综述：沙门菌在感染中的持久性：分子调控、宿主微环境与多尺度异质性

《Microorganisms》：Salmonella Persistence in Infection: Molecular Regulation, Host Microenvironments, and Multiscale Heterogeneity Dandan Ding, Hui Sun and Jing Yang

　　

沙门菌（Salmonella）持久性是导致感染复发、慢性携带和抗生素疗效降低的重要因素。传统观点认为持久性细胞是处于休眠状态的亚群，可被动地耐受抗生素暴露。然而，目前日益认识到持久性细胞是一种动态、异质且依赖于具体环境的生理状态，由细菌的调控程序和宿主微环境压力共同塑造。本文综述从多尺度视角审视沙门菌的持久性。首先，本文阐明了关键的抗生素生存表型，包括耐药性（resistance）、异质性耐药（heteroresistance）、耐受性（tolerance）、持久性（persistence）和活的非可培养状态（viable but non-culturable states）。其次，本文讨论了宿主来源的应激源，如吞噬体酸化、营养限制、金属离子扰动以及活性氧/氮物种，如何促进生长受限且与持久性相关的细菌状态。在细菌层面，总结了涉及严紧反应（stringent response）、SOS反应、毒素-抗毒素系统以及辅助调控因子的应激反应网络，这些网络协调代谢重塑、生长限制和抗生素生存。在宿主层面，重点阐述了器官储存库、免疫细胞亚群、代谢信号以及沙门菌介导的免疫生态位重塑如何塑造体内持久性相关表型。最后，讨论了临床和转化意义，包括内源性复发、耐药性进化以及新兴的抗持久性策略。总之，本综述为理解沙门菌持久性提供了一个框架，将其视为与复发性和慢性感染相关的、依赖于生态位的多尺度过程。

论文主体内容总结

1. 引言

沙门菌是一种重要的全球性食源性致病菌，可导致严重的发病率和死亡率。其感染不仅可急性复发，还可建立慢性无症状携带。在感染过程中，一部分沙门菌可进入一种可逆的非增殖状态，即持久性细胞。这些细胞能在不获得遗传耐药性的情况下，在致命浓度的抗生素暴露中存活，常定植于受保护的细胞内生态位。持久性细胞的复苏导致了感染的复发和慢性化。沙门菌的持久性状态并非被动的休眠，而是涉及对宿主细胞环境的主动适应。本文将沙门菌持久性生物学置于一个整合了细胞内调控机制、组织特异性宿主微环境、免疫生态位重塑和潜在干预策略的多尺度视角中进行审视。

2. 沙门菌抗生素生存表型的概念框架

沙门菌感染的治疗失败和复发是多因素的。细菌在抗生素暴露和宿主免疫压力下的生存能力是关键因素之一。这种生存能力反映了一系列在群体和单细胞水平上运作的遗传编码的耐药和非遗传生存策略。基于抗生素持久性共识框架，细菌在抗生素应激下的生存通常用几个相关但不同的现象来描述：

• •
  耐药性：指稳定的、可遗传的性状，使细菌能在抗生素存在下生长，通常表现为最低抑菌浓度升高。
• •
  异质性耐药：指在同基因细菌群体中，一小部分亚群表现出远高于其余部分的MIC。
• •
  耐受性：一种群体水平的表型，通过缓慢生长延长生存时间，但不改变MIC。
• •
  持久性：影响一小部分亚群，表现为双相杀灭曲线，是可逆的。
• •
  活的非可培养状态：细菌处于代谢活性低、不可培养但存活的状态。

2.1. 耐药性、异质性耐药、耐受性与持久性

这些表型可根据其对最低抑菌浓度和最低杀灭持续时间这两个关键参数的影响来区分。耐药和异质性耐药以MIC升高为特征，而耐受和持久性则定义为在不改变MIC的情况下延长MDK。

2.2. 持久性细胞：定义、类型与体内表现

持久性细胞指一小部分、瞬时存在的遗传敏感细菌亚群，它们在不获得可遗传耐药性的情况下在抗生素暴露中存活。这些细胞在抗生素或宿主来源的应激下进入可逆的非生长或极缓慢生长状态，并在应激解除后恢复增殖。持久性细胞在概念上不同于休眠和耐受。根据共识框架，持久性细胞可大致分为自发型和诱导型。自发型持久性细胞在没有外部应激的情况下随机出现，反映了细菌群体内在的表型异质性。诱导型持久性细胞则是对环境信号（特别是感染期间遇到的宿主相关应激，如营养限制、酸化和免疫介导的压力）的响应而出现。在体内，沙门菌持久性由复杂的宿主微环境塑造。宿主来源的应激，包括酸性pH、营养限制、活性氧物种和活性氮物种，将细菌驱动至生长受限状态。在感染组织中，至少两种生存模式可共存：一种是群体水平的生长速率降低（符合抗生素耐受性）；另一种是较小的亚群通过随机或应激诱导机制进入更深的休眠状态（符合经典持久性）。单细胞分析为细胞内非复制细菌在应激缓解后可恢复增殖提供了直接证据。

3. 塑造持久性相关状态的宿主来源应激源

在感染模型中，宿主相关的免疫和代谢应激共同塑造细菌生理状态，并在特定生态位中促进持久性相关亚群的出现或维持。宿主来源的因素包括：

• •
  吞噬体酸化和酸应激适应：吞噬体微环境，特别是酸性pH，是沙门菌遇到的主要挑战之一。细菌通过EnvZ/OmpR双组分系统感知酸性pH，协调增强酸抗性和调控毒力基因表达的适应性反应。全局转录组分析表明，沙门菌的酸耐受反应涉及细菌基因表达的广泛重编程，与能量消耗减少、DNA修复和氧化损伤修复系统激活以及细胞内pH稳态维持相关。这种代谢重塑可能将一部分细菌群体推向非复制或缓慢生长状态。
• •
  营养免疫和代谢限制：宿主通过限制必需金属离子的可用性或积累抗菌浓度的铜来施加选择压力。这些金属扰动限制了依赖金属辅因子的核心细菌代谢过程，从而可能有利于在细胞内应激条件下形成生长受限状态。关键代谢资源的限制也可能影响进入持久性相关生长受限状态的可能性。
• •
  活性氧/活性氮物种介导的生长限制与再激活：免疫细胞产生的活性氧和活性氮是关键应激信号，可能促进细菌亚群进入持久性相关状态。在巨噬细胞感染模型中，巨噬细胞来源的活性氧可诱导沙门菌细胞内蛋白质聚集体的形成。含有这些聚集体的细菌表现出与休眠相关或深度生长受限状态一致的特征。一氧化氮及其衍生物是宿主对沙门菌先天免疫反应的关键效应分子。在感染后期，活性氮物种可能有助于将细胞内细菌亚群维持在生长受限状态。宿主应激信号最终汇聚于一个共同的生理结果：细胞内ATP水平降低和细菌生长减慢。降低的ATP和缓慢生长与持久性相关生理状态广泛相关，并被认为是导致群体水平耐受和亚群水平持久性的原因。

4. 沙门菌持久性的细菌调控网络

在感染期间，沙门菌暴露于各种抗菌应激源，这些应激可激活严紧反应、SOS反应和毒素-抗毒素系统。

• •
  严紧反应与持久性相关生长限制：沙门菌通过严紧反应整合多种宿主施加的应激信号，该反应广泛涉及持久性相关状态的出现和维持。严紧反应的核心是细胞内信号分子鸟苷四/五磷酸的积累。在感染期间，宿主相关的营养限制和免疫来源的应激是严紧反应的重要触发因素。积累触发全局代谢重塑，并被认为创造了有利于进入持久性相关状态的生理环境。这种代谢重塑不仅由介导，在许多情况下还涉及转录调控因子DksA。在巨噬细胞感染模型中，单细胞分析表明沙门菌可在巨噬细胞内形成非复制持久性亚群，且此过程与严紧反应相关。
• •
  SOS反应在持久性相关生存和耐药性进化中的作用：SOS反应是一种可诱导的DNA损伤修复系统，在细菌对基因毒性应激的反应中起核心作用。SOS反应对持久性的贡献可能涉及两个方面：修复DNA损伤以支持细菌在应激下生存；以及诱导诱变途径，从而增加后续遗传适应的潜力。持久性相关状态可能提供一个有利于遗传耐药性进化而非直接导致其发生的生理环境。SOS反应对持久性相关状态出现的贡献主要从体外抗生素应激研究中推断，直接的体内证据有限。
• •
  毒素-抗毒素系统作为环境依赖的生长限制调节因子：毒素-抗毒素系统广泛存在于细菌基因组中，由稳定的毒素和不稳定的抗毒素组成。毒素通过抑制DNA复制、翻译或细胞壁合成诱导生长停滞，而抗毒素则中和毒素活性。在应激下，抗毒素可能失稳，从而允许毒素活性促进可逆的生长限制和持久性相关状态的出现。多个毒素-抗毒素系统在抗生素或宿主免疫应激下转录上调，但它们对持久性细胞形成的贡献仍有争议。在沙门菌中，特定的毒素在巨噬细胞内被诱导，表明其受到宿主细胞内环境的选择性激活。
• •
  辅助应激调节因子对持久性相关生存的贡献：除了核心途径，沙门菌还通过几种辅助调控机制进一步调节持久性相关状态。这些机制通常与核心途径相互作用或在特定宿主相关条件下发挥作用，涉及RNA结合蛋白ProQ、内源性前噬菌体诱导、硫转移酶复合物、小蛋白MicN以及RpoS、RecA和RpoE等主要应激反应系统。
• •
  严紧反应-SOS-毒素-抗毒素网络相互作用的整合模型：严紧反应、SOS反应和毒素-抗毒素系统都对宿主免疫压力作出反应，并在不同应激背景下不同程度地涉及持久性相关生存。现有研究揭示了这些系统之间的若干相互作用点。首先，严紧反应和毒素-抗毒素系统之间存在双向调控。其次，SOS反应和毒素-抗毒素系统存在功能重叠。在效应物水平，这三种途径共享一个共同的结果：它们可以通过不同的机制促进细菌生长限制。尽管它们相互作用的程度尚未完全解决，但这些途径可能在代谢活性降低、生长停滞和ATP稳态改变的水平上汇聚，从而有助于在宿主压力下形成群体水平耐受和亚群水平持久性。

5. 宿主微环境与沙门菌持久性的双向塑造

沙门菌进入持久性相关状态的分子机制赋予了在应激下生存的潜力，但这种潜力能否在体内实现取决于细菌所处的特定微环境。

• •
  器官水平的空间异质性与组织储存库：在实验感染模型中，即使在同一宿主组织内，沙门菌的生理状态也表现出相当大的异质性。宿主免疫反应的时空差异也促进了这种异质性的产生。沙门菌在体内的分布及其持久性受宿主局部微解剖结构的影响。例如，脾脏白髓中性粒细胞密度低，免疫清除有限，使沙门菌能在抗生素处理后存活并形成庇护所。肠系膜淋巴结是抗生素治疗后最后一个维持沙门菌定植的部位，也是停药后最先恢复细菌活性的部位，凸显了其作为持久性潜在核心储存库的特殊作用。胆囊是伤寒沙门菌慢性携带和复发的公认储存库，在长期定植和持久性中起重要作用。一方面，胆固醇胆结石为沙门菌持久性提供了独特的细胞外生态位。另一方面，胆囊上皮本身为沙门菌持久性提供了细胞内生态位。使用基因标记菌株的研究结合数学模型进一步揭示，细菌在不同器官中形成独立且随机建立的亚群，这一过程受到宿主抗菌防御的严格调控。
• •
  持久性相关亚群的细胞生态位：在细胞水平，巨噬细胞可能是实验模型中持久性相关亚群的潜在生态位。在实验模型中，抗生素处理后，沙门菌被报道在盲肠引流淋巴结的CD103⁺树突状细胞中富集，并进入低代谢状态，表现出对氟喹诺酮类药物的表型耐受。肝脏也被认为与慢性感染相关，其特征是富含调节性CD4⁺T细胞和M2样巨噬细胞的免疫环境，这可能有利于沙门菌的长期持久性。最近的研究进一步将能够容纳持久性相关细菌的宿主细胞类型范围扩展至B细胞。营养限制作为一种宿主施加的代谢约束，广泛存在于各种非巨噬细胞的宿主细胞类型中，可促成持久性相关状态。
• •
  宿主代谢信号与应激信号对持久性动态的调节：感染微环境中的缺氧和炎症驱动的糖酵解导致乳酸在感染部位积累。巨噬细胞来源的乳酸以SteE依赖性方式促进M2极化。在极化的M2巨噬细胞中，宿主转录因子PPARδ显著上调，其激活脂肪酸氧化相关基因，从而重塑宿主细胞代谢，为沙门菌在巨噬细胞内的生存和长期持久性提供碳源和能量。宿主的全身应激反应也在调节持久性中发挥作用。宿主应激状态下升高的糖皮质激素可被沙门菌通过ScsA相关通路感知，触发细菌适应性反应。宿主免疫信号不仅影响持久性相关状态的形成，还可能调节持久性细菌的再激活。宿主活性氮物种可通过干扰细菌TCA循环将持久性细菌锁定在生长停滞状态。当感染后期活性氮物种水平下降时，这些持久性细菌以缓慢且高度异质的方式恢复生长。
• •
  沙门菌介导的免疫生态位重塑：沙门菌通过毒力相关的宿主重编程主动重塑免疫微环境，从而构建可能有利于持久性相关生存的生态位。研究表明，细胞内持久性沙门菌保留代谢活性，并可通过SPI-2 T3SS分泌效应蛋白来抑制促炎反应并诱导M2极化。驱动M2极化的一个关键机制是T3SS效应蛋白SteE。在脾脏肉芽肿模型中，SteE活性驱动M2极化，而宿主肿瘤坏死因子信号则抵消这一过程。利用斑马鱼模型和高分辨率实时成像技术揭示，感染过程中巨噬细胞表型发生动态变化，早期为限制细菌增殖的M1促炎表型，后期沙门菌则持久存在于转变为抗炎/再生状态的静止巨噬细胞内。
• •
  风险对冲与表型异质性的进化意义：宿主微环境在空间和分子水平塑造的表型异质性可能反映了细菌群体为应对复杂动态宿主环境而采用的风险对冲策略。这种策略可能允许细菌群体即使在强抗生素压力和免疫清除下，也能维持适应特定微环境的亚群，从而有助于持久性和感染复发。

6. 沙门菌持久性的临床与转化意义

• •
  持久性储存库与内源性复发：持久性细胞和持久性相关细菌亚群有助于在宿主组织中形成长期潜伏储存库，为感染复发提供了潜在的机制基础。使用荧光单细胞分析已证明，被巨噬细胞内化后，沙门菌迅速形成由空泡酸化和营养剥夺诱导的非复制持久性亚群。一些持久性细胞在被初始巨噬细胞吞噬后恢复细胞内生长，建立了可引发复发感染的储存库。肠系膜淋巴结等组织是沙门菌以休眠或低代谢状态持续存在的解剖学生态位。抗生素停药后，这些储存库可被再激活，可能导致复发感染。小鼠模型证明，沙门菌在宿主组织中形成抗生素顽固性储存库，治疗停止后，这些储存库再激活，重新播种肠道内腔并导致克隆传播。
• •
  持久性相关生存与耐药性进化：持久性细胞和持久性相关亚群可能以两种相关方式促进体内抗生素耐药性的进化。首先，通过在抗生素治疗和宿主来源应激中存活，这些细胞可延长感染期间的细菌生存时间，这提供了一个时间窗口，使得耐药性突变可能在此持续选择压力下出现并富集。其次，通过使内腔区室能够被重新播种，持久性相关储存库增加了与常驻微生物群接触的机会，创造了允许水平基因转移的生态条件。此外，pESI大质粒等可移动遗传元件可将抗菌素耐药性决定簇与涉及应激适应或持久性相关表型的基因共定位，增加了在宿主和抗生素压力下被共同选择的可能性。总之，这些观察支持一个更谨慎的观点：持久性相关生存可能创造有利于耐药突变体出现或富集的生态和时间条件，并可能增加宿主相关环境中水平基因转移的机会。
• •
  新兴的抗持久性策略：认识到某些持久性相关亚群尽管生长停滞但仍保持代谢活跃，这推动了实验系统中“代谢唤醒”策略的探索。在此背景下，据报道外源性腺苷可通过嘌呤补救相关的代谢激活增加细菌ATP可用性和质子驱动力，从而增强原本具有耐受性的亚群对抗生素的摄取。其他策略也被探索以更直接地减少持久性。诱导前噬菌体裂解周期可在体外减少持久性形成。干扰沙门菌驱动的M2样巨噬细胞极化的免疫调节可降低细胞内生态位的许可性。宿主来源的活性氮物种限制细菌代谢并减少与流出相关的耐受性，可能增强细胞内抗生素活性。恢复定植抗力的生态干预措施可能限制沙门菌在治疗后的腔内再扩增，并减少耐药基因交换的机会。这些策略总体上仍处于新兴或概念阶段，而非临床确立。此外，沙门菌持久性在食品生产和畜牧业中也构成重大挑战。未来的控制策略应整合针对人和动物系统中持久性的干预措施，采用“一体化健康”框架。

7. 结论与展望

沙门菌的持久性相关状态是一种从动态宿主-病原体相互作用中产生的适应性生理状态。它不仅仅是生长停滞的一种形式，而是由宿主微环境压力塑造，并可能在多种选择约束下稳定一种代谢活跃、非复制的状态。这使得细菌能够在强免疫反应和抗生素压力下生存，从而促进感染复发、免疫逃逸和抗菌应激下的持久性相关生存。持久状态最好被理解为动态、异质且具有生态功能的一系列生理状态谱，而非单一的静态亚群。持久性相关状态也可能通过为耐药性突变的出现和富集创造一个时间窗口，在表型耐受性和遗传耐药性进化之间提供重要联系。这可能增加宿主内耐药性决定簇传播的机会，并在某些条件下也可能有助于后续传播。尽管该领域取得显著进展，但沙门菌持久性研究仍面临几个关键挑战，包括当前研究模型的局限性和量化体内异质性的挑战、对持久性异质性系统表征不足，以及将实验性抗持久性策略转化为临床实践的挑战。面对这些挑战，未来的干预策略可能需要超越传统的杀菌方法，转向多靶点、系统水平的生态干预。在宿主微环境、免疫调控和微生物生态学的交叉点理解沙门菌的持久状态，不仅为重新评估抗生素治疗失败的原因提供了更广阔的视角，也为开发针对慢性感染和耐药性进化的下一代干预策略提供了概念框架。