠 17.34 ± 0.22c 35.66 ± 0.45c 17.26 ± 0.03c

表7
溶剂 相位 LUT APG
含量（mg/g） 生物可利用性（%）
蒸馏水 口服 0.46 ± 0.02d 5.79 ± 0.22d 0.61 ± 0.01d 7.61 ± 0.11d
胃 0.30 ± 0.00d 3.78 ± 0.00e 0.37 ± 0.01de 4.61 ± 0.11e
肠 0.16 ± 0.00e 2.00 ± 0.00f 1.82 ± 0.11f

3.6. 3-脱氧花青素富集提取物的抗菌活性
使用CHAC和UAE从红高粱叶鞘获得的3-脱氧花青素富集提取物的抗菌活性进行了评估，并与相同条件下的水提取物进行了比较。3-脱氧花青素富集提取物对食品工业中四种感兴趣的细菌（包括L. monocytogenes（革兰氏阳性）、S. aureus（革兰氏阳性）、P. aeruginosa（革兰氏阳性）和E. coli（革兰氏阴性）表现出抗菌效果（表7B和图5）。CHAC提取物对L. monocytogenes、S. aureus、P. aeruginosa和E. coli的抗菌效果最强，抑制圈直径分别为96.32 ± 0.31、92.16 ± 0.84、80.37 ± 0.30和82.45 ± 0.20。而水提取物的抗菌效果最弱。这些结果表明，3-脱氧花青素富集提取物对测试的病原微生物具有抗菌作用，其中NADES提取物的抗菌效果最强。最近的研究表明，NADES不仅可以调节溶剂的物理化学性质，还可以提高溶解活性化合物的抗菌活性[57][58][59]。本研究总结了3-脱氧花青素富集提取物的抑制百分比（图5）。可以看出，CHAC提取物对L. monocytogenes、S. aureus和E. coli的抑制百分比最高，分别为94.98 ± 1.29%、93.88 ± 2.63%、85.01 ± 3.29%和81.80 ± 2.73%。相比之下，水提取物对所有测试微生物的抑制百分比较低。这些结果表明，从红高粱叶鞘中提取的3-脱氧花青素富集提取物，特别是NADES提取物，对L. monocytogenes、S. aureus和E. coli具有强烈的抗菌效果。

3.7. 从红高粱叶鞘中提取的APG和LUT的生物可利用性
评估了在最佳条件下获得的CHAC提取物中APG和LUT的生物可利用性，并将结果与相同条件下的水提取物进行了比较。生物可利用性考虑了口腔、胃和肠三个消化阶段，结果总结在表7C中。在水提取物中，LUT的浓度从口腔阶段的7.88 ± 0.13 mg/g下降到胃阶段的0.46 ± 0.02 mg/g，再下降到肠阶段的0.16 ± 0.00 mg/g；APG的浓度从口腔阶段的8.03 ± 0.13 mg/g下降到胃阶段的0.61 ± 0.01 mg/g，再下降到肠阶段的0.15 ± 0.01 mg/g。对于CHAC提取物，LUT的浓度从口腔阶段的48.62 ± 0.44 mg/g下降到胃阶段的37.35 ± 0.08 mg/g，再下降到肠阶段的17.89 ± 0.05 mg/g；APG的浓度从口腔阶段的54.97 ± 0.96 mg/g下降到胃阶段的38.56 ±在胃相中，LUT和APG在水提取物中的生物可利用性分别为3.78±0.00%和4.61±0.11%，而在CHAC提取物中分别为36.80±0.11%和32.38±0.28%。与口腔相类似，LUT和APG在胃环境中的生物可利用性显著受到溶剂类型的影响，其中CHAC的生物可利用性最高。与本研究的结果相似，在之前的一项研究中，从NADES中提取的花青素的生物利用性分别为：氰苷-3-葡萄糖苷24.95–33.54%，氰苷-3-芸香糖苷29.17–33.54%，pelargonidin-3-葡萄糖苷10.71–26.89%，以及氰苷氯化物34.16–42.05%[11]。最后，在肠道环境中，LUT和APG在水提取物中的生物可利用性分别为2.00±0.00%和1.82±0.11%，而在CHAC提取物中分别为35.66±0.45%和31.41±0.06%。与水提取物相比，CHAC提供了更高的LUT和APG生物可利用性。与我们发现的结果类似，使用NADES从黑莓果实中提取的氰苷-3-芸香糖苷在肠道环境中的生物可利用性也为26.06–33.56%[13]。此外，使用NADES从Jussara果肉中提取的花青素的生物可利用性在肠道相中报告为30.80%[61]。本研究首次评估了从红高粱叶鞘中提取的LUT和APG的生物可利用性，将我们的结果与之前发表的关于花青素的数据进行比较后可以认为，使用NADES获得的LUT和APG的生物可利用性是高且可接受的。在本研究中，发现3-脱氧花青素在CHAC中的生物可利用性高于在蒸馏水中的生物可利用性，这表明高粱叶鞘中的3-脱氧花青素在NADES中更加稳定且易于提取。先前的研究也表明，NADES介质能够提供强的稳定作用并提高花青素的生物可利用性[13, 27]。此外，3-脱氧花青素在NADES中的高溶解度可能有助于提高其生物可利用性[27]。古尔登·戈克森（Gulden Goksen）：写作（包括审稿与编辑）、数据可视化、数据验证、项目管理、方法论研究、问题调查、资金筹措、正式数据分析、数据整理以及概念化工作。雷扎·塔赫尔戈拉比（Reza Tahergorabi）：同样负责写作（审稿与编辑）、数据可视化、数据验证、项目管理、方法论研究以及资金筹措。