超声波与酶法提取Pleioblastus amarus嫩枝多糖：对其化学性质、抗氧化活性及抗衰老作用的比较研究

《Ultrasonics Sonochemistry》：Ultrasound and enzyme extraction of Pleioblastus amarus shoot polysaccharide: A comparative study on chemical characterization, antioxidant, and anti-aging activities

　　韩瑞清|顾毅|徐一鸣|吴思宇|李文山|南世波|邹元峰
四川农业大学兽医学院天然药物研究中心，中国四川省成都市惠民路211号，邮编611130

**摘要**
Pleioblastus amarus的嫩芽是大熊猫的重要食物来源，同时也是一种传统的抗衰老药物资源，其活性成分主要为多糖。本研究采用五种不同的提取方法（热水提取、超声波提取、酶提取以及超声波-酶联合作用提取）提取多糖，并系统地探讨了不同提取方法对多糖产量、结构特性和生物活性的影响。研究发现，超声波-酶联合作用提取方法具有最优的抗氧化性能，随后通过体内实验验证了其抗衰老效果。结果表明，尽管这五种多糖的单糖组成和三螺旋结构相似，但超声波-酶联合作用提取方法获得了最高的产量（4.73%）和最低的分子量，同时在清除DPPH、ABTS和羟基自由基方面表现出最强的能力，并对IPEC-J2细胞具有显著的抗H2O2氧化损伤保护作用。因此选择超声波-酶联合作用提取方法，在D-半乳糖诱导的老化小鼠模型中验证了其抗衰老作用。该方法恢复了1）认知功能（Morris水迷宫测试）、2）海马区形态（H&E染色）以及3）抗氧化酶活性（CAT、SOD、GSH-Px）和MDA水平，证实了其强大的抗衰老生物活性。总体而言，本研究表明超声波-酶联合作用提取方法显著提高了多糖的产量和抗氧化活性，为进一步研究P. amarus多糖在功能食品和营养应用中的抗衰老潜力提供了有价值的数据参考。

**1. 引言**
衰老是一个复杂的、多因素的生物过程，其特征是生理功能逐渐下降和体内稳态平衡的破坏[1]。这一过程的主要驱动因素是慢性低度氧化应激[2]，而与年龄无关。衰老相关的氧化应激主要源于线粒体功能障碍，导致活性氧（ROS）的过度积累。ROS会引发脂质过氧化，破坏氧化还原平衡，并促进细胞衰老标志物的产生，从而加剧与年龄相关的组织损伤[3]。

Pleioblastus amarus是中国南部广泛分布的竹子品种，是大熊猫的主要食物来源，因其口感脆嫩和高营养价值也深受当地居民喜爱。此外，这种竹子还被用于传统医学中预防衰老[4]。先前的研究表明，P. amarus嫩芽富含多糖、多酚和生物碱[5] [6]，最近的研究表明其嫩芽壳中的多糖具有优异的抗癌活性[7]。同时，Phyllostachys edulis和Chimonobambusa quadrangularis等竹子品种的多糖也被证实具有抗氧化效果[8] [9]。然而，P. amarus嫩芽的抗氧化和抗衰老作用及其作用机制和成分-活性关系尚未完全阐明。

提取方法（如热水提取[10]、超声波提取[11]、酶提取[12]、酸碱提取[13]、微波辅助提取[14]、深共晶溶剂提取[15] [16]）会显著改变多糖的性质，包括分子量和单糖组成，从而影响其治疗潜力[17]。传统的热水提取方法应用最广泛，但存在产量低、能耗高和处理时间长的缺点[18]。相比之下，超声波提取利用空化效应破坏细胞壁，增强溶剂渗透性，促进多糖释放；该方法通过产生微气泡产生极端条件（温度可达约5000 K，压力达约1000 bar），从而提高提取效率、缩短处理时间并增强生物活性[19]。酶提取通常使用纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶，能提高产量并保持多糖的结构完整性[20]：纤维素酶分解纤维素骨架，木瓜蛋白酶破坏多糖-蛋白质复合物并去除蛋白质杂质，果胶酶降解果胶，改善物质传递性能[21] [22] [23]。这些酶协同作用促进多糖释放，从而提高提取效率。超声波和酶联合作用提取作为一种新型提取方法，能有效结合超声波空化和酶水解作用，破坏细胞壁，提高多糖产量、降低分子量并增强生物活性[23]。Song等人证明该方法在荔枝籽多糖提取中优于传统热水提取方法[23]。然而，虽然低功率超声波可以激活酶活性，但长时间高强度的超声波处理会产生大量自由基并破坏酶的结构完整性[24] [25]。Szabo和Csiszar（2013）观察到在43.4 W的超声波强度下纤维素酶活性下降了25%[26]。因此，尽管高功率超声波能更彻底地破坏细胞壁，但过高的超声波强度会降低酶活性[21]。因此，超声波和酶提取的顺序结合可以充分发挥两者的优势[27]。先前研究采用了多种处理顺序：例如，使用超声波提取后进行酶处理提取Gastrodia elata和Saposhnikovia divaricate的多糖[28] [29]；而从沙棘和蒲公英属植物中提取多糖时，先进行酶水解再使用超声波提取[30] [31]；也有研究探讨了酶处理和超声波处理顺序对燕麦蛋白凝胶强度和果胶酶活性的影响[32] [33]。然而，关于提取顺序对多糖产量和生物活性的影响及其作用机制的系统理解仍不充分。

本研究从宜宾市收集了Pleioblastus amarus嫩芽，旨在：1）比较热水提取、超声波提取、酶提取、超声波-酶联合作用提取及酶-超声波联合作用提取所得多糖的产量、化学组成、分子量、单糖组成和三螺旋结构；2）通过自由基清除实验和细胞实验比较五种多糖的抗氧化活性；3）利用抗氧化活性最佳的提取方法处理的小鼠模型（D-半乳糖诱导老化模型）评估其抗衰老效果，并通过Morris水迷宫测试、海马区H&E染色和抗氧化酶测定进行验证。这项研究将深入探讨不同提取方法（尤其是超声波和酶联合作用提取）的作用机制，并为P. amarus嫩芽多糖在抗衰老功能食品和营养应用中的潜力提供有用数据。

**2. 材料与方法**
2.1. **P. amarus嫩芽的预处理**
P. amarus嫩芽样品来自中国四川省宜宾市，经过清洗后于60°C下干燥成细粉，再与96%乙醇按1:20（w/v）的比例混合并在70°C下孵育2小时，过滤后的残渣干燥后密封保存。
2.2. **竹笋多糖（BSPs）的提取方法**
采用以下五种方法提取BSPs：
- **热水提取法**：将预处理后的粉末与蒸馏水（1:20 g/ml）混合，在沸水浴中提取90分钟[3]。
- **超声波提取法**：将预处理后的粉末与蒸馏水（1:20 g/mL）混合，使用超声处理器（40 kHz；KH-300DE，昆山和畅）进行提取，超声功率保持在300 W，提取温度和时间为50°C和90分钟[25] [34]。
- **酶提取法**：将预处理后的粉末与蒸馏水（1:20 g/mL）混合，然后加入1%的复合酶混合物（纤维素酶50 U/mg、木瓜蛋白酶800 U/mg、果胶酶50 U/mg，比例1:1:1），调节pH至5.0。所有酶均购自上海远业生物技术有限公司（上海）。在50°C下提取90分钟，随后迅速升温至100°C处理15分钟以终止酶活性[25] [34]。
- **酶-超声波联合提取法**：首先进行酶提取60分钟，然后将混合物加热至100°C处理15分钟以失活酶，之后再进行30分钟的超声波提取[25] [34]。
- **超声波-酶联合提取法**：首先进行30分钟的超声波提取，随后进行60分钟的酶提取，最后迅速升温至100°C处理15分钟以终止酶活性[25] [34]。
提取后的混合物离心浓缩，与四倍体积的绝对乙醇混合后置于4°C下静置12小时。再次离心（5,500 rpm，15分钟）后弃去上清液，沉淀物重新溶解于水中。水溶液通过Sevag法脱蛋白，然后用去离子水透析，最后冻干。所得粗多糖分别命名为HW-BSP、U-BSP、E-BSP、UE-BSP、EU-BSP。产量计算公式如下：
$$\text{多糖产量}% = \frac{\text{干燥多糖重量}}{\text{预处理粉末重量}} \times 100\%$$
2.3. **多糖的纯化**
粗提物通过阴离子交换色谱法纯化，色谱柱为DEAE-Sepharose Fast Flow。低产量的中性组分被洗脱出来，均匀的酸性组分被收集。洗脱曲线见图S2。五种酸性多糖分别命名为HWA-BSP、UA-BSP、EA-BSP、UE-BSP、EU-BSP。
2.4. **BSPs的组分与表征**
- **糖、蛋白质和多酚分析**：糖含量采用酚-硫酸法测定；蛋白质和多酚含量分别采用Coomassie Brilliant Blue（Bradford）法和Folin-Ciocalteu法测定[35]。
- **FT-IR和UV–Vis光谱**：将3 mg的BSPs与一定量的干KBr混合，使用傅里叶变换红外光谱仪（FT-IR）记录光谱（范围500–4000 cm?1）。每种酸性多糖样品溶解于水后，在200–400 nm波长范围内进行UV–Vis扫描。
- **Congo红测试**：用于表征BSPs的三螺旋构象[17]。将BSPs溶解在不同浓度的氢氧化钠（0.0, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 mol/L）中，直至浓度达到1.6 mg/L，与1 mL的Congo红试剂（80 μmol/L）反应5分钟。
- **分子量分析**：采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定分子量特性。色谱柱为Waters Ultra hydrogel Linear，使用已知分子量的聚糊精标准品进行校准。流动相为0.1 M NaNO?水溶液，流速为1.0 mL/min，柱温为35°C，进样量为20.00 μL[36]。
- **单糖组成**：BSPs用三氟乙酸水解并衍生化，然后用Waters 2695 HPLC系统（配备Waters 2996 UV detector）进行分析，流动相为磷酸盐缓冲液和乙腈（83:17，v/v），流速为1.0 mL/min，柱温为30°C，检测波长为254 nm[37]。
- **表面形态分析**：使用扫描电子显微镜观察BSPs的表面形态。样品粉末喷镀一层铂以确保导电性。
2.5. **抗氧化活性**
- **DPPH自由基清除能力**：将100 μL新鲜配制的DPPH乙醇溶液（0.2 mmol/L）与不同浓度的BSP溶液混合，测量517 nm处的吸光度。清除效率根据以下公式计算：
$$\text{清除效率} = \frac{(\text{混合物吸光度} - \text{空白溶液吸光度})}{\text{DPPH溶液吸光度}}$$
- **ABTS自由基清除能力**：将3 mmol/L ABTS和2.45 mmol/L过硫酸钾混合，与30 μL多糖溶液反应。记录各混合物在734 nm处的吸光度，清除效率根据公式计算。**羟基自由基清除活性**
为了评估羟基自由基的清除能力，将五种不同浓度的多糖样品与等体积的6 mM FeSO4、6 mM水杨酸（溶于乙醇中）和6 mM H2O2混合。在510 nm处测量吸光度[38]。

**2.5.4. 在H2O2刺激下IPEC-J2细胞中的抗氧化活性检测**
将猪肠上皮细胞（IPEC-J2）以每孔5×10^3个细胞的密度接种在96孔板中，并在37°C、5% CO2的条件下培养。细胞与0.2 mmol/L的H2O2共同孵育24小时，随后再与BSPs（最终浓度为200 μg/mL）处理24小时。随后使用CCK-8检测法定量细胞活力。在450 nm处测量吸光度，并按照以下公式计算活力：
(公式内容因缺失而省略)

**2.6. 动物和实验设计**
4只C57BL/6雄性小鼠（体重19 ± 1克，8周龄）被随机分为六组（每组10只），包括：对照组、D-半乳糖组、维生素C组（100 mg/kg）和三个UEA-BSP处理组（剂量分别为50、100和200 mg/kg/天）。
为了建立加速衰老模型，模型组、维生素C组和多糖组的小鼠每天注射D-半乳糖（400 mg/kg），持续6周；对照组则注射等体积的生理盐水。在42天的实验期间每周记录一次体重。

**2.6.1. Morris水迷宫测试**
通过Morris水迷宫（MWM）任务评估空间学习和记忆能力。实验在深度为35厘米的泳池中进行，水面下1厘米处设有平台，位于东北象限。小鼠每天进行四次导航尝试，从不同象限释放以寻找隐藏的平台。未能在90秒内到达目标平台的小鼠会被手动引导至平台并停留30秒；这种情况下记录为90秒的逃避潜伏期。相反，成功在指定时间内找到平台的小鼠可以停留10秒。第5天移除平台，进行空间探测测试。小鼠从西南象限引入，并监测90秒内的行为，期间记录游泳轨迹、进入先前平台区域的频率以及在目标象限停留的时间。

**2.6.2. 组织病理学分析**
海马组织用10%甲醛固定，脱水后包埋、切片，并用H&E染色。

**2.6.3. 生化分析**
所有小鼠均被处死进行生化分析。收集血液、脑和肝脏样本，使用商业试剂盒量化超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性，以及丙二醛（MDA）的水平。

**2.7. 统计分析**
对于细胞实验和体内实验，每组使用n = 10个样本作为生物学重复值；抗氧化酶和AChE活性检测则从每组中随机选择6个样本。其他体外实验重复三次作为技术重复。所有数据以平均值±标准差（mean ± SD）呈现。统计分析使用SPSS 22.0进行单因素方差分析（one-way ANOVA）及后续的多重比较。图表使用Origin 2021和R 3.2.0制作。P < 0.05被视为具有统计学意义（*P < 0.05，**P < 0.01，***P < 0.001）。

**3. 结果与讨论**
**3.1. 提取方法对多糖产量的影响**
本研究调查了五种提取方法对多糖产量的影响，结果显示：传统热水提取的产量为3.01%，酶提取为3.94%，超声波提取为3.41%，超声波-酶联合提取为4.73%，酶-超声联合提取为4.28%（图1A）。酶和超声波的顺序使用有利于提高P. amarus茎部多糖的产量。超声波空化作用与酶水解的联合效应通过有效破坏细胞壁并溶解聚合物来增强多糖的释放[32]。

**图1. 五种竹笋多糖（BSPs）的多糖产量、特性和单糖组成。**
（A）不同提取方法对BSPs提取率的影响。BSPs的特性包括傅里叶变换红外（FT-IR）光谱（B）、紫外扫描光谱（C）、Congo红实验（D）热重分析曲线（E）以及HPLC色谱图显示的单糖组成（F）。根据不同的提取方法对BSPs进行命名：热水提取（HWA-BSP）、超声波提取（UA-BSP）、酶提取（EA-BSP）、超声波-酶联合提取（UEA-BSP）、酶-超声联合提取（EUA-BSP）。相同字母标记的样本在0.05水平上无显著差异。
关于酶提取和超声波提取的多糖产量比较已有广泛报道[17]、[20]、[39]，但迄今为止只有少数研究探讨了两者顺序使用时的效果[25]。我们发现超声波-酶联合提取的产量高于酶-超声联合提取，这种优越性可能归因于超声波预处理通过空化效应有效破坏了竹笋的刚性细胞结构，从而产生了便于后续酶渗透和分解的微裂纹[33]、[40]、[41]。有趣的是，Hu等人（2025）发现酶-超声联合提取对南瓜籽的产量优于超声波-酶联合提取，这与本研究的结论不同[25]。可能的原因是植物组织结构的差异。竹笋具有密集的纤维素基质，适合初步的超声波处理；而南瓜籽可能含有更易被酶直接分解的储存多糖。然而，建议进一步采用单因素实验或响应面方法（RSM）来优化提取参数，以最大化多糖产量。此外，未来的研究还应包括额外的对照实验，例如仅进行超声波预处理后进行非酶促孵育或排除热失活效应的酶促水解，以独立评估每种处理的贡献。

**3.2. 化学特性**
如表1和图S2所示，所有五种BSPs的洗脱曲线均呈现单一的对称峰，总碳水化合物含量范围为70.52%至74.52%。这些结果共同表明所获得多糖的高度均一性和纯度。表1显示，通过Bradford法检测到的蛋白质含量较低（1.52%–2.43%），但在紫外-可见光谱（图1C）中不明显，这可能是由于紫外线检测在280 nm处的灵敏度阈值较低所致[42]。所有样本中的酚类化合物含量均低于0.7%。考虑到在酒精沉淀和透析步骤中非共价结合的酚类化合物已被去除，剩余的少量酚类化合物可能是共价结合的[43]。

**表1. BSPs的化学特性和分子量**
| 化学成分（%） | 糖（%） | 蛋白质（%） | 酚类（%） | 单糖组成（mol%） |
| ---- | ---- | ---- | ---- | ---- |
| HWA-BSP | 70.52 ± 0.61 | 1.52 | 0.30 | 1.80 |
| UA-BSP | 71.48 ± 0.35 | 1.63 | 0.17 | 5.27 |
| EA-BSP | 72.23 ± 0.66 | 1.72 | 2.43 | 1.74 |
| UEA-BSP | 74.16 ± 1.16 | 2.02 | 0.09 | 4.80 |
| EUA-BSP | 74.52 ± 0.73 | 2.22 | 0.04 | 4.52 |

**FT-IR光谱（图1B）**显示出不同多糖相似的光谱特征，在3400 cm^-1（O-H的伸缩振动）、2933 cm^-1（C-H的伸缩振动）、1651 cm^-1（C=O的伸缩振动）和1423 cm^-1（C-H的弯曲振动）处有峰[38]。1040 cm^-1和1075 cm^-1处的吸收峰是多糖中吡喃环振动的特征，对应于C-O-C伸缩和骨架振动[18]。BSPs的紫外光谱（图1C）在260 nm处无显著吸收，表明该方法无法检测到核酸杂质[44]。

**Congo红实验**用于检测多糖的三螺旋结构。如图1D所示，所有五种不同方法提取的多糖样本在测试的NaOH浓度范围（0–0.5 mol/L）内均显示出明显的红移，证实了它们都具有三螺旋结构。这与先前的研究一致[45]。尽管Congo红实验提供了三螺旋结构的初步证据，但未来研究使用圆二色性（CD）光谱或X射线衍射（XRD）等互补技术进行进一步验证将更有助于获得更直接的结构确认[46]、[47]、[48]、[49]、[50]。

**3.3. 热稳定性分析**
多糖的热稳定性是一个基本的物理化学性质，决定了其在各种实际和工业应用中的适用性[3]。热重分析曲线（图1E）显示，所有BSPs在0°C至900°C之间均表现出类似的渐进性质量减少，分为三个阶段：第一阶段主要是物理吸附和化学结合水的释放[51]；随后的主要降解阶段表现为快速的质量损失，主要由糖苷键的断裂和侧链残基的分解引起[52]；最后阶段是碳质残基的进一步热分解和解聚产物的形成[53]。

**3.4. 单糖组成**
单糖组成（图1F和表1）表明，提取方法并未改变单糖的种类，所有样本均包含相同的九种单糖：甘露糖（Man）、核糖（Rib）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（GlcA）、半乳醛酸（GalA）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）和木糖（Xyl）、阿拉伯糖（Ara）。然而，这些单糖的摩尔比例受到提取方法的显著影响。具体而言，BSPs主要由阿拉伯糖（30.06%–38.57%）、半乳糖（16.39%–22.20%）和木糖（11.38%–24.51%）组成。与Ren等人报告的P. amarus茎部多糖的结果不同[54]，我们的研究显示阿拉伯糖含量较高，而岩藻糖未被检测到。

**3.5. 显微特征**
如图2所示，HWA-BSP呈现折叠的片状形态，因为热水提取可能保留了初始结构[39]、[55]；而超声波处理后呈现出多孔的纸状结构。超声波依赖于空化效应，其特征是微泡的成核和随后的内爆，产生强烈的微尺度冲击波和局部高压区[19]。EA-BSP表现出双重形态，包括折叠的片状结构和细长的结构，这可能是由于糖苷键的酶促水解导致的较短分子链[3]。UEA-BSP和EUA-BSP具有两种提取技术的混合结构特征：前者具有由超声波空化引起的多孔区域，后者具有由酶促水解引起的折叠片状和条纹状图案。

**3.6. 分子量**
采用高效液相色谱（HPGPC）确定多糖的分子量（Mw）（表1和图S2），顺序为HWA-BSP、UA-BSP、EA-BSP，最后是UEA-BSP，UEA-BSP的分子量最低。热水提取的多糖显示出最高的Mw，表明多糖分子在高温下容易聚集[56]。相比之下，超声波处理可以降低Mw，这归因于两种机制：1）微泡的物理破坏；2）羟基自由基（•OH）对多糖链的氧化降解[19]。此外，酶处理通过水解糖苷键有效降低Mw[19]。与UEA-BSP相比，UEA-BSP的Mw较低，可能的机制如下：首先，如表1所示，单独使用酶提取的多糖比单独使用超声波提取的Mw更低，表明酶在这些条件下可能具有更强的降低分子量的能力[3]。这一观察结果与先前的研究一致[3]、[17]。因此，当多糖以超声波-酶顺序提取时，超声波可能先破坏细胞壁并释放多糖，然后酶直接降低Mw。其次，如图2所示，超声波产生的多孔结构扩大了表面积，可能暴露出更多的活性位点，有利于后续的酶促水解[32]。这些综合效应可能有助于UEA-BSP分子量的进一步降低。多分散指数（表1）是多糖分子量分布宽度的关键指标。在本研究中，所有BSP组分的数值都相对较高，表明分子量分布较广，并且不同的提取方法对整体多分散性的影响很小。

3.7. 抗氧化活性
评估了五种多糖的抗氧化能力（图3）。所有多糖的DPPH、ABTS和•OH自由基清除能力都表现出剧烈的浓度依赖性增加。DPPH自由基的半最大抑制浓度（IC50）值分别为：Vc（0.04 mg/mL），UEA-BSP（0.68 mg/mL），EUA-BSP（1.06 mg/mL），UA-BSP（1.36 mg/mL），EA-BSP（1.69 mg/mL）和HWA-BSP（2.31 mg/mL）（图S1A）。尽管这五种多糖的清除效率略低于Vc，但它们作为天然自由基清除剂显示出巨大的潜力。在ABTS自由基清除方面也观察到了类似的趋势（图3B），IC50值分别为：Vc（0.03 mg/mL），UEA-BSP（0.67 mg/mL），EUA-BSP（0.89 mg/mL），UA-BSP（1.00 mg/mL），EA-BSP（1.25 mg/mL）和HWA-BSP（1.71 mg/mL）（图S1B）。此外，还研究了羟基自由基的清除活性（图S1C），IC50值分别为：Vc（0.15 mg/mL），UEA-BSP（2.20 mg/mL），EUA-BSP（2.65 mg/mL），EA-BSP（3.44 mg/mL），HWA-BSP（3.49 mg/mL）和UA-BSP（5.13 mg/mL）。虽然所有五种多糖的活性都随着浓度的增加而上升，但它们在中和•OH方面的整体效果相对于DPPH和ABTS自由基的作用来说较为有限。另外，P. amarus枝条多糖中观察到的三螺旋结构（图1D）被认为可能增强其抗氧化生物活性[39]。然而，这一结构特征的具体贡献仍需进一步研究。

下载：下载高分辨率图像（360KB）
下载：下载完整尺寸图像

图3. BSPs的抗氧化效果体外实验，包括DPPH自由基（DPPH•）清除活性（A），ABTS自由基（ABTS•）清除活性（B），羟基自由基（•OH）清除活性（C）。(D) 五种BSP对IPEC-J2细胞的抗氧化防御效果（n = 10）。标记相同字母的样本在0.05水平上无显著差异。
与体外自由基清除测试相比，细胞实验可以提供更直接的抗氧化活性证据[35]。因此，我们使用IPEC-J2细胞系通过H2O2氧化应激模型来研究这些保护效果。IPEC-J2细胞系在营养吸收和黏膜屏障完整性方面起着关键作用，使其成为研究多糖对抗氧化损伤效果的理想平台[35],[57]。如图3D所示，暴露于H2O2导致IPEC-J2细胞活力急剧下降，这可能是由于细胞大分子的氧化损伤[58]。相反，用五种BSP处理显著逆转了这一趋势，显示出它们强大的细胞保护潜力。值得注意的是，在此阶段采用了200 μg/mL的标准浓度来比较不同提取组的相对生物活性，尽管未来的机制探索仍强烈建议进行详细的剂量-反应分析。

3.8. 多糖成分与抗氧化活性之间的关系
为了进一步阐明多糖成分与抗氧化活性之间的潜在关系，进行了Spearman相关性分析（图4）。酚类含量与DPPH自由基清除活性呈正相关（P < 0.001），这与多糖-多酚结合物具有优越的抗氧化生物活性相一致[4]。这表明多酚可能在自由基清除能力中起关键作用。此外，蛋白质也可能有助于抗氧化活性，尽管没有观察到显著相关性[59]。此外，GalA含量与羟基自由基清除能力呈正相关（P < 0.05）。多糖与尿酸酸结合后增强了抗氧化活性，这可能与羟基自由基选择性抽取C-5氢原子有关，这一过程可能受到相邻吸电子羧基的空间和立体电子效应的促进[59]。

下载：下载高分辨率图像（258KB）
下载：下载完整尺寸图像

图4. 多糖的物理化学性质与其生物活性之间的Spearman相关性分析。实线表示正相关，虚线表示负相关。线条颜色表示显著性水平：橙色（P < 0.001）和蓝色（P < 0.05）。缩写：Man：甘露糖；Rbi：核糖；Rha：鼠李糖；GlcUA：葡萄糖醛酸；GalUA：半乳甘露醛酸；Glc：葡萄糖；Gal：半乳糖；Xyl：木糖；Ara：阿拉伯糖。CV：细胞活力。
关于细胞层面的抗氧化防御，细胞活力与GlcA和Gal的含量呈正相关（P < 0.05），这与先前的研究结果一致[50]。总体而言，含有较高GlcA和Gal含量的多糖可能具有更强的抗氧化潜力。虽然这些相关性为了解特定成分的贡献提供了有价值的见解，但应注意的是，它们并不直接证明因果关系，不同结构特征之间的复杂相互作用需要进一步研究。

相关性分析还显示低分子量与增强抗氧化能力相关（P < 0.05），在Dendrobium officinale多糖[3]和comfrey（Symphytum officinale L.）根多糖[56]中也观察到了类似现象。这可能归因于还原末端在吸收过程中的增加[60]。从体外角度来看，低分子量多糖更容易穿透生物膜，并有效与细胞酶和受体相互作用，由于表面积与体积比的优越性，可能增强其与生物系统的相互作用。因此，低分子量多糖可能表现出更强的能力来增强抗氧化酶活性[61],[62]。此外，它还可以提高溶解度，从而增加在消化道中的吸收率，这些综合特性使得低分子量多糖具有卓越的抗衰老生物活性[61]。因此，UEA-BSP表现出优异的自由基清除能力和保护IPEC-J2细胞免受H2O2诱导的氧化应激的影响，这很可能与其高多酚含量、低分子量和高Gal及GalA含量有关。

3.9. 在D-gal诱导的衰老小鼠模型中的抗衰老活性
鉴于UEA-BSP表现出的优越抗氧化能力和低分子量，它被用于以下使用D-gal诱导的衰老小鼠模型的抗衰老实验。实验工作流程如图5A所示。

下载：下载高分辨率图像（589KB）
下载：下载完整尺寸图像

图5. (A) 动物实验示意图。(B) 第5天Morris水迷宫测试的典型游泳轨迹。(C) 通过H&E染色观察UEA-BSPs对D-gal诱导衰老小鼠海马组织的影响。绿色箭头表示核固缩。

3.9.1. 体重变化
图6A显示了所有实验小鼠在6周内的体重变化。尽管每组在这段时间内体重都逐渐增加，但D-gal诱导模型组的体重增长速率低于对照组。然而，UEA-BSP处理以剂量依赖的方式减轻了这种体重抑制，第六周的平均体重分别为高剂量组24.44 g和模型组23.52 g。

下载：下载高分辨率图像（302KB）
下载：下载完整尺寸图像

图6. UEA-BSP对体重和Morris水迷宫测试学习能力的影响。(A) 不同剂量BSPs对体重的影响。(B) BSPs对D-gal诱导衰老小鼠学习能力的缓解效果，通过逃逸潜伏期（B）来量化，目标象限停留时间（C）和目标平台穿越次数（D）。数据以平均值±标准差表示，n = 10。*和**分别表示与D-gal诱导的老化模型对照组相比，P < 0.05和P < 0.01。#、##和###分别表示与模型组相比，P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001。

3.9.2. Morris水迷宫测试
Morris水迷宫（MWM）测试是一种验证的行为范式，用于评估衰老模型中海马依赖的空间学习和记忆。使用Morris水迷宫测试评估了D-gal诱导衰老小鼠的认知功能，包括位置导航试验和空间探测试验。在D-gal诱导的衰老小鼠中，延长的逃逸潜伏期和减少的平台穿越次数反映了导航能力的受损，这与衰老小鼠观察到的认知下降相符[63],[64]。衰老模型组在空间学习和记忆保持方面表现出明显受损，表现为显著延长的逃逸潜伏期（图6B，P < 0.001 vs 对照组）和在目标象限停留时间减少（图6C，P < 0.001），典型的游泳轨迹如图5B所示。相比之下，阳性对照（Vc）和高剂量实验组在这些行为参数上显示出显著改善。值得注意的是，高剂量组表现出显著的逃逸潜伏期缩短（图6B，P < 0.05 vs 模型组）和在目标象限停留时间增加（图6C，P < 0.05），表明空间学习能力得到增强。在空间探测试验中，高剂量组的目标平台穿越次数显著高于模型组（图6D，P < 0.01），其值接近对照组。

3.9.3. 通过H&E染色的组织病理学评估
海马的组织病理学评估显示出D-gal处理引起了某些病理变化，特征包括显著的神经元丢失、细胞排列紊乱、细胞质空泡化和核固缩。观察表明UEA-BSP处理以剂量依赖的方式有效缓解了这些病理变化，细胞密度和结构完整性明显恢复。具体来说，接受高剂量UEA-BSP的小鼠显示出相对紧凑和有序的颗粒细胞层，固缩神经元明显减少，与阳性组观察到的形态相似。这些观察结果表明UEA-BSP可能通过减轻氧化应激介导的神经元损伤并保护衰老小鼠的海马微结构而发挥强大的神经保护作用[63]。

3.9.4. UEA-BSP对D-gal诱导衰老小鼠中抗氧化酶活性的影响
D-gal诱导的衰老模型因其能够通过产生过多的自由基和ROS介导的氧化应激来模拟自然衰老而受到广泛认可[65]。在本研究中，UEA-BSP干预以剂量依赖的方式有效逆转了这些病理趋势，包括在肝脏、大脑和血清中超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性的显著恢复（图7A-I）。它们协同作用以中和ROS。SOD将超氧自由基（O2•–）转化为过氧化氢（H2O2），而CAT和GSH-Px进一步将H2O2分解为水，从而防止有害的羟基自由基（•OH）的形成。这表明UEA-BSP增强了内源性ROS的清除，这一点通过MDA（多不饱和脂肪酸氧化的产物）积累的显著减少得到证实，反映了ROS引起的膜脂质损伤的程度[63]（图7J-L）。虽然本研究展示了UEA-BSP的抗衰老效果，但其潜在的分子机制仍有待完全阐明。未来的工作将侧重于研究UEA-BSP在调节肠道微生物群平衡和激活Nrf2信号通路中的作用。

下载：下载高分辨率图像（554KB）
下载：下载完整尺寸图像

图7. 多糖对肝脏（A）、大脑（B）、血清（C）中CAT（U/mgprot）；肝脏（D）、大脑（E）、血清（F）中SOD（U/mgprot）；肝脏（G）、大脑（H）、血清（I）和血清（L）中GSH-Px（U/mgprot）以及肝脏（J）、大脑（K）、血清（L）中MDA含量的影响。数据以平均值±标准差表示，n = 6。*和**分别表示与D-gal诱导的老化模型对照组相比，P < 0.05和P < 0.01。#、##和###分别表示与模型组相比，P < 0.05、P < 0.01和P < 0.001。

3.9.5. UEA-BSP对乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响
图S1D显示，与对照组相比，D-gal给药显著增加了大脑中的AChE活性。值得注意的是，H-UEA组的酶水平显著降低。胆碱能系统对于调节参与学习和记忆的海马回路至关重要[64]。乙酰胆碱（ACh）是该系统中的主要神经递质，在维持突触传递的有效性中起着关键作用。AChE通过催化ACh的水解来终止这一信号传递；因此，AChE活性的升高通常与胆碱能缺乏和认知障碍相关[66],[67]。在本研究中，UEA-BSP处理显著抑制了大脑中的AChE活性。这种AChE活性的降低可能有助于减少ACh的过度降解，从而可能改善在Morris水迷宫中观察到的行为表现，如逃逸潜伏期缩短和平台穿越次数增加。这些发现表明UEA-BSP可能通过调节胆碱能酶活性来改善认知衰退，尽管需要进一步研究来直接量化ACh水平和突触标志物。

4.**结论**
在本研究中，采用五种超声波和/或酶的方法（HWA-BSP、UA-BSP、EA-BSP、UEA-BSP 和 EUA-BSP）提取了 P. amarus 的茎多糖，并系统地比较了这些多糖的产量、化学组成和抗氧化活性。结果显示，所获得的多糖具有较高的多糖含量、较低的蛋白质和多酚含量，且具有三螺旋结构。值得注意的是，UEA-BSP 的产量最高，分子量最低。此外，UEA-BSP 对 IPEC-J2 细胞在 H2O2 诱导的氧化损伤中表现出优异的保护作用。通过 D-半乳糖模型衰老小鼠进一步评估了 UEA-BSP 的抗衰老效果。Morris 水迷宫测试表明，UEA-BSP 可以保护记忆和学习能力，这与海马区组织病理学变化的改善相一致。此外，UEA-BSP 显著增强了衰老小鼠血清、肝脏和脑组织中的 CAT、SOD 和 GSH-Px 活性，并降低了 MDA 水平。总体而言，本研究表明提取过程中超声波和酶的使用顺序对 P. amarus 茎多糖的抗氧化活性具有显著影响，为将来将 P. amarus 多糖作为抗衰老功能性食品成分的应用提供了有价值的参考。

**机构审查委员会声明**
所有动物实验和程序均遵循四川农业大学伦理委员会批准的指南和规定进行（确认编号：20250574）。

**作者贡献声明**
韩瑞清：撰写-初稿、软件使用、方法设计、实验设计、数据分析、数据整理。
顾毅：撰写-初稿、方法设计。
徐一鸣：方法设计、数据分析。
吴思宇：撰写-初稿。
李文山：实验设计。
南世波：实验设计。
邹元丰：撰写-审稿与编辑、验证、监督、资源协调、概念构思。

**资金支持**
作者感谢四川省大学生创新创业训练计划（项目编号：S202510626029）的财政支持。