《Microorganisms》：Anaerococcoides asporogena gen. nov., sp. nov., a Strictly Anaerobic Bacterium, Isolated from the Dehydrated Sludge of a Steel Factory’s Wastewater Treatment Plant
Wanling Qiu,
Yen-Chi Wu,
Fuying Li,
Yin Li,
Jingjing Zhao,
Shu-Jung Lai,
Wangchuan Xiao,
Chih-Hung Wu,
Guowen Dong and
Lintao Wu
+ 5 authors
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通过一种培养依赖的方法，研究人员对从一家钢厂的废水处理厂收集的脱水污泥进行了微生物群落研究。分离到一株菌株，命名为QWL-01T。该菌株为严格厌氧、革兰氏染色阴性、不运动、不形成孢子的球菌，细胞直径为0.6–0.9 μm。菌株QWL-01T在4–40 °C（最
通过一种培养依赖的方法，研究人员对从一家钢厂的废水处理厂收集的脱水污泥进行了微生物群落研究。分离到一株菌株，命名为QWL-01T。该菌株为严格厌氧、革兰氏染色阴性、不运动、不形成孢子的球菌，细胞直径为0.6–0.9 μm。菌株QWL-01T在4–40 °C（最适28–35 °C）、pH 5.5–8.0（最适pH 7.1）以及0–3% NaCl（最适0.5%）的范围内生长。对Biolog AN板的分析表明，其对碳源的阳性利用仅限于异麦芽酮糖、α-酮戊酸和丙酮酸。主要脂肪酸为iso-C13:0(17.0%)、C16:0二甲缩醛 (12.0%) 和 anteiso-C13:0(9.2%)。通过BLASTN进行的16S核糖体核糖核酸（16S rRNA）基因序列分析表明，该新菌株的最接近的系统发育邻居是 Youngiibacter multivorans DSM 6139T(93.82%) 和 Proteiniclasticum ruminis JCM 14817T(93.75%)。菌株QWL-01T的基因组大小为3.69 Mbp (百万碱基对)，G+C含量为50.8 mol% (摩尔百分比)。将菌株QWL-01T与Proteiniclasticum属和Youngiibacter属的近缘物种进行比较，其数字DNA-DNA杂交（dDDH）、平均核苷酸一致性（ANI）和平均氨基酸一致性（AAI）值范围分别为26.60%至36.80%、65.89%至68.30%以及49.27%至51.58%。基于表型、生理、系统发育和基因组相关性证据，菌株QWL-01T代表了梭菌科（Clostridiaceae）中的一个新属，因此提议命名为厌氧类球菌（Anaerococcoides asporogena）新属新种。菌株QWL-01T(=BCRC 81396T= CICC 25258T= NBRC 117088T) 是所提议新种的模式菌株。
论文解读：厌氧类球菌（Anaerococcoides asporogena）新属新种的发现与多相分类学鉴定
一、 研究背景、现存问题与研究意义
废水处理厂产生的污水污泥蕴含复杂多样的微生物群落，在有机物降解和污染物去除中扮演关键角色。然而，大量微生物由于培养困难而未得到表征，常被称为“微生物暗物质”（Microbial Dark Matter），其代谢潜能和生态功能尚不清楚，制约了对污水生态系统功能的理解。传统的培养方法存在局限性，而元基因组学与单细胞测序等新技术也未能完全揭示污泥中的微生物多样性。针对此问题，研究人员开发了小型化培养组学（culturomics）策略，通过多种厌氧培养基、延长富集和纯化技术，成功从复杂微生物组中恢复了大量此前被忽略的厌氧菌，证明了该方法挖掘“微生物暗物质”的有效性。现代原核生物分类学采用多相分类框架，整合16S rRNA基因系统发育、基因组相关性指数（如dDDH、ANI、AAI）、表型和化学分类学证据，以更准确地界定种、属。
为了探索污水处理系统中的未知微生物资源，本项研究将上述小型化培养组学策略应用于从三明钢铁有限公司废水处理厂收集的脱水污泥样本。从样本中分离到一株菌株QWL-01T，其初步16S rRNA基因分析显示与已发表物种相似度低，表明其可能代表一个来自工程化污泥环境的新厌氧谱系。为了明确其分类学地位，并评估其生态和生物技术潜能，研究人员对其进行了全面的形态、生理、化学分类、系统发育和基因组学分析。本研究最终在梭菌科内确立了一个新属新种，论文发表在期刊《Microorganisms》上。
二、 主要关键技术与方法
研究人员采用了一种整合了多种培养、分离、鉴定与分析技术的多相分类学框架。样本来源为来自中国福建三明钢铁公司废水处理厂的脱水污泥。关键研究方法包括：
- 1.
菌株分离与纯化：在厌氧条件下，将污泥样本接种于改良的DSM 120培养基，通过多轮系列稀释和滚管技术对厌氧菌株进行分离纯化。
- 2.
形态与生理化学分析：利用相差显微镜、透射电镜和扫描电镜观察细胞形态；进行革兰氏染色、3% KOH测试、孔雀绿芽孢染色以确定细胞壁特性和芽孢形成能力；利用Biolog AN MicroPlate进行碳源利用测试；通过气相色谱分析细胞脂肪酸甲酯成分。
- 3.
系统发育与基因组学分析：对菌株的16S rRNA基因进行测序，通过BLASTN和MEGA X软件与相关类群进行相似性比对，并构建最大似然法、邻接法和最小进化法等系统发育树。对菌株进行全基因组测序，基于基因组序列计算数字DNA-DNA杂交、平均核苷酸一致性和平均氨基酸一致性，并通过Type Strain Genome Server构建基于全基因组的系统发育树，以评估与近缘属种的基因组相关性。
三、 研究结果
1. 菌株QWL-01T的分离
菌株QWL-01T通过滚管技术从脱水污泥中成功分离和纯化，并保藏于多个保藏中心。
2. 菌株QWL-01T的形态学
细胞为球形（cocci），直径0.6–0.9 μm，观察到了细胞分裂现象。细胞不运动，革兰氏染色阴性，但3% KOH测试不裂解，且基因组分析未发现典型的脂多糖或外膜合成基因，表明其具有单层膜的革兰氏阳性型细胞被膜，染色结果与系统发育位置不矛盾。细胞不形成芽孢。
3. 菌株QWL-01T的生理学与化学分类学
菌株QWL-01T严格厌氧，不能在固体培养基上有氧生长，但在形成氧梯度的巯基乙酸盐液体培养基中可在有氧层下方生长，表明其对低氧条件有一定耐受性。菌株生长需酵母提取物或胰蛋白胨，但不能同时在两者缺失的培养基中生长。生长条件范围：温度4–40 °C（最适28–35 °C），NaCl浓度0–3% (w/v)（最适0.5%），pH 5.5–8.0（最适pH 7.1），为嗜中温、嗜中性细菌。Biolog AN板测试显示仅能利用异麦芽酮糖、α-酮戊酸和丙酮酸。主要脂肪酸为iso-C13:0(17.0%)、C16:0二甲缩醛 (12.0%) 和 anteiso-C13:0(9.2%)，其成分与近缘属种有显著差异。
4. 菌株QWL-01T与相关类群的16S rRNA基因系统发育
16S rRNA基因相似性分析显示，菌株QWL-01T与Youngiibacter multivorans DSM 6139T和 Proteiniclasticum ruminis JCM 14817T的相似性最高，分别为93.82%和93.75%，与Proteiniclasticum属和Youngiibacter属内各物种的相似性在92.34%–93.48%之间。系统发育树分析显示，菌株QWL-01T形成了一个独立于Proteiniclasticum和Youngiibacter两个属分支的独特谱系，表明其可能代表梭菌科中的一个新属。
5. 基因组相关性分析
菌株QWL-01T的基因组大小为3.69 Mbp，G+C含量为50.81 mol%，与近缘属种（Youngiibacter: 44.84–46.57%；Proteiniclasticum: 43.07–51.35%）存在显著差异。基因组比较分析显示，菌株QWL-01T与Youngiibacter和Proteiniclasticum属内物种的dDDH、ANI和AAI值范围分别为26.60–36.80%、65.89–68.30%和49.27–51.58%。这些值远低于物种界定的阈值（dDDH 70%， ANI 95–96%）和通常认为的属级参考范围（AAI 60–80%），结合TYGS全基因组系统发育树的结果，支持菌株QWL-01T代表一个新属，而非已知属内的新种。
四、 讨论总结
1. 革兰氏反应与细胞被膜结构：虽然实验结果显示革兰氏染色阴性，但结合基因组分析（缺乏典型脂多糖/外膜生物合成基因，存在分选酶和LPXTG基序蛋白），研究人员认为其表型源于革兰氏染色方法的局限性，其本质是单层膜的革兰氏阳性型细胞被膜结构，这与近缘属的报告一致。
2. 芽孢形成：显微观察和基因组分析均未发现芽孢或相关基因，确认菌株为非产孢菌。
3. 氧耐受性与基因组基础：基因组中鉴定出超氧化物歧化酶、红素氧还蛋白、过氧化物酶等氧化应激相关基因，解释了其在巯基乙酸盐培养基中有氧层下方生长的低氧耐受性。
4. 预测的发酵代谢与生态作用：基因组注释表明，菌株QWL-01T具有典型的厌氧发酵代谢途径，核心糖酵解酶、丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶，以及下游的乙酸、丁酸、乳酸和氢代谢相关基因的存在，表明其可能将可溶性有机物转化为短链脂肪酸、氢等。其基因组还编码多种蛋白酶、肽/氨基酸转运系统和氨基酸发酵相关酶，暗示其能以污泥中的蛋白质降解产物为食。这些特征表明，QWL-01T可能在污泥厌氧生态系统中作为次级发酵菌，参与碳循环。
5. 预测的解毒与污染物转化潜力：基因组中存在多种解毒和应激反应系统，包括预测的砷酸盐、铬酸盐解毒模块、重金属转运ATP酶、硝基还原酶、芳香环羟基化双加氧酶等，暗示其对工业污泥中的重金属和有机物污染环境具有适应潜力，但具体功能需实验验证。
6. 支持属级区分的表型与化学分类学证据：与糖酵解能力较强的Youngiibacter和蛋白质分解为主的Proteiniclasticum不同，菌株QWL-01T的碳源利用谱较窄。稳定的球菌形态、独特的生理特征以及以iso-C13:0、C16:0二甲缩醛和anteiso-C13:0为主的脂肪酸组成，进一步在表型和化学分类学上支持其作为一个独立的新属。
7. 在当前梭菌科分类学中的定位：结合16S rRNA基因低相似性、全基因组系统发育的独立位置、低于属级阈值的基因组相关性指数（AAI, dDDH, ANI），以及清晰的表型和化学分类学差异，研究符合当前以基因组为基础的多相分类学趋势，支持将菌株QWL-01T归类为梭菌科下的一个新属。
五、 研究结论（翻译）
基于表型、生理、系统发育和基因组相关性证据，菌株QWL-01T代表了梭菌科中的一个新属，为此提议命名为厌氧类球菌（Anaerococcoides asporogena）新属新种。
厌氧类球菌（Anaerococcoides）新属的描述
厌氧类球菌（An.ae.ro.coc’co.i.des. Gr. pref. an-, 不； Gr. n. aer, 空气； N.L. masc. n. coccus, 球菌； Gr. suff. -oides, 类似； N.L. neut. n. Anaerococcoides, 一种类似球菌的严格厌氧菌）。细胞为严格厌氧、不运动、不产孢的球菌。化能有机营养且发酵代谢。主要细胞脂肪酸为iso-C13:0、C16:0二甲缩醛和anteiso-C13:0。基因组DNA G+C含量约为50–51 mol%。在系统发育上归属于梭菌科。模式种是厌氧类球菌不产孢种（Anaerococcoides asporogena）。
厌氧类球菌不产孢种（Anaerococcoides asporogena）新种的描述
厌氧类球菌不产孢种（a.spo.ro’ge.na. Gr. pref. a-, 不； Gr. n. spora, 种子，孢子； N.L. neut. adj. asporogena, 不形成孢子的）。细胞为严格厌氧、不运动、革兰氏染色阴性、不形成孢子的球菌，直径0.6–0.9 μm。在改良DSM 120培养基中，于pH 5.5–8.0（最适pH 7.1）、温度4至40 °C（最适28–35 °C）以及0–3% (w/v) NaCl（最适0.5%）存在条件下生长。通过全基因组测序确定其基因组DNA G+C含量为50.81 mol%。该菌种分离自中国福建省三明钢铁有限公司废水处理厂收集的污水污泥。模式菌株是QWL-01T(= BCRC 81396T= CICC 25258T= NBRC 117088T)。
除其分类学上的新颖性外，表型和基于基因组的证据表明，该菌株是一种严格厌氧发酵细菌，可能有助于污泥生态系统中可溶性有机物的周转。与氧化应激反应、解毒和推测的污染物转化相关的基因的存在，进一步表明其对工业污泥环境的潜在适应性。这些特征表明，菌株QWL-01T不仅与厌氧污泥群落的生态学相关，而且可能作为研究厌氧代谢、污染物耐受性和生物技术的微生物资源。然而，这些假定的功能作用仍有待实验验证。
