《Microorganisms》：Inhibitors of the FASII Metabolic Pathway in Toxoplasma gondii: Advances and Therapeutic Perspectives
Claudia Jessica Castillo-Villanueva,
Jhony Anacleto-Santos,
Teresa de Jesús López-Pérez,
Brenda Casarrubias-Tabarez,
Teresa I. Fortoul,
Marcela Rojas-Lemus,
Nelly López-Valdez,
Elisa Vega-ávila,
Fernando Calzada and
Norma Rivera-Fernández
+ 1 author
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是顶复门（Apicomplexa）的一种专性细胞内寄生虫，也是弓形虫病的病原体。该病全球分布，在免疫功能低下患者和孕期可导致严重后果。目前的药物治疗存在显著局限性，包括毒性、对寄生虫慢性期无效以及低选择性，这凸显了开发新治疗靶点的必要性。最有前景的靶点之一是脂肪酸合成II型（FASII）途径，这是一条位于寄生虫顶质体（apicoplast）中、哺乳动物宿主不存在的代谢途径。本篇综述综合了迄今为止描述FASII途径抑制剂的现有证据，以及它们对刚地弓形虫（T. gondii）生存力和发育的潜在影响。总体而言，所综述的研究支持FASII途径是开发更具选择性和更有效抗弓形虫病疗法的一个有吸引力的治疗靶点。
1. 引言
刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）是一种顶复门专性细胞内原虫，可感染包括人类在内的多种恒温动物，引起弓形虫感染。其全球血清阳性率约为31%，但该数据因地区差异可从10%到超过90%不等。感染主要通过摄入被卵囊污染的食物或水，或食用含有组织包囊的生肉或未煮熟肉类传播，也可通过垂直传播、输血和器官移植传播。虽然感染在免疫功能正常个体中通常无症状，但对免疫功能低下者（特别是HIV/AIDS患者，其体内潜伏感染可被再激活导致弓形虫脑炎）和孕妇（可能导致自发性流产或先天性弓形虫病）构成重大临床风险。此外，慢性感染最近还与行为改变和精神障碍相关联。
目前尚无用于人类治疗该感染的疫苗，因此治疗基于药物治疗，其中乙胺嘧啶和磺胺嘧啶（P/S）组合是治疗多种临床表现（包括急性弓形虫病、弓形虫脑炎和眼弓形虫病）的首选药物。尽管P/S组合对速殖子有效，但对缓殖子（导致慢性弓形虫病以及在免疫功能低下患者中急性期再激活的寄生虫形态）无效。P/S抑制参与叶酸代谢的酶，但该治疗不能区分寄生虫和宿主的酶，导致以巨幼细胞性贫血、白细胞减少症和血小板减少症为特征的血液学毒性，以及从轻度皮疹到史蒂文斯-约翰逊综合征或中毒性表皮坏死松解症等严重表现的超敏反应。大环内酯类（阿奇霉素和螺旋霉素）和林可酰胺类（克林霉素）抑制50S核糖体亚基，改变寄生虫顶质体中的蛋白质合成。然而，这些药物同样对急性弓形虫病无效，并产生轻度副作用。螺旋霉素用于妊娠早期孕妇以降低母婴传播风险，但其低胎盘渗透性使其对已建立的胎儿感染无效。鉴于刚地弓形虫的全球流行率和该病在易感人群中的严重性，开发毒性更低、对所有寄生虫阶段均有效且具有高选择性的新型抗弓形虫化合物至关重要。
2. 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）的裂解周期
裂解周期是速殖子附着并侵入宿主细胞、通过形成纳虫空泡在细胞内立足、通过内二芽殖（endodyogeny）进行复制并逸出，导致细胞裂解并释放可入侵更多细胞的新寄生虫的过程。该过程主要依赖于三个特化的分泌细胞器：微线体（micronemes）、棒状体（rhoptries）和致密颗粒（dense granules）。这些细胞器主要位于寄生虫顶端，依次释放一系列效应蛋白，使寄生虫能够完成其细胞内周期。微线体释放MIC蛋白，使速殖子能够滑动并粘附到细胞表面，启动入侵过程。随后，棒状体释放其RON和ROP蛋白，形成一个可移动的连接（sliding junction）并构建纳虫空泡。最后，致密颗粒分泌GRA蛋白，修饰细胞内环境和纳虫空泡，促进寄生虫复制并参与逸出过程。
宿主免疫反应诱导速殖子在基因表达、翻译和代谢方面的变化，使其快速活跃的分裂停止，转而进行缓慢复制并转化为将形成组织包囊的缓殖子。组织包囊可在宿主骨骼肌和大脑等组织中终生存在。在免疫功能低下患者中，缓殖子可被再激活并分化为速殖子，导致严重的或可能致命的急性播散性感染。寄生虫通过裂解周期进行复制需要强烈的膜重塑和脂肪酸合成途径（如FASII）合成的脂质增加，这对于纳虫空泡的快速形成和系统性播散至关重要。裂解周期示意图可参考图1。
3. 刚地弓形虫（Toxoplasma gondii）脂质组
刚地弓形虫的脂质组是寄生虫产生、使用或修饰的一组脂质，在裂解周期的所有阶段（从入侵到逸出）都起着基础性作用。脂质是细胞膜、细胞器的重要组成部分，也是细胞内通讯的信号分子。刚地弓形虫通过三条途径从头获取脂肪酸：I型脂肪酸合成（FASI）途径，在细胞质中生成棕榈酸和长链脂肪酸；FASII途径，在顶质体中生成短链脂肪酸，如肉豆蔻酸和棕榈酸；以及脂肪酸延伸途径，在内质网中生成长链脂肪酸，如棕榈油酸和油酸。FASII途径是该寄生虫特有的，被认为是开发抗弓形虫病新药的重要代谢靶点。刚地弓形虫脂质抑制剂能够直接影响各种脂质成分，破坏膜结构，并最终杀死寄生虫。脂肪酸合成途径示意图可参考图2。
4. FASII合成途径
被称为FASII的代谢途径存在于某些细菌、植物和寄生虫中，包括顶复门寄生虫。该途径通过单个单功能酶的连续作用来生成脂肪酸。与哺乳动物中存在的FASI途径不同，FASII途径在合成脂肪酸的长度和组成上具有更大的灵活性。由于FASII途径在人类中不存在，作者认为该代谢途径是创造具有抗寄生虫和抗菌活性的新化合物极具前景的治疗靶点。
FASI和FASII途径在结构和功能上均存在差异。FASI由单个包含多个催化位点的大型蛋白质复合体组成，而FASII则作为一个由独立酶组成的系统运作，这些酶通过一系列循环和连续的延伸反应协同作用。在每个循环中，不断增长的酰基链沿着途径共价结合到酰基载体蛋白（ACP）上，这些反应由β-酮脂酰-ACP合酶、β-酮脂酰-ACP还原酶、β-羟脂酰-ACP脱水酶和烯脂酰-ACP还原酶（ENR）催化。寄生虫通过丙酮酸脱氢酶（PDH）的作用从细胞质中获取葡萄糖，形成初始底物乙酰辅酶A（Acetyl-CoA），并最终产生短链饱和脂肪酸，如肉豆蔻酸酯（C14:0）和棕榈酸酯（C16:0）。FASII的另一功能是产生辛酸（ACP），它是硫辛酸的前体。硫辛酸是顶质体丙酮酸脱氢酶（PDH）E2亚基活性所必需的辅因子，对乙酰辅酶A的供应也很重要。FASII示意图可参考图3。
5. FASII途径作为药物靶点
鉴于对药物耐药性和当前弓形虫病治疗局限性的担忧，FASII途径代表了一个非常有趣的药理学靶点。寄生虫中存在的FASII途径与宿主中真核生物的FASI途径之间的差异使得设计能够减少人类副作用的选择性药物成为可能。刚地弓形虫只能直接从宿主细胞获取部分脂质。因此，FASII途径对于获取宿主无法提供的脂肪酸（如肉豆蔻酸和棕榈酸）至关重要。作者提到，FASII途径对寄生虫的生长、生存和致病力是必需的，因此干扰该途径会损害其毒力。据报道，该途径的改变也会导致寄生虫速殖子的胞质分裂缺陷和不完整的表膜形成，影响其增殖。
关于顶质体中脂质代谢功能丧失的遗传学研究证明了FASII途径对刚地弓形虫的重要性。例如，内质网乙酰辅酶A转运蛋白（TgAT1）的改变和前体的缺乏会影响顶质体中脂肪酸的从头合成。这导致细胞器形成异常和寄生虫体外增殖显著减少。此外，缺乏顶质体所需的丙酮酸供应（这对硫辛酰化和顶质体PDH活性至关重要）也会导致细胞器损失和寄生虫生长减少，这为将FASII作为治疗靶点提供了依据。
6. FASII抑制剂
6.1. 三氯生（Triclosan）
三氯生是一种广泛用于家用产品的二苯醚，它是第一个被确定作用于细菌FASII的化合物之一。三氯生（5-氯-2-[2,4-二氯苯氧基]苯酚）被证明通过抑制烯脂酰-ACP还原酶（ENR或FabI）（在刚地弓形虫中为TgENR）来抑制顶复门寄生虫恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）和刚地弓形虫的生长和生存。FabI是FASII途径中负责最后一步还原的酶，催化依赖于NAD+的反式-2,3-烯脂酰部分的还原反应。该酶被认为是理想的药理学靶点，因为它在哺乳动物中没有同源物。
据报道，三氯生以纳摩尔浓度影响寄生虫生长。其对RH株速殖子生长的半数抑制浓度约为200 nM。体外酶学试验表明，三氯生能够以低于20 nM的IC50值抑制TgENR的酶活性，特定IC50值为15 nM。当酶的催化活性降低时，可观察到顶质体形态改变和增殖减少。关于三氯生体内效应的报告表明，它是抗急性和慢性形式鼠弓形虫病的潜在药物。此外，一些作者证明三氯生能显著降低小鼠死亡率，并减少腹膜和肝脏中的寄生虫载量。它还能降低来自感染和治疗小鼠的速殖子和包囊的活力和毒力。三氯生作为NAD+辅因子的非竞争性抑制剂，与酶和辅因子的氧化形式形成三元复合物：三氯生/NAD+/TgENR。抑制作用通过三氯生与酶活性位点中保守的酪氨酸残基结合而发生，这阻止了与底物的三元复合物的形成。结构上，紧密结合涉及抑制剂结合位点上方形成α螺旋，这一特征已在与三氯生和NAD+共结晶的TgENR晶体结构中观察到。三氯生的酚环（A环）以“三明治”构型位于NAD+辅因子对面，促进π-堆积相互作用。A环的酚羟基与保守残基Tyr189以及NAD+的2'-羟基形成氢键。二氯苯氧基环（B环）主要参与与多个残基（包括Leu128, Ala131, Val134, Met193, Ala231, Ile235）所限定的口袋内的范德华相互作用。尽管这种结合是可逆的，但其紧密结合和非常缓慢的解离速率有助于其功效。
尽管具有潜在的酶抑制活性，但据报道三氯生存在系统性治疗使用的局限性。例如，据报道三氯生水溶性低，ClogP值高，生物利用度低。另一方面，有报道称其具有毒性，会损害肌肉收缩力。由于这些限制，三氯生已被用作设计新化合物的骨架，旨在改善其ADMET特性。对三氯生A环和B环的修饰可以通过增加药物渗透性来优化ADMET特性。为了减轻不良反应和低溶解度，一种策略是将三氯生掺入脂质体纳米颗粒的脂双层中。该制剂提高了其疗效，允许以更低剂量使用，并减少了不良生化效应。三氯生因其对必需酶TgENR的强效抑制而成为抗弓形虫病药物研究的重要起点，尽管其不良的理化性质促使了对类似物的研究。
6.2. 三氯生衍生的抑制剂
基于三氯生骨架的抑制剂已被开发出来。对TgENR的抑制基于与酶和氧化形式辅因子形成缓慢、紧密结合的三元复合物。所有强效类似物都共享相同的作用机制，专门结合到TgENR/NAD+复合物上。
6.3. B环取代类似物（4'位）
这些类似物专注于修饰B环的4'位，以改善ADMET特性并增强底物进入。
6.4. 三唑类似物
包括多种具有不同4'位取代基的化合物，它们显示出不同的酶抑制活性、抗寄生虫活性和理化特性。例如，化合物16c的IC50= 26 nM，活性与三氯生相似，且其理化性质在ClogP、水溶性和Caco-2细胞渗透性方面表现良好。然而，其体内功效在10 mg/kg剂量下未减少寄生虫载量，但在75 mg/kg剂量下保护了小鼠。而化合物16a的IC50为43 nM，但ADMET性质不如化合物16c有利。化合物16b的活性较低，MIC50= 1 μM。化合物41a被认为可能与TgENR以外的靶点相互作用。化合物41b具有高酶活性，IC50为31 nM。化合物37a和37c也报告了相关的酶抑制活性。化合物24a和24b对酶的活性位点具有良好的亲和力。
6.5. A环取代类似物（5位）
基于TgENR与细菌和植物同源物之间的结构差异，A环5位的修饰被设计出来。例如，化合物33显示出非常高的酶活性，IC50= 19 nM。而三唑类似物9a, 9b, 9c的结合机制与三氯生不同，其抗寄生虫活性缺乏归因于预测的低溶解度和对顶质体的受限进入。化合物39b的寄生活性可能是与其他靶点相互作用的结果。
6.6. B环取代或完全替换的类似物
这些类似物主要是为了通过利用从三氯生结合位点到外部溶剂的通道来改善溶解度。化合物5c改善了溶解度，酶抑制活性在1 μM时为81%，对宿主细胞毒性低。化合物14b具有良好的溶解度，在1 μM时酶抑制率为72%。化合物18表现出最佳的溶解度之一，在1 μM时酶抑制率为73%。
6.7. 强效抑制剂
使用热位移分析来区分低纳摩尔范围内IC50的强效抑制剂的亲和力，这些抑制剂无法用标准酶活性测定区分。所有测试的化合物都与三氯生共享相同的作用机制。在6 mM高NAD+浓度下，有六种化合物显示出低飞摩尔范围的Kd值，表明其亲和力与三氯生相似或更高。其中四种化合物（5, 9, 10, 15）抑制刚地弓形虫寄生虫生长的效力等于或大于三氯生。
6.8. 无活性类似物
三氯生2'位修饰的类似物由于可能与NAD+辅因子或结合位点发生空间位阻，未显示出显著的TgENR酶抑制活性。酮类类似物43a, 43b仅显示出微弱的酶抑制活性，对寄生虫的完整细胞生长抑制无效。酰胺类似物30a-d在生物学测定中未显示出显著活性。尽管类似物的设计旨在改善ADMET特性，但仍存在若干缺陷，例如体外模型中酶活性和抗寄生虫活性之间缺乏相关性。许多类似物显示出很高的酶活性，但抗寄生虫活性却很低甚至没有。抗寄生虫活性的缺乏归因于其预测的低溶解度和对寄生虫顶质体的受限进入。在体内测试的有希望的类似物显示出有限的疗效，其体内低效力的原因与高肝代谢率和半衰期短有关。
6.9. 硫乳霉素（Thiolactomycin, TLM）
硫乳霉素具有独特的γ-硫代内酯环，被认为是一种作用于细菌II型脂肪酸合成的有前景的抗生素候选物。它通过靶向FASII途径中的α-酮脂酰-ACP合酶来发挥作用。TLM类似物的研究旨在优化其药理性质。已有八种新的TLM类似物在体外针对刚地弓形虫RH株进行了评估。平均IC50值范围为1.6至29.4 μM，但特定类似物（化合物5）的IC50低于1 μM，显示出更高的效力。TLM类似物影响酰基甘油的合成，这与FASII途径的抑制一致。透射电子显微镜观察显示，TLM类似物干扰细胞分裂和膜细胞器，这与它们的作用机制直接相关。当顶质体中的脂肪酸合成被抑制时，膜结构会发生改变，最终导致寄生虫死亡。
6.10. FabD抑制剂
在刚地弓形虫中，FASII途径的组分已被视为潜在药物靶点，但丙二酰辅酶A:ACP转酰基酶（FabD）尚未被探索为药物靶点。因此，研究人员利用基于虚拟筛选和偏最小二乘模型的计算方法，来识别可能靶向FabD酶的化合物。研究结果显示，几种化合物对TgFabD的结合亲和力高于其天然底物丙二酰硫酯泛酸盐。大多数化合物是天然产物的衍生物。PLS模型将咪唑类化合物确定为与刚地弓形虫TgFabD酶特异性相关并增加结合亲和力的主要化学骨架。在该分析中，几种已批准用于人类的化合物表现出对TgFabD的高亲和力，包括替比夫定、2-乙基-1,3-己二醇等。所提到的化合物具有一些结构差异，这解释了它们与TgFabD形成非共价相互作用的能力，这根据分子建模研究证明了它们作为抑制剂的潜力。报告中提到的硅学结果显示了基于占据和阻断TgFabD催化相互作用空间的抑制机制。
6.11. 水杨酰苯胺类（Salicylanilides）
水杨酰苯胺类已被确定为抗刚地弓形虫的有前景的抑制剂类别。这些化合物在体外和体内均显示出显著的抗寄生虫活性。研究指出，一些水杨酰苯胺衍生物在低纳摩尔浓度下显示出体外活性，对不同的寄生虫株系具有高效力和功效。化合物3i, 3j, 7a, 14a, 14b在抗刚地弓形虫速殖子方面表现突出。化合物14a和14b也在小鼠急性感染模型中进行了体内评估，口服给药可减少寄生虫载量并提高感染小鼠的存活率。水杨酰苯胺类的确切作用机制尚未完全确定，但已提出这些化合物可能作为FASII途径的烯脂酰-ACP还原酶抑制剂。
6.12. 苯并咪唑类（Benzimidazole）
目前对刚地弓形虫烯脂酰-ACP还原酶（ENR）的研究已确定了两类主要抑制剂：经典的依赖于NAD+的ENR抑制剂，以及最近发现的基于苯并咪唑衍生物、作用于与NADH结合的ENR酶的抑制剂家族。经典抑制剂如异烟肼、二氮杂硼烷和三氯生主要作为历史参考。另一方面，基于苯并咪唑的抑制剂构成了一个较新的、令人感兴趣的化合物家族。在刚地弓形虫中，评估了三种苯并咪唑衍生物。然而，实验结果显示，即使在1 μM浓度下，这些化合物对TgENR的酶抑制也很低甚至没有，尽管它们在细胞培养中表现出良好的抗寄生虫活性。这种低酶效力与高细胞功效之间的差异表明存在脱靶效应，即不直接与ENR抑制相关的替代作用机制。在PubChem数据库中对可能替代靶点的搜索显示，苯并咪唑样结构骨架可与多种蛋白质相互作用，但在顶复门寄生虫中，导致观察到的抗寄生虫活性的具体分子靶点尚未确定。苯并咪唑化合物显示出有前景的体外活性，对I型和II型刚地弓形虫株的MIC50值在1到10 μM之间。此外，这些化合物在高达10 μM浓度下对人成纤维细胞表现出低细胞毒性，表明其治疗窗较宽。尽管目前数据支持苯并咪唑抑制剂的体外功效，但尚无体内研究报道确认其活性或确定其确切分子靶点。
7. 治疗前景
FASII途径抑制剂的开发仍然是抗顶复门寄生虫的关键治疗策略。从历史上看，无论是通过基因手段还是药物手段破坏FASII，都被证明在体外和体内对寄生虫的生存和致病力至关重要。主要进展集中在优化三氯生及其类似物上。此外，FASII途径中的其他替代酶，如丙二酰辅酶A-ACP转酰基酶（FabD）和β-羟脂酰-ACP脱水酶（FabZ）也已被探索。最近的一项实验研究显示，通过基因编辑敲除刚地弓形虫中的FabZ会导致体外生长显著减少、顶质体部分丢失以及在小鼠模型中毒力降低，证实了FabZ对寄生虫生存至关重要。尽管刚地弓形虫可以从宿主获取和重塑脂质，但这些补偿机制不足以满足其在细胞内复制期间的高脂质需求。刚地弓形虫通过转运蛋白以及宿主内质网与纳虫空泡之间的接触区，从宿主细胞膜中摄取脂肪酸、磷脂和胆固醇。它还具有延伸和去饱和其外源脂质以适应自身需求的能力。然而，这些补救途径只是补充，不能替代由FASII途径介导的从头合成。据报道，该途径对维持寄生虫的毒力至关重要，因此开发FASII抑制剂需要具有能够穿越血脑屏障等生物屏障的药代动力学特性的化合物，以更好地到达顶质体。脂质体纳米颗粒制剂已被证明可以通过降低所需剂量和最小化毒性来提高疗效，代表着一种有前景的针对刚地弓形虫的靶向治疗方法。
8. 结论
所分析的证据强调，位于顶质体的FASII途径是抗弓形虫病最有前景和选择性的治疗靶点之一，因为它不存在于哺乳动物细胞中，并且有潜力提供比传统治疗更高的特异性。在此背景下，识别该途径内的新靶点，结合使用计算工具进行合理的药物设计，已显著拓宽了治疗前景。因此，未来的研究应侧重于开发结合高分子特异性和合适药理学特性的化合物，以确保其生物利用度以及对中枢神经系统等组织的可及性。
