金山岭长城麒麟影壁与文字砖墙微生物群落分析与微生物防治研究

《Microorganisms》：Analysis of Microbial Communities and Microbial Preservation of the Qilin Screen Wall and Text Brick Wall in the Jinshanling Great Wall Zhiqian Guan, Yu Wang, Yibo Geng, Yuanyuan Wang, Lilong Hou, Xingling Tian and Jiao Pan

　　

摘要 金山岭长城是明长城的重要组成部分，也是中国最重要的物质文化遗产。目前，由于露天砖石建筑的生物风化现象普遍，其正面临着微生物退化的严重威胁。本研究聚焦于金山岭长城的麒麟影壁与文字砖墙，利用扫描电子显微镜（SEM）和宏条形码（metabarcoding）分析，揭示了砖石表面共存的多种微生物群落，包括各种地衣、霉菌和细菌。研究人员成功分离了十二株真菌菌株。抗微生物实验结果表明，0.6%的异噻唑啉酮类抗微生物剂BC01、50 mg/mL的香芹酚和50 mg/mL的百里香酚对这些菌株表现出一定程度的抗微生物活性。总体而言，本研究通过深入分析微生物群落结构和筛选高效抗微生物剂，为砖石长城的微生物防治奠定了坚实的基础。

一、 研究背景与意义

明长城是中国长城遗址的杰出代表，金山岭长城作为其重要组成部分，具有深厚的历史与考古价值。其上的麒麟影壁与文字砖墙是罕见的明代艺术与历史信息载体。然而，这些露天砖石结构长期暴露于自然环境中，面临着严重的风化问题，其中生物降解（尤其是微生物的生长与代谢活动）已成为一个不可忽视的重要因素。微生物（如细菌、真菌、藻类和地衣）在文物表面定殖，可能通过形成生物膜、分泌有机酸、产生生物机械力以及诱导次生矿化等方式，对文物造成美学、物理和化学上的损害，即“生物劣化”。尽管生物膜也可能通过调节水热变化等方式对石材产生一定的“生物保护”作用，但为了控制微生物引起的降解，通常需要采取干预措施。因此，深入解析金山岭长城特定遗迹表面的微生物群落构成，并筛选有效的防治手段，对于这类露天不可移动砖石古建筑的长期保存具有紧迫的科学意义和实际价值。本研究成果发表于学术期刊《Microorganisms》。

二、 主要技术方法概述

本研究于2023年9月在金山岭长城1号与2号敌楼间的文字砖墙及2号敌楼上的麒麟影壁进行现场调查与样本采集，共获取7份微生物样本（C1-C5来自麒麟影壁，C6-C7来自文字砖墙）。研究主要采用了以下关键技术：1. 利用扫描电子显微镜（SEM）对样本进行形态学观察，以直观确认微生物的存在与结构特征。2. 采用高通量测序技术，针对原核微生物的16S rRNA V4区和真核微生物的18S rRNA V4区进行扩增子测序，并结合生物信息学分析（包括扩增子序列变异体（ASV）去噪、物种注释、Alpha与Beta多样性分析、关联网络分析等），系统解析了微生物群落的组成、结构与多样性。3. 通过传统培养方法，从样本中分离、纯化并鉴定了可培养的真菌。4. 采用滤纸片法和悬浮定量杀菌试验，评估了包括异噻唑啉酮衍生物（K100, BC01）、植物源化合物（香芹酚、香叶醇、百里香酚）以及纳米金属氧化物（纳米ZnO, 纳米TiO₂）在内的多种抗微生物剂对分离真菌的抑制效果。

三、 研究结果

3.1. 麒麟影壁与文字砖墙表面样品的SEM结果

SEM观察证实了所有样本中均存在微生物结构，如直径数微米的丝状真菌菌丝，以及直径约0.2 μm的疑似放线菌菌丝。部分样本（如C4, C7）显示出高度多孔、三维互联的“海绵状”网络结构，表明微生物群落形成了复杂的生物膜基质。样本中未观察到清晰孢子，这可能与砖石表面营养匮乏有关。这些可见的微生物菌落是多物种复杂协同作用的结果。

3.2. 可培养真菌的分离、培养与鉴定

从7份样本中共分离、纯化出12株可培养真菌，经鉴定分属于枝孢菌属（Cladosporium）、曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、木霉属（Trichoderma）及链格孢属（Alternaria）等已知在石质文物降解中常见的属。

3.3. 微生物群落分析

3.3.1. 物种可视化

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  真核微生物：在门水平上，子囊菌门（Ascomycota）和未鉴定的叶绿体生物（unidentified_Chloroplastida）是所有样本中的优势类群。在纲、目、科水平上，茶渍纲（Lecanoromycetes）、瓶口衣目（Verrucariales）、茶渍目（Lecanorales）、瓶口衣科（Verrucariaceae）和网衣科（Ramalinaceae）等地衣真菌类群占主导，结合采样形态，表明砖石表面具有明确宏观形态的定殖微生物主要为地衣。此外，在部分样本中还检测到相对丰富的轮虫（Rotifera）和节肢动物（Arthropoda）。
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  原核微生物：在门水平上，变形菌门（Proteobacteria，现称Pseudomonadota）、放线菌门（Actinobacteriota，现称Actinomycetota）和绿弯菌门（Chloroflexi，现称Chloroflexota）是优势类群。在属水平上，红细菌属（Rubrobacter）、甲基杆菌属-甲基红杆菌属（Methylobacterium-Methylorubrum）、土地球菌属（Tundrisphaera）和异常球菌属（Deinococcus）等在多个样本中丰度较高。
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  韦恩图分析：麒麟影壁样本（C1-C5）各自含有大量独特的特征序列，共同特征序列比例极低，表明其微生物群落具有较高的空间异质性。

3.3.2. Alpha和Beta多样性

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  Alpha多样性：样本C2、C3和C4在物种丰富度（Chao1指数）、均匀度（Pielou_e指数）和整体多样性（Shannon指数）上均显著高于其他样本。样本C5的真核物种丰富度最低，但其原核物种多样性与C4相当。
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  Beta多样性：基于加权UniFrac距离的主坐标分析（PCoA）和非度量多维尺度分析（NMDS）显示，来自水平面的样本C2、C4和C7（C2、C4来自麒麟影壁，C7来自文字砖墙）在真核和原核类群上均表现出较高的相似性。而来自垂直面的样本C6在两类群中均相对孤立，其微生物形态（球形）也最为独特。

3.4. 关联分析

真核微生物关联网络分析显示，亚隔孢壳属（Didymella）和卷柏属（Selaginella）分别与其他六个属存在相关性。原核微生物关联网络中，绝大多数属呈正相关，而假单胞菌属（Pseudomonas）和短小杆菌属（Curtobacterium）与所有其他属呈负相关。

3.5. 抗微生物实验

3.5.1. 化学抗微生物剂

0.6%的抗微生物剂BC01对六株测试真菌中的四株表现出良好的体外抑制活性，其效果优于同浓度的K100。在三种植物源化合物中，百里香酚的抑制效果最佳，对所有测试菌株均有效；香芹酚次之；香叶醇仅对哥伦比亚枝孢菌（Cladosporium colombiae）有效。哥伦比亚枝孢菌和细极链格孢（Alternaria tenuissima）几乎可被所有测试的抗微生物剂有效抑制。

3.5.2. 纳米金属氧化物

纳米ZnO对除寄生曲霉（Aspergillus parasiticus）外的其余五株真菌的孢子萌发有显著抑制作用。纳米TiO₂则未显示出抑制效果。

四、 讨论与结论

讨论部分总结：

研究人员对金山岭长城麒麟影壁与文字砖墙的微生物群落进行了深入分析。SEM和高通量测序结果共同证实了以地衣为主的复杂微生物群落的存在。子囊菌门和未鉴定的叶绿体生物是优势真核类群，这与许多石质文物微生物研究结果一致，地衣中的真菌组分（如茶渍纲、瓶口衣目）和光合共生体是主要构成。原核群落则以变形菌门、放线菌门等为主。分离的可培养真菌（如枝孢菌属、曲霉属、青霉属）是已知的石材潜在降解者。Alpha和Beta多样性分析揭示了样本间微生物群落的差异性与相似性，其可能与采样位置（水平/垂直）及特定的地衣物种存在一定关联，但受样本量所限，尚需进一步研究确认。

在抗微生物剂筛选中，0.6%的BC01、50 mg/mL的香芹酚和百里香酚显示出较好的应用潜力。纳米ZnO也表现出一定的抑制效果，但其对石材吸水性的长期影响需谨慎评估。研究人员指出，后续研究需重点考察这些抗微生物剂与加固材料结合后对石材物理性能、色泽的影响，评估其对文物美学与历史价值的影响，并探索最佳施用方法以确保长期保护效果与安全性。

研究结论翻译：

本研究调查了河北省承德市金山岭长城的麒麟影壁和文字砖墙，鉴定出包括地衣、霉菌和细菌在内的多种微生物。分离了十二种真菌物种。抗微生物实验表明，0.6%的异噻唑啉酮化合物BC01，以及50 mg/mL的香芹酚和百里香酚，均表现出一定程度的抗微生物效力。这项研究为砖石古建筑防治微生物降解提供了依据。